Caenorhabditis elegans als een modelsysteem voor het ontdekken van bioactieve verbindingen tegen polyglutamine-gemedieerde neurotoxiciteit

Als een krachtig diermodel in neurodegeneratieve en gedragsstudies, kunnen C.elegans worden gebruikt om toxische verbindingen efficiënt te screenen en te evalueren tegen polyglutamine neurotoxiciteit met behulp van de ziekte van Huntington-achtige modellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is profilering en integratie van meerdere fenotypen in verschillende C.elegans-modellen. Ook eigenlijk zoals C.elegans modellen worden gebruikt in deze methode.

Het biedt omvang in screening en het onderzoek van therapeutische kandidaten voor andere neurodegeneratieve vertragingen en inderdaad andere vertragingen. Let op de temperaturen die worden gebruikt in de groei van C.elegans en voer de test uit in de juiste stadia van namicale ontwikkeling. De procedure wordt gedemonstreerd door Jiang Yiyi, Xioa Yue en Wang Qiangqiang, drie afgestudeerde studenten.

Begin met het overbrengen van 300 tot 500 gesynchroniseerde L1-larven van AM141-nematoden naar elke put van een 48 putplaat met 500 microliter S-medium met OP50-stam van E.coli en vijf milligram per milliliter astragalan. Sluit de plaat af met parafilm en incubeer bij 20 graden Celsius en 120 rotaties per minuut voor de gewenste tijdsintervallen. Breng de aaltjes over in een steriele microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en was driemaal met M9-buffer door centrifugatie om de resterende OP50-cellen te verwijderen.

Resuspendeer vervolgens de AM141-nematoden in M9-buffer. Breng nu 10 tot 15 nematoden over in elke put in een plaat met 384 putten, zet 10 replicatieputten voor elke behandeling en voeg 10 microliter 200 millimolair natriumazide toe aan elke put om de nematoden te verlammen door ze naar de bodem te laten zakken. Plaats de plaat in een beeldvormingssysteem met een hoog gehalte om fluorescerende beelden te verkrijgen.

Open de software voor het verkrijgen van afbeeldingen en stel de parameters in die in het tekstmanuscript worden vermeld. Analyseer de afbeeldingsgegevens door het venster met testplaatgegevens te openen en de testplaat te selecteren voor beeldanalyse. Dubbelklik op een testvak om de afbeelding weer te geven.

Selecteer vervolgens de telkernen als analysemethode en klik op de knop Instellingen configureren. Definieer de bronafbeelding van het FITC-kanaal en selecteer het standaardalgoritme. Stel de parameters voor beeldanalyse in zoals beschreven in het tekstmanuscript en test ze om de analysemethode te optimaliseren.

Sla de instellingen op en voer de analyse uit op alle putten. Exporteer de totale kernen als het totale aantal Q40:YFP-aggregaten in elke put. Tel het aantal nematoden in elke put en bereken het gemiddelde aantal Q40:YFP-aggregaten per nematode in elke groep.

Bereken vervolgens de remmingsindex. Om nematoden voor te bereiden op de polyQ neurotoxiciteitstest, breng 300 tot 500 gesynchroniseerde L1-larven van HA759-nematoden over naar elke put van een 48-putplaat met 500 microliter S-medium met OP50-stam van E.coli en vijf milligram per milliliter astragalan. Na het afdichten van de platen incubeer, oogst en resuspenseer de nematoden in M9-buffer zoals eerder aangetoond.

Bereid nu in agarose pad door twee gram agarose toe te voegen aan 100 milliliter M9-buffer en verwarm de oplossing in een magnetron tot bijna kokend. Dispense 0,5 milliliter gesmolten agarose op het midden van een een millimeter dikke microscopie glasplaat geplaatst tussen twee stukken van twee millimeter dikke glasplaten, verticaal bedekkend met een andere dia. Verwijder voorzichtig de bovenste glijbaan zodra de agarose is afgekoeld en is gestold.

Begin de ASH neuronale overlevingstest door een druppel van 20 millimolair natriumazide op de agrospad toe te voegen en vervolgens 15 tot 20 HA759-nematoden in de druppel over te brengen om ze te immobiliseren. Plaats een afdekplaat voorzichtig over de aaltjes. Bewaar de dia nu onder een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een digitale camera.

Selecteer een 40x objectieflens en FITC-filter om GFP-positieve ASH-neuronen in het hoofdgebied van de nematoden te detecteren. Selecteer willekeurig meer dan 50 nematoden in elke groep om het aantal nematoden met GFP-gelabelde bilaterale ASH-neuronen in hun hoofdgebied te tellen en bereken vervolgens de overlevingskans van ASH-neuronen. Voor de osmotische vermijdingstest, verdeel een voedselvrije NGM-plaat in normale en valzones door een acht molaire glycerollijn in het midden te creëren.

Verspreid vervolgens een 200 millimolaire natriumazidelijn op ongeveer een centimeter afstand van de glycerollijn om de nematoden die door de glycerolbarrière naar de valzone gaan, te verlammen. Breng elk ongeveer 200 nematoden over op de normale zone van drie replicaatplaten voor elke groep. Voeg vervolgens een druppel van 1% butanedione toe aan de valzone om de nematoden aan te trekken.

Dek het deksel van de petrischaal onmiddellijk af en incubeer gedurende 90 minuten bij 23 graden Celsius. Scoor het aantal aaltjes op beide zones onder een microscoop en bereken de vermijdingsindex. De transgene polyQ-stam AM141 drukt Q40:YFP-fusie-eiwitten sterk uit in zijn lichaamswandspiercellen, geïdentificeerd door dit geautomatiseerde beeldvormings- en analyseprotocol, waarvan de toenemende hoeveelheid werd geremd door astragalanbehandeling die zijn beschermende potentieel aantoont.

Een verlies van GFP-fluorescentie en bilaterale ASH-neuronen in de hoofdgebieden van nematoden duidt op de ASH neuronale dood. Deze ASH neuronale overlevingstest kan worden gebruikt om het neuroprotectieve effect van teststoffen op Caenorhabditis elegance neuronen visueel te evalueren. De chemosensorische vermijdingstest werd gebruikt om de effectieve testmonsters te onderzoeken op het functionele verlies van ASH-neuronen gemedieerd door polyQ-aggregatie.

De vermijdingsindex van HA759-nematoden behandeld met astragalan bij 15 graden Celsius gedurende drie dagen steeg tot meer dan 0,6, wat een neuroprotectief effect van de polysaccharide tegen gedragsstoornissen aantoont. Voor het evalueren van de algehele neuroprotectieve capaciteit van teststoffen werden de gegevens van de individuele testen geïntegreerd en gepresenteerd als een radargrafiek die het gebied van de driehoek in de astragalan-behandelingsgroep groter toont dan dat van de controlegroep, wat de anti-polyQ-effecten van de polysaccharide aangeeft. Houd er rekening mee dat voedsel, temperatuur en vocht hun gedrag van C.elegans kunnen beïnvloeden.