Name: Interfase Fluorescentie in situ Hybridisatie van beenmerguitstrijkjes van multipel myeloom (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Leer interphase FISH-detectie op beenmerguitstrijkjes voor multipel myeloom met anti-CD138 magnetische kralen. Deze methode verbetert de identificatie van klonale plasmacellen en vermindert specimenkosten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit project werd ondersteund door het Innovatiefonds van WNLO 2018WNLOKF023.

Deze studie werd uitgevoerd volgens de principes van de Verklaring van Helsinki en goedgekeurd door de ethische commissie van het Zhongnan-ziekenhuis van de Universiteit van Wuhan (nr. 2019065). De monsters werden verzameld bij een MM-patiënt op de afdeling Hematologie, Zhongnan Hospital van de Wuhan University (China).
1. Bereiding van de BM-uitstrijkjes
<ol><li>Plaats de eerste 0,2 ml BM-oplossing op een schone glazen wegwerpschuif.</li>
	<li>Verdeel de BM-uitstrijkjes tot uniforme dikte met scherpe staarten door de BM snel te verwijderen. Droog vervolgens op natuurlijke wijze.</li>
	<li>Bedek de BM-folies met 1 ml Wright-Giemsa-oplossing gedurende ongeveer 10 s bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Voeg 1 ml fosfaatbuffer toe aan de dia's. OPMERKING: Zorg ervoor dat de verfoplossing niet uitdroogt of van de dia's afstroomt.</li>
	<li>Meng de kleurstofoplossing voorzichtig en houd deze gedurende 15 minuten op kamertemperatuur.</li>
	<li>Spoel de glaasjes af met schoon water en droog ze in lucht op kamertemperatuur.</li>
	<li>Gebruik forward light microscopie om kwaadaardige pc's te detecteren. De pc's moeten goed verspreid zijn.</li>
</ol>2. VIS voorbewerking van de BM-uitstrijkjes
<ol><li>Bedek het gehybridiseerde gebied met een fixatieve oplossing gedurende 10 minuten om de pc's te verkleuren en te repareren.<ol>
<li>Om een verse fixatieve oplossing te bereiden, mengt u methanol met ijsazijn in een volumeverhouding van 3:1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Spoel de glijbaan af met gedeïoniseerd water (dH2O) en droog het in lucht bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Verwarm een pot met 2x SSC buffer voor op 56 °C in een waterbad. Verdun de buffer voor gebruik vers tot 20x SSC.<ol>
<li>Om 20x SSC te bereiden, mengt u 176 g natriumchloride en 88 g natriumcitraat grondig met 800 ml dH2O. Meet de pH en stel deze in op pH 5,3 ± 0,2. Voeg vervolgens dH2O toe om het uiteindelijke volume op 1 L te brengen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Was het voorbereide BM-uitstrijkje gedurende 10 minuten in de voorverwarmde 2x SSC-buffer, daarna dompel het bij kamertemperatuur in gedeïoniseerd water.</li>
	<li>Droog het uitstrijkje uit in een ethanolgradiënt (70%, 85% en 100% ethanol, elk gedurende 1 minuut). Droog het uitstrijkje gedurende 10 minuten aan de lucht.</li>
</ol>3. BM uitstrijkje FISH en wassen
OPMERKING: Alle stappen werden uitgevoerd in een donkere kamer om fluorescentie te voorkomen.
<ol><li>Voeg het TP53/centromeer van chromosoom 17 (CEP17) sondemengsel toe aan het hybridisatiegebied en bedek het met een coverslip. Druk zachtjes met een fijn puntig pincet om luchtbellen van onderaf te verwijderen.</li>
	<li>Sluit alle zijden van de afdekplaat af met rubbercement om een goede dichtheid te garanderen.</li>
	<li>Na het stollen van het rubbercement plaatst u de schuif op een automatische FISH-machine. Voer denaturatie uit bij 78 °C gedurende 5 minuten, gevolgd door hybridisatie bij 37 °C 's nachts.</li>
	<li>Pak de glijbaan uit de FISH-machine. Gebruik een fijn puntig pincet om het rubbercement voorzichtig te verwijderen.</li>
	<li>Dompel de glijbaan ongeveer 1 of 2 minuten onder in 2x SSC bij kamertemperatuur om de afdekplaat eraf te wassen.</li>
	<li>Was de schuif in 68 °C voorverwarmde 0,4x SSC/0,3% NP-40 buffer in een waterbad gedurende 2 min.<ol>
<li>Bereid 0,4x SSC/0,3% NP-40-oplossing door 20 ml 20x SSC (pH 5,3) grondig te mengen met 950 ml dH2O. Voeg vervolgens 3 ml NP-40 toe en meng grondig totdat het volledig is opgelost. Meet de pH en stel in op 7,0-7,5 met NaOH. Voeg vervolgens dH2O toe om het uiteindelijke volume van de totaaloplossing op 1 l te brengen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Was de glijbanen met 2x SSC gedurende 1 min in een waterbad van 37 °C. Zet rechtop in het donker om 10 min goed te drogen.</li>
	<li>Voeg 10 μL DAPI toe aan het gehybridiseerde gebied en bedek met een coverslip.</li>
</ol>4. FISH-analyse en beeldvorming
<ol><li>Bekijk de gehybridiseerde dia met behulp van een geschikte filterset op een fluorescentiemicroscoop.</li>
	<li>Gebruik een monochromatisch blauw fluorofoor optisch filter om de fluorescentie-intensiteit van de celkern te observeren. Maak celkernbeelden onder een DAPI-filterset.</li>
	<li>Gebruik een chromosoom centromeersonde om te laten zien hoeveel chromosomen een cel bevat. Label CEP17 met groene fluorescentie. Gebruik een spectrumgroen fluorofoor optisch filter om de locatie van CEP17 te observeren. Neem een CEP17-signaalbeeld onder de groene filterset.</li>
	<li>Label het TP53-gen met oranje fluorescentie. Gebruik een spectrum oranje fluorofoor optisch filter om TP53 te observeren. Neem een TP53-signaalbeeld onder deze set.</li>
	<li>Voeg deze drie beelden samen en onderzoek ze op numerieke afwijkingen. OPMERKING: In een normale interfasecel worden twee oranje en twee groene signalen waargenomen in een kern met blauwe fluorescentie, wat wijst op één paar normaal chromosoom 17 (figuur 1).</li>
</ol>

<ol><li>Sonneveld, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+multiple+myeloma+with+high-risk+cytogenetics%3A+a+consensus+of+the+International+Myeloma+Working+Group%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Treatment of multiple myeloma with high-risk cytogenetics: a consensus of the International Myeloma Working Group.</a> Blood. 127, 2955-2962 (2016).</li>
<li>Radbruch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competence+and+competition%3A+the+challenge+of+becoming+a+long-lived+plasma+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Competence and competition: the challenge of becoming a long-lived plasma cell.</a> Nature Reviews Immunology. 6, 741-750 (2006).</li>
<li>Lai, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+cytogenetics+in+multiple+myeloma%3A+a+study+of+151+patients+including+117+patients+at+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Improved cytogenetics in multiple myeloma: a study of 151 patients including 117 patients at diagnosis.</a> Blood. 85 (9), 2490-2497 (1995).</li>
<li>Hallek, M., Bergsagel, P. L., Anderson, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+myeloma%3A+increasing+evidence+for+a+multistep+transformation+process%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Multiple myeloma: increasing evidence for a multistep transformation process.</a> Blood. 91, 3-21 (1998).</li>
<li>Munsh, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+recommendations+for+risk+stratification+in+multiple+myeloma%3A+report+of+the+International+Myeloma+Workshop+Consensus+Panel+2%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Consensus recommendations for risk stratification in multiple myeloma: report of the International Myeloma Workshop Consensus Panel 2.</a> Blood. 117, 4696-4700 (2011).</li>
<li>Gole, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cIg-FISH+On+Patients+with+Multiple+Myeloma+-+A+Modified+and+Simple+Technique+Easily+Incorporated+Into+Routine+Clinical+Service%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">cIg-FISH On Patients with Multiple Myeloma - A Modified and Simple Technique Easily Incorporated Into Routine Clinical Service.</a> Blood. 120, 4792-4792 (2012).</li>
<li>Lee, S. H., Erber, W., Porwit, A., Tomonaga, M., Peterson, L. I. C. S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematology%2C+ICSH+guidelines+for+the+standardization+of+bone+marrow+specimens+and+reports%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Laboratory+Hematology%22%5BJournal%5D)">Hematology, ICSH guidelines for the standardization of bone marrow specimens and reports.</a> International Journal of Laboratory Hematology. 30, 349-364 (2008).</li>
<li>Štifter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+evaluation+of+bone+marrow+aspirate+and+biopsy+is+superior+in+the+prognosis+of+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Combined evaluation of bone marrow aspirate and biopsy is superior in the prognosis of multiple myeloma.</a> Diagnostic Pathology. 5, 30(2010).</li>
<li>Huegel, A., Coyle, L., McNeil, R., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+interphase+fluorescence+in+situ+hybridization+on+direct+hematological+bone+marrow+smears%5BTitle%5D)+AND+%22Pathology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of interphase fluorescence in situ hybridization on direct hematological bone marrow smears.</a> Pathology. 27, 86-90 (1995).</li>
<li>Jacobsson, B., Bernell, P., Arvidsson, I., Hast, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+morphology%2C+esterase+cytochemistry%2C+and+interphase+cytogenetics+of+peripheral+blood+and+bone+marrow+smears%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Classical morphology, esterase cytochemistry, and interphase cytogenetics of peripheral blood and bone marrow smears.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44, 1303-1309 (1996).</li>
<li>Dunning, K., Safo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ultimate+Wright-Giemsa+stain%3A+60+years+in+the+making%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic+%26+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">The ultimate Wright-Giemsa stain: 60 years in the making.</a> Biotechnic & Histochemistry. 86, 69-75 (2011).</li>
<li>Woronzoff-Dashkoff, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+wright-giemsa+stain.+Secrets+revealed%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">The wright-giemsa stain. Secrets revealed.</a> Clinics in Laboratory Medicine. 22, 15-23 (2002).</li>
<li>McPherson, R. A., Pincus, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Henry%27s+Clinical+diagnosis+and+Management+by+Laboratory+Methods+E-book%5BTitle%5D)+AND+%22Elsevier+Health+Sciences%22%5BJournal%5D)">Henry's Clinical diagnosis and Management by Laboratory Methods E-book.</a> Elsevier Health Sciences. , (2017).</li>
<li>Ross, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Report+from+the+European+Myeloma+Network+on+interphase+FISH+in+multiple+myeloma+and+related+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders.</a> Haematologica. 97, 1272-1277 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De toepassing van FISH op genetische risicostratificatie in MM is essentieel. Het kritieke deel van FISH-rapporten zijn niet alle kerncellen, maar klonale pc's die specifiek zijn gezuiverd of geïdentificeerd door te sorteren met anti-CD138 magnetische kralen of te markeren met cytoplasmatische immunoglobuline lichte keten κ of λ. Interphase FISH na PC-sortering of cIg-FISH bleek significant te zijn in de diagnose van MM vanwege het relatief lagere aandeel pc's in de BM. Deze methoden hebben echter enkele tekortkomingen, ...

Multipel myeloom (MM) is een kwaadaardige plasmacelziekte (PC) met een sterke biologische heterogeniteit en grote individuele verschillen in klinische werkzaamheid, met overlevingsperioden variërend van maanden tot decennia. Cytogenetische kenmerken zijn belangrijke prognostische indicatoren van MM. Het risicostratificatiesysteem en geïndividualiseerde behandelingen op basis van genetische kenmerken zijn onderwerpen van intense interesse geworden in klinisch onderzoek naar MM1. De afwijkingen van pc's getest in een fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) paneel van beenmerg (BM) omvatten del 13q14 (RB1), del 17p13 (TP53), t(4;14) (IGH/FGFR3), t(11;14) (IGH/MYEOV), t(14;16) (IGH/MAF), t(14:20) (IGH/MAFB), 1q21 (CKS1B) gain/amplification en 1p (CDKN2C) deletie.
Standaard metafasecytogenetica moet worden opgenomen in de eerste beoordeling van MM-patiënten. Hoewel conventionele G-gestreepte karyotypering het voordeel biedt van een hele chromosoomanalyse, leidt de lage opbrengst van deze methode tot veel vals negatieve resultaten2. Traditioneel worden pc's beschouwd als grotendeels niet in staat om te splitsen omdat ze de eindproducten zijn van B-lymfocytendifferentiatie. Dit maakt het moeilijk om gesplitste afbeeldingen te verkrijgen. Verbeterde cytogenetische analyse in MM met langetermijnculturen (6 dagen) en stimulatie van culturen door cytokines kan een veelbelovende methode zijn voor het identificeren van cytogenetische afwijkingen bij nieuw gediagnosticeerde MM-patiënten3. Zelfs wanneer de kweektijd werd verlengd tot 6 dagen, werden cytogenetische afwijkingen echter nauwkeurig gemeld bij 30% -50% van de MM-patiënten4. Bovendien wordt MM gekenmerkt door complexe cytogenetische aberraties die de prognostische heterogeniteit weerspiegelen. De resolutie van traditionele chromosoombandtechnologie is echter laag, wat gemakkelijk kan leiden tot gemiste detectie van chromosomale afwijkingen in MM.
Interfase FISH, bij voorkeur na CD138-positieve magnetische kraalgebaseerde PC-sortering of markering met cytoplasmatische immunoglobuline lichte keten κ/λ, is onmisbaar bij de analyse van MM5,6. Een CD138-positief geselecteerd monster wordt sterk aanbevolen voor de geoptimaliseerde opbrengst van tumorcellen. Nauwkeurige kwantificering van cytogenetische afwijkingen vereist echter ten minste 4 ml antistollings BM voor pc-sortering. Bovendien verhogen de combinaties van CD138 immunomagnetische kraalsortering met FISH of cytoplasmatische κ / λ lichte keten immunoglobuline met FISH-testen (cIg-FISH) tal van experimentele kosten en zijn tijdrovend.
Meestal wordt de PC-ratio eerst beoordeeld aan de hand van het morfologisch onderzoek van gekleurde BM-uitstrijkjes of BM-biopsiesecties7,8. BM-monsters van de hoogste kwaliteit (eerste mergaspiraatmonsters) worden gebruikt voor morfologische tests, terwijl die welke voor FISH of andere detectie worden verzonden, vaak de secundaire aspiraatmonsters zijn met hoge verdunningsverhoudingen met perifeer bloed.
Al in de jaren 1990 toonden meerdere studies aan dat BM-uitstrijkjes direct kunnen worden gebruikt voor interstitiële FISH-onderzoeken, wat een betrouwbare en herhaalbare methode is gebleken9. Een elegante studie op basis van celmorfologie en esterasecytochemie in combinatie met FISH van perifeer bloed en BM-uitstrijkjes bevestigde de grote klinische betekenis ervan voor het ophelderen van chromosomale afwijkingen bij patiënten met granulocytaire en lymfatische leukemie10.
Hierin bieden we een nieuwe methode voor het verbeteren van het succes van interfase FISH-detectie bij MM-patiënten.

<table><tbody><tr><td>automatic FISH machine</td><td>Leica&nbsp; Corporation</td><td>S500-24</td><td>FINAL Assy Thermobrite 240V</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Abbott Molecular Inc.</td><td>06J49-001</td><td>DAPI Counterstain</td></tr><tr><td>FISH Analysis Software</td><td>IMSTAR&nbsp; Corporation</td><td>IMSTAR</td><td>FISH Analysis Software</td></tr><tr><td>FISH Probe</td><td>Abbott Molecular Inc.</td><td>05N56-020</td><td>Vysis Locus Specifc Identifer TP53 / CEP 17 FISH Probe Kit</td></tr><tr><td>Fixed volume pipette</td><td>Eppendorf China Ltd.</td><td>M33768H</td><td>10&nbsp; microliter</td></tr><tr><td>Fluorescence Microscope</td><td>Olympus Corporation</td><td>BX53</td><td>Forward Fluorescence Microscope</td></tr><tr><td>Karyotype Analysis Software</td><td>IMSTAR&nbsp; Corporation</td><td>IMSTAR</td><td>Karyotype Analysis Software</td></tr><tr><td>Light Microscope</td><td>Olympus&nbsp; Corporation</td><td>BX41</td><td>Forward Light Microscope</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Abbott Molecular Inc.</td><td>07J05-001</td><td>NP-40</td></tr><tr><td>Plastic staining dyeing rack</td><td>Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd.</td><td>RSJ-501</td><td>&nbsp;24 slides</td></tr><tr><td>Plastic staining dyeing tank</td><td>Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd.</td><td>RSJ-516</td><td>&nbsp;24 slides</td></tr><tr><td>Rubber Cement</td><td>Marabu&nbsp;GmbH &amp; Co. KG</td><td>FixoGum&nbsp;</td><td>Rubber Cement</td></tr><tr><td>SSC</td><td>Abbott Molecular Inc.</td><td>02J10-032</td><td>20&times;SSC</td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Shanghai Boxun Medical Bio-Instrument Co., Ltd.</td><td>DK-8D</td><td>Multiple Temperature Water bath</td></tr></tbody></table>

interfase fluorescentie in situ hybridisatie van beenmerguitstrijkjes van multipel myeloom

Interphase Fluorescence in situ Hybridization of Bone Marrow Smears of Multiple Myeloma

Fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) detectie is een onmisbare methode in genetische risicostratificatie bij multipel myeloom (MM), wat een van de meest voorkomende hematologische maligniteiten is. Het identificerende kenmerk van MM is geaccumuleerde kwaadaardige plasmacellen in het beenmerg. FISH-rapporten voor MM richten zich voornamelijk op gezuiverde of geïdentificeerde klonale plasmacellen, in plaats van alle kerncellen, door te sorteren met anti-CD138 magnetische kralen of te markeren met cytoplasmatische immunoglobuline lichte keten κ of λ. Beenmerg interfase kernen worden meestal verkregen uit verse beenmergcellen. Voor een bevredigende verrijking van plasmacelmonsters zijn echter grote hoeveelheden vers heparine-anti-gecoaguleerd beenmerg nodig, die niet kunnen worden verkregen in het geval van moeilijke beenmergextractie of een droge beenmergkraan. Hierin stellen we een nieuwe methode vast om het succes van FISH-detectie op bevlekte of niet-gekleurde beenmerguitstrijkjes te verbeteren. Beenmerguitstrijkjes zijn gemakkelijker te verkrijgen dan anticoaguleerde beenmergspecimens.

Bij de eerste morfologische beoordeling van een nieuw gediagnosticeerde MM-patiënt bleek 15% van de pc's in een BM-uitstrijkje grotere en donkerdere kernen te hebben, samen met grotere hoeveelheden cytoplasma dan normale pc's (figuur 2A). De eerste buis heparine anti-gecoaguleerde BM gedetecteerd door de immunofenotype techniek onthulde slechts 2,3% van de monoklonale afwijkende pc's. CD138 immunomagnetische kraal sortering in combinatie met FISH of de cIg-FISH techniek is essentieel voor he...

Hier presenteren we een protocol voor het verbeteren van het succes van interfase fluorescentie in situ hybridisatiedetectie op beenmerguitstrijkjes van patiënten met multipel myeloom.

Interfase Fluorescentie in situ Hybridisatie van beenmerguitstrijkjes van multipel myeloom

Fluorescence in situ hybridization (FISH) detection is an indispensable method in genetic risk stratification in multiple myeloma (MM), which is one of ...

De toepassing van fluorescentie in situ hybridisatie genaamd FISH op genetische risicostratificatie bij multipel myeloom is essentieel. Het kritieke deel van FISH-rapporten zijn niet alle kerncellen, maar klonale plasmacellen die specifiek zijn gezuiverd of geïdentificeerd door te sorteren met anti-CD138 magnetische kralen of te markeren met cytoplasmatische kappa of Lambda lichte keten immunoglobuline met FISH-testen genaamd cIg FISH. Interfase FISH na plasmacelsortering of cIg FISH blijkt significant te zijn bij de diagnose van multipel myeloom, vanwege een relatief lager aandeel plasmacellen in het beenmerg.Deze methoden hebben echter enkele tekortkomingen, waaronder complexe processen, hoge eisen aan monsters en hoge experimentele kosten. Plasmacellen kunnen snel worden gelokaliseerd in een beenmerguitstrijkje. Op basis hiervan gebruiken we beenmerguitstrijkje FISH voor de detectie van multipele myeloomcellen.Deze studie werd uitgevoerd volgens de principes van de Verklaring van Helsinki en goedgekeurd door de ethische commissie van het Zhongnan-ziekenhuis van de Universiteit van Wuhan. De monsters werden verzameld van een multipel myeloompatiënt op de afdeling Hematologie, Zhongnan Hospital van de Wuhan University of China. Plaats de eerste 0,2 milliliter beenmergoplossing op een schone wegwerpglasplaat, verspreid de beenmerguitstrijkjes tot uniforme dikte en scherpe staarten door het beenmerg snel te verwijderen en droog het vervolgens op natuurlijke wijze.Bedek de beenmergfilms met één milliliter Wright-Giemsa-oplossing gedurende ongeveer 10 seconden bij kamertemperatuur. Voeg een milliliter fosfaatbuffer toe aan de dia's, zorg was vereist om te voorkomen dat de kleurstofoplossing zou uitdrogen of van de dia's zou stromen. Meng de kleurstofoplossing voorzichtig en houd deze 15 minuten op kamertemperatuur.Spoel de glaasjes af met schoon water en droog het in de lucht bij kamertemperatuur. Gebruik voorwaartse lichtmicroscopie om kwaadaardige plasmacellen te detecteren, de plasmacellen moeten goed worden verspreid. Wat we nu in het veld zien, zijn de plasmacellen die redelijk verspreid zijn.Dit is een typische Binuclear kernplasmacel. Bedek het gehybridiseerde gebied met een fixatieve oplossing gedurende 10 minuten om plasmacellen te verkleuren en te fixeren. Spoel de glijbaan af met gedeïoniseerd water en droog het in lucht bij kamertemperatuur.Verwarm een pot met twee keer SSC-buffer voor op 56 graden Celsius in een waterbad. Was het bereide beenmerguitstrijkje gedurende 10 minuten in de voorverwarmde tweemaal SSC-buffer, gevolgd door het dompelen in gedeïoniseerd water bij kamertemperatuur. Droog het uitstrijkje uit in een ethanolgradiënt van 70%85% en 100% ethanol elk gedurende één minuut.Droog het uitstrijkje 10 minuten in de lucht. Voeg eerst TP53 toe op centromeer van chromosoom 17-sondemengsel aan het hybridisatiegebied en bedek het met een afdekslip druk zachtjes op het fijne puntige pincet om luchtbellen van onderaf te verwijderen. Sluit alle zijden van de afdekslip af met rubbercement om een goede dichtheid te garanderen.Na het stollen van het rubbercement werd de glijbaan op een automatische FISH-machine geplaatst denaturatie werd uitgevoerd bij 78 graden Celsius gedurende vijf minuten gevolgd door hybridisatie bij 37 graden Celsius 's nachts. Pak de glijbaan uit de FISH-machine. Gebruik een fijn puntig pincet om het rubbercement voorzichtig te verwijderen.Dompel de schuif ongeveer één of twee minuten onder in twee keer SSC bij kamertemperatuur om de afdekplaat eraf te wassen. Was de glijbaan in 68 graden Celsius voorverwarmbuffer in een waterbad gedurende twee minuten. Was de glaasjes met twee keer SSC gedurende één minuut in een waterbad van 37 graden Celsius.Zet precies in het donker om grondig te drogen gedurende 10 minuten op 10 microliter DAPI naar het gehybridiseerde gebied, bedek met een afdekslip. Bekijk gehybridiseerde dia met behulp van een geschikte filterset op een fluorescentiemicroscoop, gebruik monochromatisch blauw fluorofoor optisch filter om de fluorescentie-intensiteit van de celkern te observeren. Maak celkernbeelden onder een DAPI-filterset.CEP17 werd gelabeld met groene fluorescentie. Gebruik spectrumgroen fluorofoor optisch filter om de locatie van CEP17 te observeren. Neem CEP17 signalenbeeld onder groene filterset.Het TP53-gen werd gelabeld met oranje fluorescentie. Gebruik spectrum oranje fluorofoor optisch filter om TP53 te observeren, neem TP53-signalen beeld onder de set, voeg deze drie beelden samen tot een geheel en onderzoek naar numerieke afwijkingen. In een normale interfasecel worden twee oranje en twee groene signalen waargenomen in een kern met blauwe fluorescentie die wijst op één paar normale chromosomen 17.De resultaten toonden de morfologie en genetica van beenmerg bij een multipel myeloompatiënt. Figuur A toonde aan dat 15% van de plasmacellen in een beenmerguitstrijkje groter en donkerder en nucleair bleken te hebben, samen met grote hoeveelheden cytoplasma dan normaal. Figuur B toonde een grijsschaalbeeld van representatief door een kernvormige plasmacel in een beenmerguitstrijkje.Figuur C toonde vier oranje en vier groene signalen in één interfasekern van plasmacel, wat suggereert dat vier kopieën van chromosoom 17 gelokaliseerd waren in een kern. Figuur D toonde aan dat het abnormale chromosoomkaryogram van deze patiënt twee paar chromosomen 17 in één kern bevestigde. Beenmerguitstrijkjes zijn veel gemakkelijker te verkrijgen dan antistollingsbeenmonsters, omdat het verkrijgen van antistollingsbeendervelg complexe procedures vereist om de kern te verkrijgen.Daarom hebben we een overtuigende methode ontwikkeld voor beenmerguitstrijkje FISH voor de detectie van multipele myeloomcellen.

interphase-fluorescence-situ-hybridization-bone-marrow-smears

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

This video describes the technique of aspirating bone marrow from iliac spine and smear preparation for biopsy. In the example, we perform bone marrow aspiration from an acute myeloid leukemia (AML) patient and examine the cells to check for measurable residual disease (MRD), an important prognostic biomarker.

Bone Marrow Aspiration: A Method to Obtain Bone Marrow to Examine Cell Morphology

Complex weefsel massa, van organen tumoren, zijn samengesteld uit verschillende cellulaire elementen. We opgehelderd de bijdrage van cellulaire fenotypes binnen een weefsel met behulp van multi-gelabelde fluorescerende transgene muizen in combinatie met multiparameter immunofluorescentiekleuring gevolgd door spectrale unmixing naar cel oorsprong evenals karakteristieken van de cel op basis van eiwit expressie ontcijferen.

Kwantitatieve Multispectral Analyse Na Fluorescent Tissue Transplantatie voor Visualisatie van de Cel Origins, types en interacties

Er wordt een strategie gepresenteerd om histologisch data in het beenmerg kwantitatief te analyseren. Confocale microscopie van fluorescent gelabelde cellen in weefselsecties resulteert in 2-dimensionale beelden, die automatisch worden geanalyseerd. Co-lokalisatieanalyses van verschillende celtypen worden vergeleken met gegevens van gesimuleerde beelden, waardoor kwantitatieve informatie over cellulaire interacties wordt verkregen.

Geautomatiseerde kwantificering van hematopoietische cellen - stromale cel interacties in histologische afbeeldingen van ontkalkte Bone

We beschrijven een hoge-doorvoer geneesmiddelgevoeligheidstest voor primaire multiple myeloomcellen. Het bestaat uit een reconstructie van de beenmergomgeving (inclusief extracellulaire matrix en stroma) in platen met meerdere putjes, en een niet-invasieve methode voor longitudinale kwantificering van celviabiliteit.

Een Organotypische High Throughput systeem voor de karakterisering van de Drug gevoeligheid van Primary Multiple Myeloma cellen

Intravital fluorescentie microscopie (IVFM) van de calvarium wordt toegepast in combinatie met genetische diermodellen om de homing en engraftment van hematopoietische cellen in het beenmerg (BM) niches te studeren.

Intravital Fluorescent microscopie (IVFM) te combineren met genetische modellen om te studeren van Engraftment dynamiek van hematopoietische cellen aan het beenmerg Niches

Het huidige protocol beschrijft de bruikbaarheid van meervoudige fluorescentie in situ hybridisatie (mFISH) en spectraal karyotypering (SKY) bij het identificeren van inter-chromosomale stabiele afwijkingen in de beenmergcellen van muizen na blootstelling aan totale lichaamsbestraling.

Detectie van Inter-chromosomale Stable aberraties door Multiple Fluorescentie<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie (mFISH) en Spectral Karyotypering (SKY) in bestraalde muizen

Detectie van minimale of meetbare residuele ziekte (MRD) is een belangrijke voorspellende biomarker voor risico-evaluatie te verfijnen en het voorspellen van herval in acute myeloïde leukemie (AML). Deze uitgebreide richtlijnen en aanbevelingen met de best practices voor consistente en accurate identificatie en opsporing van MRD, kan steun bij het maken van effectieve AML behandelingsbeslissingen.

Uitgebreide Protocol bij monster en proces beenmerg voor het meten van meetbare residuele ziekte en leukemische cellen van de stam in Acute myeloïde leukemie

Hier beschrijven we een protocol voor multiplex fluorescerende immunohistochemische kleuring en imaging voor de gelijktijdige localisatie van meerdere kanker-geassocieerde antigenen in lymfoom. Dit protocol kan worden uitgebreid tot de colocalization analyse van biomarkers binnen alle weefselsecties.

Multiplexed fluorescerende immunohistochemische kleuring, Imaging en analyse in histologische monsters van lymfoom

Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd om micro-omgevingspopulaties in het beenmerg te isoleren en te karakteriseren op basis van muizenmodellen van myelodysplastische syndromen en acute myeloïde leukemie. Deze techniek identificeert veranderingen in de niet-hematopoëtische beenmergniche, inclusief de endotheliale en mesenchymale stromale cellen, met ziekteprogressie.

Identificatie van micro-omgevingspopulaties in het beenmerg bij myelodysplastisch syndroom en acute myeloïde leukemie

Hier wordt een op fosfoflowcytometrie gebaseerde methode beschreven om de signalering stroomafwaarts van de mTORC1-, JAK/STAT5- en MAPK-routes te analyseren in acute menselijke myeloïde leukemiecellen die xenotransplanteerd zijn in muizen en verkregen uit beenmergaspiraten. p-STAT5-, p-4EBP1-, p-RPS6- en p-ERK1/2-niveaus worden tegelijkertijd gemeten met behulp van een spectrale flowcytometer van de volgende generatie met hoge gevoeligheid.

Intracellulaire fosfoflowcytometrie van acute myeloïde leukemie Patiënt-afgeleide xenotransplantaties

Leer interphase FISH-detectie op beenmerguitstrijkjes voor multipel myeloom met anti-CD138 magnetische kralen. Deze methode verbetert de identificatie van klonale plasmacellen en vermindert specimenkosten.

Interfase Fluorescentie in situ Hybridisatie van beenmerguitstrijkjes van multipel myeloom

Meer video's verkennen