Interfase Fluorescentie in situ Hybridisatie van beenmerguitstrijkjes van multipel myeloom

De toepassing van fluorescentie in situ hybridisatie genaamd FISH op genetische risicostratificatie bij multipel myeloom is essentieel. Het kritieke deel van FISH-rapporten zijn niet alle kerncellen, maar klonale plasmacellen die specifiek zijn gezuiverd of geïdentificeerd door te sorteren met anti-CD138 magnetische kralen of te markeren met cytoplasmatische kappa of Lambda lichte keten immunoglobuline met FISH-testen genaamd cIg FISH. Interfase FISH na plasmacelsortering of cIg FISH blijkt significant te zijn bij de diagnose van multipel myeloom, vanwege een relatief lager aandeel plasmacellen in het beenmerg.

Deze methoden hebben echter enkele tekortkomingen, waaronder complexe processen, hoge eisen aan monsters en hoge experimentele kosten. Plasmacellen kunnen snel worden gelokaliseerd in een beenmerguitstrijkje. Op basis hiervan gebruiken we beenmerguitstrijkje FISH voor de detectie van multipele myeloomcellen.

Deze studie werd uitgevoerd volgens de principes van de Verklaring van Helsinki en goedgekeurd door de ethische commissie van het Zhongnan-ziekenhuis van de Universiteit van Wuhan. De monsters werden verzameld van een multipel myeloompatiënt op de afdeling Hematologie, Zhongnan Hospital van de Wuhan University of China. Plaats de eerste 0,2 milliliter beenmergoplossing op een schone wegwerpglasplaat, verspreid de beenmerguitstrijkjes tot uniforme dikte en scherpe staarten door het beenmerg snel te verwijderen en droog het vervolgens op natuurlijke wijze.

Bedek de beenmergfilms met één milliliter Wright-Giemsa-oplossing gedurende ongeveer 10 seconden bij kamertemperatuur. Voeg een milliliter fosfaatbuffer toe aan de dia's, zorg was vereist om te voorkomen dat de kleurstofoplossing zou uitdrogen of van de dia's zou stromen. Meng de kleurstofoplossing voorzichtig en houd deze 15 minuten op kamertemperatuur.

Spoel de glaasjes af met schoon water en droog het in de lucht bij kamertemperatuur. Gebruik voorwaartse lichtmicroscopie om kwaadaardige plasmacellen te detecteren, de plasmacellen moeten goed worden verspreid. Wat we nu in het veld zien, zijn de plasmacellen die redelijk verspreid zijn.

Dit is een typische Binuclear kernplasmacel. Bedek het gehybridiseerde gebied met een fixatieve oplossing gedurende 10 minuten om plasmacellen te verkleuren en te fixeren. Spoel de glijbaan af met gedeïoniseerd water en droog het in lucht bij kamertemperatuur.

Verwarm een pot met twee keer SSC-buffer voor op 56 graden Celsius in een waterbad. Was het bereide beenmerguitstrijkje gedurende 10 minuten in de voorverwarmde tweemaal SSC-buffer, gevolgd door het dompelen in gedeïoniseerd water bij kamertemperatuur. Droog het uitstrijkje uit in een ethanolgradiënt van 70%85% en 100% ethanol elk gedurende één minuut.

Droog het uitstrijkje 10 minuten in de lucht. Voeg eerst TP53 toe op centromeer van chromosoom 17-sondemengsel aan het hybridisatiegebied en bedek het met een afdekslip druk zachtjes op het fijne puntige pincet om luchtbellen van onderaf te verwijderen. Sluit alle zijden van de afdekslip af met rubbercement om een goede dichtheid te garanderen.

Na het stollen van het rubbercement werd de glijbaan op een automatische FISH-machine geplaatst denaturatie werd uitgevoerd bij 78 graden Celsius gedurende vijf minuten gevolgd door hybridisatie bij 37 graden Celsius 's nachts. Pak de glijbaan uit de FISH-machine. Gebruik een fijn puntig pincet om het rubbercement voorzichtig te verwijderen.

Dompel de schuif ongeveer één of twee minuten onder in twee keer SSC bij kamertemperatuur om de afdekplaat eraf te wassen. Was de glijbaan in 68 graden Celsius voorverwarmbuffer in een waterbad gedurende twee minuten. Was de glaasjes met twee keer SSC gedurende één minuut in een waterbad van 37 graden Celsius.

Zet precies in het donker om grondig te drogen gedurende 10 minuten op 10 microliter DAPI naar het gehybridiseerde gebied, bedek met een afdekslip. Bekijk gehybridiseerde dia met behulp van een geschikte filterset op een fluorescentiemicroscoop, gebruik monochromatisch blauw fluorofoor optisch filter om de fluorescentie-intensiteit van de celkern te observeren. Maak celkernbeelden onder een DAPI-filterset.

CEP17 werd gelabeld met groene fluorescentie. Gebruik spectrumgroen fluorofoor optisch filter om de locatie van CEP17 te observeren. Neem CEP17 signalenbeeld onder groene filterset.

Het TP53-gen werd gelabeld met oranje fluorescentie. Gebruik spectrum oranje fluorofoor optisch filter om TP53 te observeren, neem TP53-signalen beeld onder de set, voeg deze drie beelden samen tot een geheel en onderzoek naar numerieke afwijkingen. In een normale interfasecel worden twee oranje en twee groene signalen waargenomen in een kern met blauwe fluorescentie die wijst op één paar normale chromosomen 17.

De resultaten toonden de morfologie en genetica van beenmerg bij een multipel myeloompatiënt. Figuur A toonde aan dat 15% van de plasmacellen in een beenmerguitstrijkje groter en donkerder en nucleair bleken te hebben, samen met grote hoeveelheden cytoplasma dan normaal. Figuur B toonde een grijsschaalbeeld van representatief door een kernvormige plasmacel in een beenmerguitstrijkje.

Figuur C toonde vier oranje en vier groene signalen in één interfasekern van plasmacel, wat suggereert dat vier kopieën van chromosoom 17 gelokaliseerd waren in een kern. Figuur D toonde aan dat het abnormale chromosoomkaryogram van deze patiënt twee paar chromosomen 17 in één kern bevestigde. Beenmerguitstrijkjes zijn veel gemakkelijker te verkrijgen dan antistollingsbeenmonsters, omdat het verkrijgen van antistollingsbeendervelg complexe procedures vereist om de kern te verkrijgen.

Daarom hebben we een overtuigende methode ontwikkeld voor beenmerguitstrijkje FISH voor de detectie van multipele myeloomcellen.