Name: Intratibiale osteosarcoomcelinjectie om orthotopisch osteosarcoom en longmetastase muismodellen te genereren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 25 s
Description: Leer intratibiale injectie van osteosarcoomcellen om orthotopische muismodellen met primaire tumoren en longmetastasen te genereren. Deze methode bootst klinische osteosarcoomontwikkeling nauwkeurig na.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door subsidies van (1) National Key R & D Program of China (2018YFC1704300 en 2020YFE0201600), (2) National Nature Science Foundation (81973877 en 82174408).

Alle dierproeven werden goedgekeurd door de dierenwelzijnscommissie van de Shanghai University of Traditional Chinese Medicine. Vier weken oude mannelijke BALB / c athymische muizen werden geacclimatiseerd gedurende een week vóór de operatie voor orthotopische injectie van osteosarcoomcellen. Muizen werden gehuisvest in individueel geventileerde muizenkooien met vijf muizen per kooi in een licht/ donkercyclus van 12 uur met ad libitum toegang tot SPF-voer en steriel water.
1. Bereiding van cellen
<ol><li>Op de dag van osteosarcoomcel (143B-Luciferase) injectie, was 80% -90% confluent cellen gekweekt in een 10 cm celkweekschaal tweemaal met PBS (pH 7,4) en trypsinize met 1,5 ml van 0,25% trypsine gedurende 3 minuten. Voeg vervolgens 6 ml 10% serumbevattende MEM-media toe om het trypsine te doven en verzamel de cellen in een centrifugebuis van 15 ml. OPMERKING: 143B-Luciferase cellijn wordt verkregen uit 143B cellijntransfect met pLV-luciferase vector23.</li>
	<li>Zuig 20 μL celsuspensie op in de kamer van de celtelplaat en bereken de celconcentratie met behulp van een automatische celteller (zie Materialentabel).</li>
	<li>Centrifugeer de cellen bij 800 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Zuig het supernatant op met een pipet en resuspend de celkorrel in een keldermembraanmatrix van 8,5 mg/ml (zie materiaaltabel) tot een eindconcentratie van 2 x 107 cellen/ml.</li>
	<li>Houd de cellen op ijs, breng ze naar de operatiekamer. De cellen moeten binnen 2 uur worden gebruikt. OPMERKING: Om onnauwkeurige injectiedoses te voorkomen (bijvoorbeeld vanwege de dode ruimte in spuiten), wordt een extra celsuspensie bereid (meestal twee keer het vereiste volume celsuspensie). De keldermembraanmatrix wordt de hele tijd op ijs gehouden omdat deze een coagulatie-eigenschap heeft boven kamertemperatuur24.</li>
</ol>2. Chirurgie voor orthotopische injectie van de osteosarcoomcellen
OPMERKING: De chirurgische hulpmiddelen zijn weergegeven in figuur 1.
<ol><li>Muizen werden grootgebracht in specifieke pathogeenvrije omstandigheden. Alle procedures werden uitgevoerd in een aseptische kast met steriel gereedschap.</li>
	<li>Verdoof de muizen door ze bloot te stellen aan 2% isofluraan en 98% zuurstof (zuurstofstroomsnelheid, 2 l / min).</li>
	<li>Breng een kleine hoeveelheid oogheelkundige zalf aan op de ogen om uitdroging onder narcose te voorkomen. OPMERKING: Voer de hele procedure uit in een goed geventileerde ruimte. Vóór osteosarcoomcelinjectie, zorg ervoor dat elke muis onder diepe anesthesie is door een teenknelpunt; als de muis nog steeds reacties heeft, zoals trillen of schokken, wacht dan lang totdat de bovenstaande reacties verdwijnen.</li>
	<li>Houd elke muis in rugligging. Houd de enkel van de muis vast met de duim en wijsvinger en desinfecteer de injectieplaats van het scheenbeen met een 70% ethanol wattenstaafje. OPMERKING: Om de enkel van de muis stevig vast te houden, zijn zowel de duim als de wijsvingers van groot belang voor de daaropvolgende procedures.</li>
	<li>Draai het enkelgewricht van elke muis naar buiten om het scheenbeen en kuitbeen te bewegen en buig het kniegewricht naar een geschikte positie totdat het proximale tibiaplateau (de bovenkant van het scheenbeen) duidelijk zichtbaar is door de huid (figuur 2A).</li>
	<li>Bevestig de naald aan een spuit van 1 ml en richt de punt van de naald in de richting van de injectieplaats. Zorg ervoor dat de naald van de spuit evenwijdig is aan de lange as van het scheenbeen.<ol>
<li>Breng de naald percutaan door of naast de patellapees in terwijl deze door de huid / gewrichtskapsel gaat; draai de spuit (1/2 tot 3/4-cirkel) om een gat door het tibiaplatform te boren naar het distale uiteinde van het scheenbeen (medullaire holte) voor osteosarcoomcelinjectie met een spuit met microvolume (figuur 2B, C). OPMERKING: Gelijktijdige rotatie van het scheenbeen kan worden gevoeld tijdens het boren als de naaldpunt nauwkeurig is. Zorg ervoor dat de needling naar voren beweegt met de rotatie van de spuit in plaats van direct naar voren te worden geduwd totdat ongeveer de helft van de naald zich in het scheenbeen bevindt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Controleer of de naald van de spuit een prominente beweging in het medullaire kanaal heeft gemaakt om succesvol te boren. OPMERKING: Voer een röntgenonderzoek uit (zie Materiaaltabel) om de juiste positie van de naald te bevestigen en de beelden te verzamelen.</li>
	<li>Laad 143B osteosarcoomcelsuspensie (vanaf stap 1.5) in een microvolumespuit en vervang de spuit van 1 ml in het scheenbeen door de 143B celbelaste microvolumespuit (figuur 2D). Injecteer langzaam ~ 10 μL (negeer reeds bestaande oplossing in de naald) van 143B celsuspensie in het scheenbeen van elke athymische muis (ongeveer 2 x 105 cellen) zonder hoge druk uit te oefenen.</li>
	<li>Druk met een wattenstaafje gedurende 20-30 s op de injectieplaats wanneer de spuit met microvolume wordt verwijderd.</li>
	<li>Plaats elke muis terug in een schone kooi en houd nauwlettend in de gaten totdat de muis volledig is hersteld van de anesthesie (ongeveer 10 minuten).</li>
	<li>Monitor de tumorgroei in vivo met behulp van een röntgenbeeldvormingssysteem. Meet wekelijks de langere diameter (a) en de korte diameter (b) van de kankermassa met een remklauw voor tumorvolume (V) berekening: V = 1/2 x a x b2. OPMERKING: Verdoof de muizen door ze bloot te stellen aan 2% isofluraan en 98% zuurstof. De muizen werden verdoofd voor röntgenfoto's. Intratibia-injectie van luciferase of fluorescerend eiwit gelabelde osteosarcoomcellen maakt het mogelijk om primaire en gemetastaseerde osteosarcoomlaesies te volgen. OPMERKING: Humane eindpunten van de muizen met osteosarcoom als gevolg van tumorgroei van de knie en longmetastase waren gebaseerd op de volgende criteria: (1) Body Condition Score, (2) gewichtsverliesdrempel van 20%, (3) gemiddelde maximale diameter van tumoren van 2 cm, of (4) ernstig beperkt diergedrag.</li>
</ol>3. Pathologisch onderzoek (verzamelen van primaire en pulmonale gemetastaseerde osteosarcoommonsters voor analyse)
<ol><li>Zes weken na osteosarcoomcelinjectie offert u de muizen op door cervicale dislocatie na blootstelling aan CO 2-inhalatie.</li>
	<li>Houd de muis in rugligging en strek beide achterpoten uit.</li>
	<li>Scheid de hele benen met osteosarcoom van het liesgebied. OPMERKING: Zorg ervoor dat alle benen gescheiden zijn van dezelfde anatomische plaats.</li>
	<li>Bereid het histologische monster van benen met osteosarcoom voor door de huid, spieren en voeten te verwijderen en fixeer vervolgens het monster van elke muis in een buis van 50 ml met 20 ml formaline-oplossing (10%) gedurende 24 uur, gevolgd door ontkalking in 10% EDTA-oplossing gedurende 14 dagen met af en toe een bufferwissel.</li>
	<li>Integreer het monster in paraffine en bereid secties voor voor histologisch onderzoek na eerder gepubliceerd werk25.</li>
	<li>Scheid de longen voorzichtig en doe ze in een buis van 50 ml gevuld met 20 ml formaline-oplossing (10%). Breng na 24 uur de longen van elke muis over in een buis van 15 ml met 70% ethanol. Embed de longen in paraffine voor Hematoxyline en Eosine (H & E) kleuring en immunohistochemie assay25.</li>
</ol>

<ol><li>Bielack, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+factors+in+high-grade+osteosarcoma+of+the+extremities+or+trunk%3A+an+analysis+of+1%2C702+patients+treated+on+neoadjuvant+cooperative+osteosarcoma+study+group+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Prognostic factors in high-grade osteosarcoma of the extremities or trunk: an analysis of 1,702 patients treated on neoadjuvant cooperative osteosarcoma study group protocols.</a> Journal of Clinical Oncology. 20 (3), 776-790 (2002).</li>
<li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+microenvironment+and+osteosarcoma+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Bone microenvironment and osteosarcoma metastasis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (19), (2020).</li>
<li>Mirabello, L., Troisi, R. J., Savage, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteosarcoma+incidence+and+survival+rates+from+1973+to+2004%3A+data+from+the+Surveillance%2C+Epidemiology%2C+and+End+Results+Program%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Osteosarcoma incidence and survival rates from 1973 to 2004: data from the Surveillance, Epidemiology, and End Results Program.</a> Cancer. 115 (7), 1531-1543 (2009).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficacy+and+safety+comparison+of+first-line+chemotherapeutic+agents+%28high-dose+methotrexate%2C+doxorubicin%2C+cisplatin%2C+and+ifosfamide%29+for+osteosarcoma%3A+a+network+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Surgery+and+Research%22%5BJournal%5D)">The efficacy and safety comparison of first-line chemotherapeutic agents (high-dose methotrexate, doxorubicin, cisplatin, and ifosfamide) for osteosarcoma: a network meta-analysis.</a> Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 15 (1), 51(2020).</li>
<li>Tsukamoto, S., Errani, C., Angelini, A., Mavrogenis, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+treatment+considerations+for+osteosarcoma+metastatic+at+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Orthopedics%22%5BJournal%5D)">Current treatment considerations for osteosarcoma metastatic at presentation.</a> Orthopedics. 43 (5), 345-358 (2020).</li>
<li>Aljubran, A. H., Griffin, A., Pintilie, M., Blackstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteosarcoma+in+adolescents+and+adults%3A+survival+analysis+with+and+without+lung+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Osteosarcoma in adolescents and adults: survival analysis with and without lung metastases.</a> Annals of Oncology. 20 (6), 1136-1141 (2009).</li>
<li>Ek, E. T., Dass, C. R., Choong, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commonly+used+mouse+models+of+osteosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Oncology%2FHematology%22%5BJournal%5D)">Commonly used mouse models of osteosarcoma.</a> Critical Reviews in Oncology/Hematology. 60 (1), 1-8 (2006).</li>
<li>Castillo-Tandazo, W., Mutsaers, A. J., Walkley, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteosarcoma+in+the+post+genome+era%3A+Preclinical+models+and+approaches+to+identify+tractable+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Osteoporosis+Reports%22%5BJournal%5D)">Osteosarcoma in the post genome era: Preclinical models and approaches to identify tractable therapeutic targets.</a> Current Osteoporosis Reports. 17 (5), 343-352 (2019).</li>
<li>Mason, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+immunology+and+immunotherapy+of+canine+osteosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparative immunology and immunotherapy of canine osteosarcoma.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1258, 199-221 (2020).</li>
<li>Cobb, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-induced+osteosarcoma+in+the+rat+as+a+model+for+osteosarcoma+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Radiation-induced osteosarcoma in the rat as a model for osteosarcoma in man.</a> British Journal of Cancer. 24 (2), 294-299 (1970).</li>
<li>Walkley, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+mouse+osteosarcoma%2C+dependent+on+p53+loss+and+potentiated+by+loss+of+Rb%2C+mimics+the+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Conditional mouse osteosarcoma, dependent on p53 loss and potentiated by loss of Rb, mimics the human disease.</a> Genes & Development. 22 (12), 1662-1676 (2008).</li>
<li>Entz-Werlé, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+apc%3Btwist+double-mutant+mice%3A+a+new+model+of+spontaneous+osteosarcoma+that+mimics+the+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Oncology%22%5BJournal%5D)">Targeted apc;twist double-mutant mice: a new model of spontaneous osteosarcoma that mimics the human disease.</a> Translational Oncology. 3 (6), 344-353 (2010).</li>
<li>Erstad, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+and+heterotopic+murine+models+of+pancreatic+cancer+and+their+different+responses+to+FOLFIRINOX+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy.</a> Disease Models & Mechanisms. 11 (7), (2018).</li>
<li>Chang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+for+osteosarcoma+in+the+mouse%3A+a+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs for osteosarcoma in the mouse: a meta-analysis.</a> Oncotarget. 7 (51), 85650-85674 (2016).</li>
<li>Maloney, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratibial+injection+causes+direct+pulmonary+seeding+of+osteosarcoma+cells+and+is+not+a+spontaneous+model+of+metastasis%3A+A+mouse+osteosarcoma+model%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Orthopaedics+and+Related+Research%22%5BJournal%5D)">Intratibial injection causes direct pulmonary seeding of osteosarcoma cells and is not a spontaneous model of metastasis: A mouse osteosarcoma model.</a> Clinical Orthopaedics and Related Research. 476 (7), 1514-1522 (2018).</li>
<li>Yu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+reproducible+osteosarcoma+rat+model+using+orthotopic+implantation+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">Establishment of reproducible osteosarcoma rat model using orthotopic implantation technique.</a> Oncology Reports. 21 (5), 1175-1180 (2009).</li>
<li>Fidler, I. J., Naito, S., Pathak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+implantation+is+essential+for+the+selection%2C+growth+and+metastasis+of+human+renal+cell+cancer+in+nude+mice+%5Bcorrected%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Reviews%22%5BJournal%5D)">Orthotopic implantation is essential for the selection, growth and metastasis of human renal cell cancer in nude mice [corrected].</a> Cancer Metastasis Reviews. 9 (2), 149-165 (1990).</li>
<li>Leacock, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+zebrafish+transgenic+model+of+Ewing%27s+sarcoma+reveals+conserved+mediators+of+EWS-FLI1+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">A zebrafish transgenic model of Ewing's sarcoma reveals conserved mediators of EWS-FLI1 tumorigenesis.</a> Disease Models & Mechanisms. 5 (1), 95-106 (2012).</li>
<li>Sharma, S., Boston, S. E., Riddle, D., Isakow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteosarcoma+of+the+proximal+tibia+in+a+dog+6+years+after+tibial+tuberosity+advancement%5BTitle%5D)+AND+%22The+Canadian+Veterinary+Journal%22%5BJournal%5D)">Osteosarcoma of the proximal tibia in a dog 6 years after tibial tuberosity advancement.</a> The Canadian Veterinary Journal. 61 (9), 946-950 (2020).</li>
<li>Mohseny, A. B., Hogendoorn, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+for+human+osteosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model for human osteosarcoma.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 804, 221-236 (2014).</li>
<li>Hu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cantharidin+inhibits+osteosarcoma+proliferation+and+metastasis+by+directly+targeting+miR-214-3p%2FDKK3+axis+to+inactivate+%CE%B2-catenin+nuclear+translocation+and+LEF1+translation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cantharidin inhibits osteosarcoma proliferation and metastasis by directly targeting miR-214-3p/DKK3 axis to inactivate β-catenin nuclear translocation and LEF1 translation.</a> International Journal of Biological Sciences. 17 (10), 2504-2522 (2021).</li>
<li>Chang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphyllin+I+suppresses+human+osteosarcoma+growth+by+inactivation+of+Wnt%2F%CE%B2-catenin+pathway+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Polyphyllin I suppresses human osteosarcoma growth by inactivation of Wnt/β-catenin pathway in vitro and in vivo.</a> Scientific Reports. 7 (1), 7605(2017).</li>
<li>Lamar, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SRC+tyrosine+kinase+activates+the+YAP%2FTAZ+axis+and+thereby+drives+tumor+growth+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).</li>
<li>Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+from+discovery+and+ECM+mimicry+to+assays+and+models+for+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. , 3-18 (2014).</li>
<li>Chang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrine+inhibits+prostate+cancer+via+activation+of+the+unfolded+protein+response%2Fendoplasmic+reticulum+stress+signaling+and+reversal+of+epithelial+to+mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Matrine inhibits prostate cancer via activation of the unfolded protein response/endoplasmic reticulum stress signaling and reversal of epithelial to mesenchymal transition.</a> Molecular Medicine Reports. 18 (1), 945-957 (2018).</li>
<li>Fridman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+tumor+growth+of+both+primary+and+established+human+and+murine+tumor+cells+in+athymic+mice+after+coinjection+with+Matrigel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Enhanced tumor growth of both primary and established human and murine tumor cells in athymic mice after coinjection with Matrigel.</a> Journal of the National Cancer Institute. 83 (11), 769-774 (1991).</li>
<li>Kocatürk, B., Versteeg, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+injection+of+breast+cancer+cells+into+the+mammary+fat+pad+of+mice+to+study+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), e51967(2015).</li>
<li>Paschall, A. V., Liu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orthotopic+mouse+model+of+spontaneous+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An orthotopic mouse model of spontaneous breast cancer metastasis.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), e54040(2016).</li>
<li>Hildreth, B. E., Palmer, C., Allen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+primary+bone+tumors+and+bone+metastasis+with+solid+tumor+graft+implantation+into+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Modeling primary bone tumors and bone metastasis with solid tumor graft implantation into bone.</a> Journal of Visualized Experiments. (163), e61313(2020).</li>
<li>Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+bone+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Models of bone metastasis.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), e4260(2012).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Orthotopische injectie van osteosarcoomcellen is een ideaal model om de functie en het mechanisme van specifieke factoren in osteosarcoomcarcinogenese en ontwikkeling te bestuderen om de therapeutische werkzaamheid te evalueren. Om verschillen in tumorgroei te voorkomen, worden de meeste actieve osteosarcoomcellen bij 80% -90% confluent met hetzelfde aantal zorgvuldig geïnjecteerd in het scheenbeen van elke muis en wordt de cel trypsinisatietijd strikt gecontroleerd zonder de levensvatbaarheid van de cel te beïnvloeden. ...

Osteosarcoom is de meest voorkomende primaire botkanker bij kinderen en adolescenten 1,2, die voornamelijk het omliggende weefsel infiltreert en zelfs uitzaait naar de longen wanneer de patiënten worden gediagnosticeerd. Pulmonale metastase is de belangrijkste uitdaging voor osteosarcoomtherapie en de vijfjaarsoverleving van osteosarcoompatiënten met pulmonale metastase blijft zo laag als 20% -30% 3,4,5. De vijfjaarsoverleving van primair osteosarcoom is echter sinds de jaren 1970 verhoogd tot ongeveer 70% als gevolg van de introductie van chemotherapie6. Daarom is het dringend nodig om het fundamentele mechanisme van osteosarcoomcarcinogenese en pulmonale metastase te begrijpen om nieuwe therapieën te ontwikkelen. De toepassing van muismodellen die de progressie van osteosarcoom bij mensen het beste nabootsen, is van groot belang7.
De osteosarcoom diermodellen worden gegenereerd door spontane, geïnduceerde genetische manipulatie, transplantatie en andere technieken. Het spontane osteosarcoommodel wordt zelden gebruikt vanwege de lange tumorvormingstijd, inconsistente tumorvoorval, lage morbiditeit en slechte stabiliteit 8,9. Hoewel het geïnduceerde osteosarcoommodel toegankelijker is om te verkrijgen dan het spontane osteosarcoom, is de toepassing van het geïnduceerde osteosarcoommodel beperkt omdat de inducerende factor de micro-omgeving, de pathogenese en pathologische kenmerken van osteosarcoom zal beïnvloeden10. Transgene modellen helpen de pathogenese van kankers te begrijpen, omdat ze de menselijke fysiologische en pathologische omgevingen beter kunnen simuleren; de transgene diermodellen hebben echter ook hun beperkingen vanwege de moeilijkheid, lange termijn en hoge kosten van transgene modificatie. Bovendien, zelfs in de meest algemeen aanvaarde transgene diermodellen gegenereerd door p53- en Rb-genmodificatie, kwam slechts 13,6% van het sarcoom voor in de botten van de vier ledematen11,12.
Transplantatie is een van de meest gebruikte primaire en verre gemetastaseerde kankermodelproductiemethoden in de afgelopen jaren vanwege de eenvoudige manoeuvre, stabiele tumorvormingssnelheid en betere homogeniteit13. Transplantatie omvat heterotope transplantatie en orthotopische transplantatie volgens de transplantatieplaatsen. Bij osteosarcoom heterotope transplantatie worden de osteosarcoomcellen geïnjecteerd buiten de primaire osteosarcoomplaatsen (bot) van de dieren, meestal onder de huid, subcutaan14. Hoewel de heterotope transplantatie eenvoudig is zonder de noodzaak om een operatie bij dieren uit te voeren, vertegenwoordigen de plaatsen waar de osteosarcoomcellen worden geïnjecteerd niet de werkelijke menselijke osteosarcoommicro-omgeving. Osteosarcoom orthotopische transplantatie is wanneer de osteosarcoomcellen worden geïnjecteerd in de botten van dieren, zoals tibia15,16. In vergelijking met de heterotope grafts worden orthotopische osteosarcoomtransplantaten gekenmerkt door een korte incubatietijd, snelle groei en een sterke erosieve aard; daarom zijn het ideale diermodellen voor osteosarcoom-gerelateerde studies17.
De meest gebruikte dieren zijn muizen, honden en zebravissen18,19. Het spontane model van osteosarcoom wordt meestal gebruikt bij honden omdat osteosarcoom een van de meest voorkomende tumoren bij honden is. De toepassing van dit model is echter beperkt vanwege de lange tumorvormingstijd, de lage tumorigenesesnelheid, slechte homogeniteit en stabiliteit. Zebravissen worden vaak gebruikt om transgene of knock-out tumormodellen te construeren vanwege hun snelle reproductie20. Maar zebravisgenen verschillen van menselijke genen, dus hun toepassingen zijn beperkt.
Dit werk beschrijft de gedetailleerde procedures, voorzorgsmaatregelen en representatieve beelden voor het produceren van het primaire osteosarcoom in het scheenbeen met pulmonale metastase via intratibia-injectie van osteosarcoomcellen in athymische muizen. Deze methode werd toegepast om het primaire osteosarcoom in het tibia van muizen te creëren voor therapeutische werkzaamheidsevaluatie, die een hoge reproduceerbaarheid vertoonde21,22.

<table><tbody><tr><td>Automatische celteller</td><td>Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd</td><td>IC1000</td><td>Cellen tellen</td></tr><tr><td>Anesthesieapparaat</td><td>Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd</td><td>R500IP</td><td>De apparatuur van Anesthesie muizen</td></tr><tr><td>BALB/c athymische muizen</td><td>Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd.</td><td>/</td><td>dier</td></tr><tr><td>Basale membraanmatrix</td><td>Shanghai Uning Bioscience Technology Co., Ltd</td><td>356234, BD, Matrigel</td><td>cellen opnieuw opschorten</td></tr><tr><td>Bioluminescentie-beeldvormingssysteem</td><td>Shanghai Baitai Technology Co., Ltd</td><td>Vieworks</td><td>het volgen van tumorgroei en longmetastasen, als de injectiecel is gelabeld met luciferase</td></tr><tr><td>Centrifugebuis (15 mL)</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>&nbsp;430790, Corning</td><td>De cellen centrifugeren</td></tr><tr><td>Isofluraan</td><td>Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd</td><td>VETEASY</td><td>Muisensedatie</td></tr><tr><td>MEM-medium</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>LM-E1141</td><td>Celcultuurmedium</td></tr><tr><td>Microvolumespuit</td><td>Shanghai high pigeon industry and trade Co., Ltd</td><td>0-50 &mu;L</td><td>Precieze cellen injecteren in de tibia</td></tr><tr><td>Fosfaatbufferoplossing</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>ST447</td><td>De menselijke osteosarcoomcellen wassen</td></tr><tr><td>1ml-spuit</td><td>Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd</td><td>20200411</td><td>boren</td></tr><tr><td>143B-cellijn</td><td>ATCC</td><td>CRL-8303</td><td>osteosarcoom cellijn</td></tr><tr><td>Trypsine (0,25%)</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>25200056, Gibco</td><td>Trypsine behandeling van cellen</td></tr><tr><td>Trypaanblauw</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>ST798</td><td>Cellen kleuren om activiteit te beoordelen</td></tr><tr><td>Vector (pLV-luciferase)</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>VL3613</td><td>Plasmid</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>11668027, Thermo fisher</td><td>Plasmidtransfectie reagens</td></tr><tr><td>X-ray beeldvormingssysteem</td><td>Brook (Beijing) Technology Co., Ltd</td><td>FX PRO</td><td>X-ray beelden werden verkregen om tumorgroei te detecteren</td></tr></tbody></table>

intratibiale osteosarcoomcelinjectie om orthotopisch osteosarcoom en longmetastase muismodellen te genereren

Intratibial Osteosarcoma Cell Injection to Generate Orthotopic Osteosarcoma and Lung Metastasis Mouse Models

Osteosarcoom is de meest voorkomende primaire botkanker bij kinderen en adolescenten, met longen als de meest voorkomende gemetastaseerde plaats. De vijfjaarsoverleving van osteosarcoompatiënten met pulmonale metastase is minder dan 30%. Daarom is het gebruik van muismodellen die de ontwikkeling van osteosarcoom bij mensen nabootsen van groot belang voor het begrijpen van het fundamentele mechanisme van osteosarcoomcarcinogenese en pulmonale metastase om nieuwe therapieën te ontwikkelen. Hier worden gedetailleerde procedures gerapporteerd om de primaire osteosarcoom- en pulmonale metastasemuismodellen te genereren via intratibia-injectie van osteosarcoomcellen. In combinatie met het bioluminescentie- of röntgensysteem voor live beeldvorming, worden deze levende muismodellen gebruikt om de groei en metastase van osteosarcoom te monitoren en te kwantificeren. Om dit model vast te stellen, werd een keldermembraanmatrix met osteosarcoomcellen geladen in een microvolumespuit en geïnjecteerd in één scheenbeen van elke athymische muis na te zijn verdoofd. De muizen werden opgeofferd toen het primaire osteosarcoom de groottebeperking in het door de IACUC goedgekeurde protocol bereikte. De benen met osteosarcoom en de longen met uitzaaiingen werden gescheiden. Deze modellen worden gekenmerkt door een korte incubatietijd, snelle groei, ernstige laesies en gevoeligheid bij het monitoren van de ontwikkeling van primaire en pulmonale gemetastaseerde laesies. Daarom zijn dit ideale modellen voor het verkennen van de functies en mechanismen van specifieke factoren in osteosarcoom carcinogenese en pulmonale metastase, de tumormicro-omgeving en het evalueren van de therapeutische werkzaamheid in vivo.

Succesvolle orthotopische (primaire) osteosarcoom en gemetastaseerde longmodellen zijn afhankelijk van de nauwkeurige orthotopische injectie van osteosarcoomcellen. Hier werd met succes een orthotopisch (primair) osteosarcoommodel via intratibiale osteosarcoomcelinjectie ontwikkeld. Figuur 3A toont een representatieve muis met orthotopisch (primair) osteosarcoom en figuur 3B toont een representatief geïsoleerd orthotopisch (primair) osteosarcoom. Het tu...

Het huidige protocol beschrijft intratibia osteosarcoom celinjectie om muismodellen te genereren met orthotopisch osteosarcoom en pulmonale metastase laesies.

Intratibiale osteosarcoomcelinjectie om orthotopisch osteosarcoom en longmetastase muismodellen te genereren

Osteosarcoma is the most common primary bone cancer in children and adolescents, with lungs as the most common metastatic site. The five-year survival ...

Dit protocol beschrijft de techniek om muismodellen te genereren met primair osteosarcoom en de pulmonale metastaselaesies. Door intratibiale injectie van osteosarcoomcellen bootst dit model het beste de klinische ontwikkelingskenmerken van tumorostepinoom na. Nauwkeurige aantallen osteosarcoomcellen worden rechtstreeks in het scheenbeen geïnjecteerd met behulp van een microvolumespuit, waardoor identieke tumorvormingssnelheden en tumorvolumes mogelijk zijn.Op de dag van osteosarcoomcelinjectie, was de cellen twee keer met PBS. Trypsinize de cellen met 1,5 milliliter van 0,25% trypsine gedurende drie minuten. Voeg vervolgens zes milliliter 10% serumbevattende MEM-media toe.Verzamel de cellen in een centrifugebuis van 15 milliliter. Zuig 20 microliter celsuspensie op in de kamer van de celtelplaat en bereken de celconcentratie met behulp van een automatische celteller. Centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur op 800 maal g.Adem het supernatant op met een pipet, resuspend de celkorrel in een keldermembraanmatrix van 8,5 milligram per milliliter en plaats ze op ijs. Plaats de muis in rugligging. Houd de enkel van de muis vast met de duim en wijsvinger en desinfecteer de injectieplaats van het scheenbeen met een 70% ethanol wattenstaafje.Draai het enkelgewricht van elke muis naar buiten om het scheenbeen en kuitbeen te bewegen en buig het kniegewricht naar een geschikte positie totdat het proximale tibiaplateau zichtbaar is door de huid. Bevestig de naald aan een spuit van één milliliter en richt de punt van de naald in de richting van de injectieplaats, evenwijdig aan de as van het scheenbeen. Breng de naald percutaan in om een gat door het tibiaplatform naar het distale uiteinde van het scheenbeen te boren.Laad de osteosarcoomcelsuspensie die eerder op ijs is geplaatst in een microvolumespuit en vervang de spuit van één milliliter in het scheenbeen door de met osteosarcoomcellen geladen microvolumespuit. Injecteer langzaam ongeveer 10 microliter osteosarcoomcelsuspensie in het scheenbeen van elke athymische muis zonder veel druk uit te oefenen. Verwijder vervolgens de microvolumespuit van de injectieplaats en druk ongeveer 30 seconden met het wattenstaafje op de plaats.Plaats de muis terug in een schone kooi en observeer het herstel gedurende 10 minuten. Deze figuur toont het muismodel met orthotopisch osteosarcoom ontwikkeld uit intratibiale osteosarcoomcelinjectie en de geïsoleerde vorm ervan. Een geleidelijke toename van het tumorvolume wordt elke week waargenomen.De röntgenfoto's verkregen van de eerste tot en met de zesde week na injectie van luciferase-gelabelde osteosarcoomcellen toonden een geleidelijke toename van het volume. Bovendien toonde het beeld verkregen na de injectie in het scheenbeen van de muis orthotopische osteosarcoomgroei in vivo. De pulmonale metastase veroorzaakt door intratibiale injectie van de osteosarcoomcellen werd met succes in vivo gevolgd met behulp van een bioluminescentie live imaging-systeem.Observatie onder een stereomicroscoop onthulde gemetastaseerde kolonies in de geïsoleerde longweefsels. He-kleuring op paraffine-ingebedde longweefsels toonde gemetastaseerde laesies. De naald moet percutaan via het patellape ligament in het gewrichtskapsel worden ingebracht om een gat door het tibiaplatform naar het digitale scheenbeen te boren door de spuit te draaien.

intratibial-osteosarcoma-cell-injection-to-generate-orthotopic

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

De nieuwe protocol gerapporteerd in deze studie kan selectieve detectie van longmetastasen in cel resolutie in muizen door...

Verbeterde visualisatie van longmetastasen bij Single Cell resolutie in Muizen van de gecombineerde<em&gt; In-situ</em&gt; Perfusie van het longweefsel en X-gal kleuring van<em&gt; LacZ</em&gt;-Label tumorcellen

Diermodellen worden vaak gebruikt om uitzaaiing studeren bot. In dit protocol beschrijven we twee gebruikelijke methoden van tumorinoculatie voor bot metastase studies en beschrijf kort enkele van de analyses gebruikt om toezicht te houden en te kwantificeren deze modellen.

Modellen van bot metastase

De video toont de orthotopische inentingstechniek voor borstkanker in een muismodel. Deze techniek produceert een hoge tumorigenesesnelheid met minder variabiliteit in tumorgrootte en vorm in vergelijking met subcutane of niet-chirurgische injectie.

Orthotopische injectie: weefselspecifieke kankercellen implanteren in een volwassen muis

Kanker is een complexe ziekte die wordt beïnvloed door het weefsel rondom de tumor en lokale pro- en anti-inflammatoire mediatoren. Daarom kan orthotroop injectie modellen plaats subcutane modellen nuttig om de progressie van kanker te bestuderen op een wijze die beter nabootst humane pathologie.

Orthotopische Injectie van borstkankercellen in de uiervet Pad van Muizen tumorgroei te bestuderen.

Dit manuscript beschrijft de gedetailleerde procedure van intra-iliacale arteriële (IIA) injectie, een techniek om kankercellen specifiek af te leveren aan weefsels van de achterpoten, inclusief botten, om experimentele botmetastasen te creëren. Hoewel het oorspronkelijk werd vastgesteld met borsttumormodellen, kan dit protocol gemakkelijk worden uitgebreid naar andere soorten kanker.

Intra-iliaca Injectie voor Efficiënte en Selectieve Modellering van Microscopisch botmetastase

Hier presenteren we een protocol voor het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) van Li-Fraumeni syndroom (LFS) patiënt afgeleide fibroblasten, differentiatie van iPSCs via mesenchymale stamcellen (MSCs) botcellen te modelleren in vivo tumorigenesis met behulp van LFS patiënt afkomstige botcellen.

Modelleren van osteosarcoom met behulp van Li-Fraumeni syndroom geïnduceerde pluripotente stamcellen patiënt-afgeleide cellen

Hier presenteren we een protocol om het implantaat van borstkankercellen in de borstklier vet pad in een eenvoudige, minder invasief, en gemakkelijk te bedienen manier, en deze orthotopic borst kanker muismodel met een juiste borstklier vet pad omgeving kan worden gebruikt voor het onderzoeken van verschillende aspecten van kanker.

Orthotopic injectie van borstkankercellen in de borstklier vet Pad muizen

Botmetastasemodellen ontwikkelen metastase niet uniform of met een 100% incidentie. Directe intra-osseuze tumorcelinjectie kan leiden tot embolisatie van de long. We presenteren onze techniek voor het modelleren van primaire bottumoren en botmetastase met behulp van solide tumortransplantaatimplantatie in bot, wat leidt tot reproduceerbare transplantatie en groei.

Modellering van primaire bottumoren en botmetastase met implantatie van solide tumortransplantaten in bot

Hier wordt een syngenetische orthotopische implantatie gevolgd door een amputatieprocedure van het osteosarcoom met spontane pulmonale metastase beschreven die kan worden gebruikt voor preklinisch onderzoek van metastasebiologie en ontwikkeling van nieuwe therapieën.

Een syngeneïsch orthotopisch osteosarcoom Sprague Dawley Rat-model met amputatie om de metastasesnelheid te beheersen

Het manuscript beschrijft een methodologie voor het opzetten en longitudinaal monitoren van spontane longmetastasen van orthotopisch geïnjecteerde borsttumoren, die vatbaar is voor interventie in alle stadia van de metastatische cascade.

In vivo Beeldvorming om spontane longmetastasen van orthotopisch geïnjecteerde borsttumorcellen te meten

Het huidige protocol beschrijft de methode voor het opstellen van een patiënt-afgeleid xenotransplantaat (PDX) muismodel met behulp van humaan osteosarcoomweefsel.

Oprichting van een van de patiënt afgeleid xenotransplantaatmuismodel met humaan osteosarcoomweefsel

Leer intratibiale injectie van osteosarcoomcellen om orthotopische muismodellen met primaire tumoren en longmetastasen te genereren. Deze methode bootst klinische osteosarcoomontwikkeling nauwkeurig na.

Intratibiale osteosarcoomcelinjectie om orthotopisch osteosarcoom en longmetastase muismodellen te genereren

Meer video's verkennen