Ex Vivo | Optogenetische ondervraging van synaptische transmissie en plasticiteit op lange afstand van mediale prefrontale cortex naar laterale entorhinale cortex

Viraal geleverde optogenetische constructies maken gedetailleerde elektrofysiologische karakterisering van de fysiologie en plasticiteit van specifieke synapsen in acute hersensegmenten mogelijk. De belangrijkste voordelen van het activeren van synapsen optogenetisch is het vermogen om langeafstandsroutes te bestuderen en de selectieve stimulatie van axonen die niet anatomisch gescheiden zijn. Dr.Lisa Kinnavane, een onderzoeksmedewerker van ons laboratorium, demonstreert de procedure.

Om te beginnen laadt u een Hamilton-spuit in een pomp met micro-injectiespuit die is bevestigd aan een beweegbare arm die is gemonteerd op een stereotaxisch frame. Plaats vervolgens een aliquot van vijf microliter van het virus in een microcentrifuge. Draai de buis een paar seconden en pipetteer twee microliter van het virale preparaat in het deksel van de buis.

Om de spuit te vullen met het virale preparaat, bekijkt u de naaldpunt met een chirurgische microscoop. Plaats vervolgens handmatig de bolus van het virus op de punt van de naald en trek de zuiger van de spuit op met behulp van de pompbedieningen. Stel het injectievolume van de pomp in op 300 nanoliter en het debiet op 100 nanoliter per minuut.

Laat de pomp draaien en bevestig de juiste stroom door de druppel van het virus aan de naaldpunt te observeren. Absorbeer het virus op een wattenstaafje en maak de naald schoon met 70% ethanol. Navigeer vervolgens met behulp van de stelschroeven op het stereotaxische frame de naaldpunt naar de bregma en let op de stereotaxische metingen die zijn waargenomen op de drie vernier-schalen op het frame.

Tel deze afstanden op of trek ze af van de bregmacoördinaten. Maak een braamgat aan het schedeloppervlak met behulp van een microboor die op de stereotaxische arm is gemonteerd. Steek de naald in de hersenen bij de vooraf bepaalde dorsoventrale coördinaat en infundeer een vooraf bepaald volume van het virale preparaat.

Laat de naald na infusie 10 minuten in situ om de diffusie van de bolus mogelijk te maken. Verwijder vervolgens de naald en laat de pomp draaien om ervoor te zorgen dat de naald niet wordt geblokkeerd. Twee weken na de virale injectie, euthanaseer de rat, ontleed snel de hele hersenen en breng het over in de sucrose-snijoplossing.

Pak met een metalen theelepel de hersenen op, gooi de overtollige oplossing weg en plaats deze op een filterpapier. Verwijder met behulp van een scalpel het cerebellum en snijd het cerebrum in het coronale vlak ongeveer halverwege de lengte. De achterste helft is het LEC-weefselblok.

Breng het weefselblok en de resterende hersenen terug naar de sucrosesnijoplossing. Plaats vervolgens een druppel cyanoacrylaatlijm op een vibratomstadium en verspreid deze in een dunne laag. Gebruik vervolgens een theelepel, pluk het LEC-weefselblok en breng het over op de lijmpleister, zodat de voorste coronale snede is gehecht.

Installeer het podium in de vibratome weefselkamer en giet snel voldoende sucrose-snijoplossing om het weefsel onder te dompelen. Nadat u het ventrale oppervlak van het weefselblok naar het mes hebt gericht, snijdt u 350 micrometer dikke plakken van ventraal naar dorsaal met behulp van een langzame bladvoortgangssnelheid. Meestal kunnen zeven plakjes per halfrond worden verkregen.

Breng de segmenten over naar de segmentverzamelingskamer. Plaats vervolgens de verzamelkamer een uur in een waterbad van 34 graden Celsius voordat u terugkeert naar kamertemperatuur. Plaats de rest van de hersenen gedurende 48 uur in paraformaldehyde.

Voor de identificatie van de doelcel plaatst u het segment in de opnamekamer en immobiliseert u het met een segmentanker. Navigeer onder lage vergroting, met behulp van infraroodverlichting, naar de LEC-laag vijf. Schakel vervolgens over naar het hoge vergrotingsdoel voor onderdompeling in water en identificeer de piramidale neuronen.

Markeer de positie van de cel op de monitor met tape. Om vervolgens een hele celpleisterklem te vormen, fabriceert u een micropipet van borosilicaatglas en vult u deze met een intracellulaire opnameoplossing. Plaats de gevulde micropipet in de elektrodehouder en oefen positieve druk uit door hard te blazen in een mondstuk dat is aangesloten op de zijpoort van de elektrodehouder.

Verhoog het microscoopdoel zodanig dat zich een meniscus vormt en steek de elektrode in de meniscus totdat deze op de microscoop te zien is. Open het venster Seal Test en bepaal of de pipetweerstand drie tot vijf megaohms is. Raak vervolgens de geïdentificeerde cel aan met een pipetpunt, wat resulteert in een inkeping in het celmembraan.

Pas vervolgens negatieve druk uit door aan te zuigen op het mondstuk, waardoor de weerstand van de pipet toeneemt. Blijf geleidelijk negatieve druk uitoefenen totdat het celmembraan scheurt, wat resulteert in transiënten van de capaciteit van de hele cel. Om de huidige klemconfiguratie te openen, gebruikt u een gemonteerde LED die in het microscooplichtpad is gericht met filterkubussen en geschikte optiek en past u lichtpulsen toe op de plak via het 40X-objectief.

Lever treinen van meerdere lichtpulsen op vijf hertz, 10 hertz en 20 hertz om de presynaptische afgifte-eigenschappen te onderzoeken. Om biocytine in staat te stellen het neuron te vullen, wacht u ten minste 15 minuten na het invoeren van de hele celconfiguratie. Controleer bij spanningsklem de membraancapaciteit en ingangsweerstand.

Trek vervolgens langzaam de pipet terug langs de naderingshoek weg van de soma van de cel, waarbij de langzame verdwijning van capaciteitstransiënten en membraanstroom wordt waargenomen, wat wijst op de herdichting van het celmembraan en de vorming van een buitenste pleister aan de pipetpunt. Doe de plak in paraformaldehyde in een 24-wells plaat en incubeer een nacht. Bevestig met oct-medium een weefselblok aan de cryostaatmonsterschijf.

Om het weefsel te bevriezen, plaatst u isopentane in een geschikte container en dompelt u de monsterschijf onder, zodat het weefsel boven het niveau van het isopentaan ligt. Laat vervolgens de container met isopentane zakken tot vloeibare stikstof en laat het weefsel bevriezen. Zodra het weefsel volledig is bevroren, laat u het weefselblok gedurende 30 minuten in de cryostaatkamer op min 20 graden Celsius staan om de temperatuur van het blok in evenwicht te brengen.

Snijd na equilibratie 40 micrometer dikke secties in de cryostaat en gebruik een fijne kwast om de secties van het mes te leiden. Bevestig deze bevroren secties aan een poly-L-lysine-gecoate glazen microscoopglaas op kamertemperatuur door de dia aan de secties aan te raken. Nadat u 150 microliter montagemedium aan elke dia hebt toegevoegd, brengt u de afdekslip aan en verwijdert u eventuele luchtbellen door voorzichtig op de afdekslip te drukken.

Bedek de dia's ter bescherming tegen fotobleaching en laat ze 12 uur aan de lucht drogen. Onderzoek vervolgens met behulp van een fluorescentiemicroscoop de locatie van de virale injectieplaats. Voor biocytinekleuring incubeer de plakjes in 3% waterstofperoxide in PBS gedurende 30 minuten om eventuele endogene peroxidase-activiteit te blokkeren.

Was vervolgens de hersenplakken met PBS totdat er geen zuurstofbellen meer zichtbaar zijn. Incubeer vervolgens de plakjes gedurende drie uur in 1% avidine-gebiotinyleerde HRP-complexoplossing in PBS met 0,1% Triton X-100. Na zes PBS-wasbeurten incubeert u elke plak in DAB-oplossing totdat de biocytinekleuring van neuronale structuren zichtbaar wordt.

Stop de reactie door de plakjes over te brengen in koude PBS. Monteer vervolgens de plakjes op de glasmicroscoopglaasjes met een borstel. Voeg na het verwijderen van overtollige PBS het montagemedium toe.

Bedek de plakjes met afdekglijders en laat ze aan de lucht drogen, zoals eerder aangetoond. Een gezonde piramidale cel werd gelokaliseerd en gepatcht. Als post-synaptische celidentificatie vereist is, moet een cel die de fluorescerende marker tot expressie brengt, worden gelokaliseerd met behulp van widefield-optica.

Enkele lichtpulsen van twee milliseconden resulteerden in eenvoudige golfvorm optogenetische excitatorische post-synaptische potentialen. De plasticiteit van de synaps op korte termijn wordt onderzocht door vijf, 10 en 20 hertz-treinen van lichtstimulatie toe te passen. Tijdens het onderzoeken van plasticiteit op lange termijn, veroorzaakte het toevoegen van cholinerge agonist carbachol aan de circulerende aCSF gedurende 10 minuten een langdurige depressie die 40 minuten na verwijdering van het ligand nog steeds duidelijk was.

De lengte van de injectieplaats werd histologisch onderzocht. De fluorescerende verslaggever mCherry was gelokaliseerd in de diepere lagen van de prelimbische en infralimbische cortex. Verder bevestigde het kleuren van een met biocytine gevulde cel de locatie en morfologie.

De kritieke stappen van dit protocol zijn nauwkeurige transductie van het afferente hersengebied, dat post hoc kan worden geverifieerd, en snelle dissectie van de hersenen bij het bereiden van acute plakjes. Deze procedure is gemakkelijk te combineren met fluorescerende etikettering van een individueel celtype, zoals een bepaalde interneuron-subklasse. Om dit te doen, zouden we een transgeen dier gebruiken dat een recombinase in dat specifieke celtype tot expressie brengt.

Viraal geleverde optogenetische constructen hebben snelle vooruitgang mogelijk gemaakt op het gebied van systemen en circuitneurowetenschappen.