Name: De op microscopie gebaseerde test om de recycling-endosomen te bestuderen en te analyseren met behulp van SNARE-handel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Leer hoe je recycling-endosomen bestudeert in muismelanocyten met behulp van immunofluorescentiemicroscopie en GFP-STX13-markering. Deze methode onthult de dynamiek van endosomale transportprocessen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het Department of Biotechnology (BT/PR32489/BRB/10/1786/2019 aan SRGS); Onderzoeksraad voor Wetenschap en Techniek (CRG/2019/000281 SRGS); DBT-NBACD (BT/HRD-NBA-NWB/38/2019-20 naar SRGS) en IISc-DBT partnerschapsprogramma (naar SRGS). De infrastructuur op de afdeling werd ondersteund door DST-FIST, DBT en UGC. AMB werd ondersteund door DBT-JRF (DBT/2015/IISc/NJ-02).

Het protocol omvat het zaaien van melanocyten gevolgd door transfectie van de plasmiden. Verdere stappen omvatten fixatie, immunostaining, beeldvorming en analyse van de cellen om de lengte en het aantal RE's te meten. De gedetailleerde beschrijving van het protocol wordt hieronder gegeven.
1. Zaaien van muizenmelanocyten op voorbehandelde coverslips
<ol><li>Bestrijk de glazen afdekplaten in een petrischaaltje (d.w.z. 4 - 5 in een schaal van 35 mm) met keldermembraanmatrixmedium (1:20 in volledig RPMI-medium: RPMI + 10% warmte-geïnactiveerd FBS + 1x Glutamine + 1x Antibioticamengsel) en droog het gedurende 15 minuten in de weefselkweekkap. Was de coverslips voor gebruik één keer met 1x PBS.</li>
	<li>Bewaar de wild type muismelanocyten (melan-Ink4a-Arf-1 van C57BL/6J, a/a, Ink4a-Arf-/- muizen, beschreven in 20 en verkrijgbaar bij The Welcome Trust Functional Genomics Cell Bank) in een petrischaaltje (d.w.z. 35 of 60 mm schaal) aangevuld met volledig RPMI-medium.<ol>
<li>Was de cellen tweemaal met 1x PBS en voeg 0,5 of 1 ml Trypsine-EDTA (0,25%) oplossing voor trypsiniserende cellen toe. Incubeer de cellen bij 37 °C gedurende 2 - 5 minuten voor het losmaken van de petrischaal.</li>
		<li>Voeg 1 - 2 ml volledig RPMI-medium toe, suspensie en breng de cellen vervolgens over naar een centrifugebuis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugeer de celsuspensie bij 4 °C, 376 x g gedurende 5 minuten en resuspend de pellet vervolgens in 1x PBS.</li>
	<li>Herhaal de centrifugatiestap en resuspend de cellen in 1 ml volledig RPMI-medium.</li>
	<li>Zaai de cellen op het keldermembraan medium-gecoate coverslips met 50-60% confluentie (ongeveer 6 x 105 cellen op een 35 mm celkweekschaal met 4 - 5 coverslips). Voeg altijd 200 nM PMA (voeg 5 μL werkvoorraad 40 μM phorbol 12-myristaat 13-acetaat toe) toe aan de vergulde celsuspensie in volledig RPMI-medium.</li>
	<li>Incubeer na het zaaien de plaat bij 37 °C gedurende 12- 24 uur.</li>
</ol>2. Transfectie van cellen met de STX13 plasmiden
<ol><li>Gebruik de volgende reagentia: pEGFP-C1-STX13WT en pEGFP-C1-STX13Δ129 (beschreven in12). mCherry-Rab11, was een vriendelijk geschenk van Graça Raposo, Institut Curie, Parijs (beschreven in referentie19). Anti-TYRP1 antilichaam van ATCC (TA99).</li>
	<li>Na 12 - 24 uur zaaien, transfecteer de cellen met plasmiden met behulp van een op lipiden gebaseerd transfectiereagens. Neem voor een schotel van 35 mm 5 μL van het transfectiereagens in 250 μL OPTI-MEM-medium in een microcentrifugebuis en neem ongeveer 200 ng van elk plasmide in 250 μL OPTI-MEM.</li>
	<li>Incubeer de buisjes met DNA en het transfectiereagens gedurende 5 minuten. Meng zonder herhaald pipetteren (totaal volume zal ongeveer 500 μL zijn). Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Voer elke 10 minuten gedurende 30 minuten met de hand tikken op de buis uit bij RT.</li>
	<li>Was de cellen tijdens de incubatie twee keer met 1x PBS, één keer met OPTI-MEM en voeg vervolgens 1 ml OPTI-MEM toe aan de cellen.</li>
	<li>Voeg na 30 minuten incubatie het transfectiereagens-DNA-mengsel druppelsgewijs toe aan de cellen door de schaal te bedekken.</li>
	<li>Incubeer de cellen bij 37 °C gedurende 6 uur. Zuig het OPTI-MEM medium aan met transfectiereagens en voeg het volledige RPMI medium aangevuld met 200 nM PMA toe.</li>
	<li>Incubeer de cellen bij 37 °C gedurende 48 uur.</li>
</ol>3. Fixatie van de cellen
OPMERKING: De volgende procedure wordt uitgevoerd buiten de weefselkweekkap.
<ol><li>Na 48 uur transfectie, was de cellen tweemaal met 1x PBS en fixeer de cellen vervolgens met 3% formaldehyde (vers bereid in 1x PBS) gedurende 30 minuten.</li>
	<li>Was de cellen na fixatie twee keer met 1x PBS en bewaar de coverslips in 1x PBS tot verder gebruik. Als alternatief kunnen cellen op glazen platen worden gemonteerd (zie hieronder) of worden opgeslagen bij 4 °C.</li>
</ol>4. Immunostaining van de cellen
<ol><li>Bereid een vochtige kamer voor: plaats paraffinefilm gesneden stuk op vochtig filterpapier in een petrischaal, bedekt met aluminiumfolie.</li>
	<li>Bereid 25 μL primaire antilichaamoplossing (0,2% saponine in 1x PBS, 0,1% BSA in 1x PBS en 0,02% natriumazide in 1x PBS). Voeg antilichaam toe bij een verdunning van 1:200. Voeg deze oplossing toe als druppel op een paraffinefilm in de vochtige kamer.</li>
	<li>Til de deklip voorzichtig op met een tang, keer deze om op deze druppel primaire antilichaamkleuringsoplossing en bedek vervolgens het deksel van de vochtige kamer. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min.</li>
	<li>Bereid op dezelfde manier de secundaire antilichaamoplossing met een verdunning van 1:500 en plaats deze op paraffinefilm naast de dekplaat in de vochtige kamer. Voeg voor het kleuren van de kern DAPI (1:20.000 tot 1:30.000) toe aan de oplossing.</li>
	<li>Pak met behulp van een tang voorzichtig de deklip van de primaire antilichaamoplossing en dompel deze driemaal in 1x PBS (in een glazen bekerglas).</li>
	<li>Tik op de coverslip op tissuepapier om de overtollige PBS op de coverslip te verwijderen. Plaats het op secundaire antilichaamkleuringsoplossing in de vochtige kamer en stel het niet bloot aan licht vanwege de aanwezigheid van fluorescerend gelabelde antilichamen in de oplossing.</li>
	<li>Incubeer de coverslip opnieuw gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Houd altijd een notitie aan de zijkant van de coverslip die de cellen tijdens deze stappen heeft.</li>
	<li>Pak na de incubatie voorzichtig de coverslip van de secundaire antilichaamoplossing en dompel deze vervolgens driemaal in 1x PBS. Tik verder op de coverslip op tissuepapier om de overtollige PBS op de coverslip te verwijderen.</li>
	<li>Plaats 12 μL Fluoromount-G montagereagens op een glasplaat en plaats voorzichtig de gebrandschilderde afdekkingslip (naar het glas gericht) op het montagereagens. Keer de glasplaat om op tissuepapier en druk vervolgens zachtjes aan.</li>
</ol>5. Fluorescentiemicroscopie van de cellen
<ol><li>Stel de gekleurde cellen onder Bright-field (BF) en fluorescentie (IF) filters in beeld met behulp van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop uitgerust met een CCD-camera met behulp van 60x (olie) apochromatische objectieven of een andere microscoop met een vergelijkbare configuratie.</li>
</ol>6. Kwantificering van de overlap tussen de RE gelokaliseerde eiwitten en melanosomen:
OPMERKING: De volgende stappen worden gevolgd voor de kwantificering van mander's overlapcoëfficiënt tussen de eiwitten met behulp van Fiji software (vrij te downloaden via de link: https://imagej.net/software/fiji/). Gebruik de TIFF-afbeelding met meerdere kanalen.
<ol><li>
Open de RAW-afbeelding. Ga naar de optie Afbeelding en selecteer Kleur | Splits kanalen en gebruik de twee kanalen voor analyse.</li>
	<li>Open de JACoP-plug-in in de optie Plug-in.</li>
	<li>Stel de drempel voor beide kanalen zo in dat alle lichtpuntjes worden geselecteerd en de achtergrond wordt geëlimineerd.</li>
	<li>Ga naar de optie Analyse, selecteer M1- en M2-coëfficiënten om de overlapcoëfficiënt van Mander te krijgen.</li>
	<li>Druk op de optie Analyseren in de JACoP-plug-in en zie het resultaat dat de overlapcoëfficiënt van Mander weergeeft.</li>
</ol>7. Kwantificering van het buisvormige aantal en de lengte van recycling-endosomen:
OPMERKING: De volgende stappen worden gevolgd voor de kwantificering van het aantal en de lengte van de tubuli met behulp van Fiji-software.
<ol><li>Open de raw-afbeelding Ga naar afbeelding optie, selecteer Kleur | Splits kanalen en gebruik het gewenste kanaal voor analyse.</li>
	<li>Ga nogmaals naar Afbeelding , selecteer Type | Converteren naar 8-bits afbeelding.</li>
	<li>Ga vervolgens naar Plug-ins, selecteer | analyseren Tubeness. Stel sigmawaarde in op 0,1075 . Druk op OK.</li>
	<li>Ga nogmaals naar Afbeelding , selecteer Type | Converteren naar 8 bit afbeelding.</li>
	<li>Ga naar Afbeelding | | aanpassen Drempelwaarde (Gebruik dezelfde drempelwaarden voor alle afbeeldingen. Afbeeldingen moeten ongeveer dezelfde intensiteit hebben).</li>
	<li>Ga naar proces- | Binaire | Converteren naar masker.</li>
	<li>Ga naar Proces, selecteer Binair en selecteer vervolgens Skeletonize.</li>
	<li>Ga naar Analyseren, selecteer Skelet en kies Skelet analyseren. In resultaat en uitvoer selecteert | (a) Bereken het grootste kortste pad | (b) toon gedetailleerde informatie | (c) geef het gelabelde skelet weer. Druk op OK. OPMERKING: Het resultaat wordt geopend in de tabelindeling. De kolom Gemiddelde taklengte toont de lengte van alle verschillende buisjes in de geselecteerde cel (stel schaal in voor het verkrijgen van waarden in micrometers).</li>
	<li>Als u het aantal buisjes in de cel wilt verkrijgen, gaat u naar Analyseren en selecteert u de optie Deeltje analyseren . Druk op OK. OPMERKING: In de verkregen resultaten toont de telkolom het aantal tubuli in die specifieke cel.</li>
	<li>Sla de gegevens op en analyseer.</li>
</ol>

<ol><li>Dell'Angelica, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+building+BLOC%28k%29s+of+lysosomes+and+related+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The building BLOC(k)s of lysosomes and related organelles.</a> Current Opinion in Cell Biology. 16 (4), 458-464 (2004).</li>
<li>Raposo, G., Marks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanosomes--dark+organelles+enlighten+endosomal+membrane+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Melanosomes--dark organelles enlighten endosomal membrane transport.</a> Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 8 (10), 786-797 (2007).</li>
<li>Ohbayashi, N., Fukuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+understanding+the+molecular+basis+of+melanogenesis+in+melanocytes%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Recent advances in understanding the molecular basis of melanogenesis in melanocytes.</a> F1000Research. 9, F1000 Faculty Rev-608 (2020).</li>
<li>Theos, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+adaptor+protein+%28AP%29-3+and+AP-1+in+tyrosinase+sorting+from+endosomes+to+melanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Functions of adaptor protein (AP)-3 and AP-1 in tyrosinase sorting from endosomes to melanosomes.</a> Molecular Biology of the Cell. 16 (11), 5356-5372 (2005).</li>
<li>Di Pietro, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLOC-1+interacts+with+BLOC-2+and+the+AP-3+complex+to+facilitate+protein+trafficking+on+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">BLOC-1 interacts with BLOC-2 and the AP-3 complex to facilitate protein trafficking on endosomes.</a> Molecular Biology of the Cell. 17 (9), 4027-4038 (2006).</li>
<li>Setty, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLOC-1+is+required+for+cargo-specific+sorting+from+vacuolar+early+endosomes+toward+lysosome-related+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">BLOC-1 is required for cargo-specific sorting from vacuolar early endosomes toward lysosome-related organelles.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (3), 768-780 (2007).</li>
<li>Delevoye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AP-1+and+KIF13A+coordinate+endosomal+sorting+and+positioning+during+melanosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">AP-1 and KIF13A coordinate endosomal sorting and positioning during melanosome biogenesis.</a> Journal of Cell Biology. 187 (2), 247-264 (2009).</li>
<li>Bultema, J. J., Ambrosio, A. L., Burek, C. L., Di Pietro, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLOC-2%2C+AP-3%2C+and+AP-1+proteins+function+in+concert+with+Rab38+and+Rab32+proteins+to+mediate+protein+trafficking+to+lysosome-related+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">BLOC-2, AP-3, and AP-1 proteins function in concert with Rab38 and Rab32 proteins to mediate protein trafficking to lysosome-related organelles.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (23), 19550-19563 (2012).</li>
<li>Sitaram, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+recognition+of+a+dileucine-based+sorting+signal+by+AP-1+and+AP-3+reveals+a+requirement+for+both+BLOC-1+and+AP-3+in+delivery+of+OCA2+to+melanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Differential recognition of a dileucine-based sorting signal by AP-1 and AP-3 reveals a requirement for both BLOC-1 and AP-3 in delivery of OCA2 to melanosomes.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (16), 3178-3192 (2012).</li>
<li>Nag, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab4A+organizes+endosomal+domains+for+sorting+cargo+to+lysosome-related+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Rab4A organizes endosomal domains for sorting cargo to lysosome-related organelles.</a> Journal of Cell Science. 131 (18), (2018).</li>
<li>Dennis, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLOC-2+targets+recycling+endosomal+tubules+to+melanosomes+for+cargo+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">BLOC-2 targets recycling endosomal tubules to melanosomes for cargo delivery.</a> Journal of Cell Biology. 209 (4), 563-577 (2015).</li>
<li>Jani, R. A., Purushothaman, L. K., Rani, S., Bergam, P., Setty, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STX13+regulates+cargo+delivery+from+recycling+endosomes+during+melanosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">STX13 regulates cargo delivery from recycling endosomes during melanosome biogenesis.</a> Journal Cell Science. 128 (17), 3263-3276 (2015).</li>
<li>Shakya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab22A+recruits+BLOC-1+and+BLOC-2+to+promote+the+biogenesis+of+recycling+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Rab22A recruits BLOC-1 and BLOC-2 to promote the biogenesis of recycling endosomes.</a> EMBO Reports. 19 (12), 45918(2018).</li>
<li>Bowman, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+BLOC-1-AP-3+super-complex+sorts+a+cis-SNARE+complex+into+endosome-derived+tubular+transport+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A BLOC-1-AP-3 super-complex sorts a cis-SNARE complex into endosome-derived tubular transport carriers.</a> Journal of Cell Biology. 220 (7), 202005173(2021).</li>
<li>Wei, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hermansky-Pudlak+syndrome%3A+a+disease+of+protein+trafficking+and+organelle+function%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Hermansky-Pudlak syndrome: a disease of protein trafficking and organelle function.</a> Pigment Cell Research. 19 (1), 19-42 (2006).</li>
<li>Bowman, S. L., Bi-Karchin, J., Le, L., Marks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+road+to+lysosome-related+organelles%3A+Insights+from+Hermansky-Pudlak+syndrome+and+other+rare+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The road to lysosome-related organelles: Insights from Hermansky-Pudlak syndrome and other rare diseases.</a> Traffic. 20 (6), 404-435 (2019).</li>
<li>Prekeris, R., Klumperman, J., Chen, Y. A., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syntaxin+13+mediates+cycling+of+plasma+membrane+proteins+via+tubulovesicular+recycling+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Syntaxin 13 mediates cycling of plasma membrane proteins via tubulovesicular recycling endosomes.</a> Journal of Cell Biology. 143 (4), 957-971 (1998).</li>
<li>Mahanty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab9A+is+required+for+delivery+of+cargo+from+recycling+endosomes+to+melanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Melanoma+Research%22%5BJournal%5D)">Rab9A is required for delivery of cargo from recycling endosomes to melanosomes.</a> Pigment Cell Melanoma Research. 29 (1), 43-59 (2016).</li>
<li>Delevoye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recycling+endosome+tubule+morphogenesis+from+sorting+endosomes+requires+the+kinesin+motor+KIF13A%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Recycling endosome tubule morphogenesis from sorting endosomes requires the kinesin motor KIF13A.</a> Cell Reports. 6 (3), 445-454 (2014).</li>
<li>Ha, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARF+functions+as+a+melanoma+tumor+suppressor+by+inducing+p53-independent+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">ARF functions as a melanoma tumor suppressor by inducing p53-independent senescence.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 104 (26), 10968-10973 (2007).</li>
<li>Soldati, T., Schliwa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Powering+membrane+traffic+in+endocytosis+and+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Powering membrane traffic in endocytosis and recycling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (12), 897-908 (2006).</li>
<li>Grant, B. D., Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+and+mechanisms+of+endocytic+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pathways and mechanisms of endocytic recycling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 597-608 (2009).</li>
<li>Hsu, V. W., Prekeris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+at+the+recycling+endosome%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Transport at the recycling endosome.</a> Current Opinion in Cell Biology. 22 (4), 528-534 (2010).</li>
<li>Taguchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+recycling+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of recycling endosomes.</a> Journal of Biochemistry. 153 (6), 505-510 (2013).</li>
<li>Goldenring, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recycling+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Recycling endosomes.</a> Current Opinion in Cell Biology. 35, 117-122 (2015).</li>
<li>Delevoye, C., Marks, M. S., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosome-related+organelles+as+functional+adaptations+of+the+endolysosomal+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Lysosome-related organelles as functional adaptations of the endolysosomal system.</a> Current Opinion in Cell Biology. 59, 147-158 (2019).</li>
<li>Hsu, V. W., Bai, M., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+active%3A+protein+sorting+in+endocytic+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Getting active: protein sorting in endocytic recycling.</a> Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 13 (5), 323-328 (2012).</li>
<li>Desfougeres, Y., D'Agostino, M., Mayer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+tethering+complex+for+endosomal+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A modular tethering complex for endosomal recycling.</a> Nature Cell Biology. 17 (5), 540-541 (2015).</li>
<li>Le, L., Sires-Campos, J., Raposo, G., Delevoye, C., Marks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanosome+biogenesis+in+the+pigmentation+of+mammalian+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Integrated+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Melanosome biogenesis in the pigmentation of mammalian skin.</a> Integrated Computational Biology. 61 (4), 1517-1545 (2021).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.

Recycling-endosomen zijn een cohort van endocytische organellen en ze bemiddelen de recycling van lading naar het celoppervlak in alle celtypen21,22,23,24,25. In gespecialiseerde celtypen zoals melanocyten leiden deze organellen hun smokkelroute gedeeltelijk om naar de melanosomen voor hun biogenese3,16,26.<...

Biosynthese van melaninepigmenten vindt plaats in melanosomen, een melanocyt-specifiek lysosoom-gerelateerd organel (LRO) dat naast conventionele lysosomen bestaat. Het endocytische systeem speelt een sleutelrol in de biogenese van melanosomen, die nodig zijn voor huidskleur en fotoprotectie tegen ioniserende straling1,2,3. Tijdens dit proces worden de melaninesynthetiserende enzymen gesorteerd op vroege / sorteer-endosomen en vervolgens getransporteerd naar premature melanosomen via tubulaire of vesiculaire endosomen die recycling-endosomen (RE's) worden genoemd 4,5,6,7,7,8,9,10. De targeting en fusie van deze organellen reguleren de rijping van volledig functionele gepigmenteerde melanosomen7,11,12,13,14. Defecten in de vorming van deze organellen of ladingssortering naar deze organellen veroorzaken oculocutaan albinisme en andere klinische fenotypen, waargenomen bij Hermansky-Pudlak-syndroom15,16.
Hier beschrijven we een eenvoudige op microscopie gebaseerde techniek om de RE's te bestuderen en te analyseren. Bij deze methode hebben we gebruik gemaakt van een transmembraaneiwit, Qa-SNARE Syntaxin (STX)13, dat zich bevindt op het recyclen van endosomen17 en cycli tussen het sorteren van endosomen en melanosomen in melanocyten12,18. Verder zorgt het verwijderen van N-terminaal ongestructureerd regulerend domein (namelijk SynN of STX13Δ129) ervoor dat de SNARE vast komt te zitten in melanosomen, die de voorwaartse smokkelroute naar het melanosoom meet12. We hebben een bekende recycling endosomale marker Rab GTPase (Rab)11 gebruikt in onze studies14,19. Fluorescentiebeeldvorming van de eiwitten GFP-STX13WT, GFP-STX13Δ129, mCherry-Rab11 en TYRP1 in melanocyten van het wilde type, gevolgd door kwantificering van hun relatieve lokalisatie, zal de aard en dynamiek van RE's bieden naast hun targeting op melanosomen. Dit is dus een eenvoudige techniek die kan worden gebruikt om de dynamiek van RE's in melanocyten te visualiseren en te meten.

<table><tbody><tr><td>anti-TYRP1 antibody (TA99)</td><td>ATCC</td><td>HB-8704</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11668-500</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel matrix</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>022600-050</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristate 13-acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31800-022</td><td></td></tr></tbody></table>

de op microscopie gebaseerde test om de recycling-endosomen te bestuderen en te analyseren met behulp van snare-handel

The Microscopy-Based Assay to Study and Analyze the Recycling Endosomes using SNARE Trafficking

Recycling-endosomen (RE's) zijn tubulair-vesiculaire organellen die worden gegenereerd uit vroege / sorterende endosomen in alle celtypen. Deze organellen spelen een sleutelrol in de biogenese van melanosomen, een lysosoom-gerelateerd organel geproduceerd door melanocyten. RE's leveren de melanocyt-specifieke lading aan premature melanosomen tijdens hun vorming. Blokkering bij het genereren van RE's, waargenomen bij verschillende mutanten van het Hermansky-Pudlak-syndroom, resulteert in hypopigmentatie van huid, haar en ogen. Daarom is het bestuderen van de dynamiek (zie aantal en lengte) van RE's nuttig om de functie van deze organellen in normale en ziekteomstandigheden te begrijpen. In deze studie willen we de RE-dynamiek meten met behulp van een resident SNARE STX13.

Kwantificering van STX13Δ129 mutante lokalisatie naar de melanosomen Immunofluorescentiemicroscopie van STX13 in muiswildtype melanocyten toonde GFP-STX13WT gelokaliseerd als vesiculaire en buisvormige structuren en GFP-STX13Δ129 gelokaliseerd als ringachtige structuren naast het celoppervlak (figuur 1A). Verder toonde intracellulair ringachtig GFP-STX13Δ129 colocalisatie met het melanosoomeiwit TYRP1 (<st...

Recycling endosomen maken deel uit van het endosomale buisvormige netwerk. Hier presenteren we een methode om de dynamiek van recycling-endosomen te kwantificeren met behulp van GFP-STX13 als organelmarker.

De op microscopie gebaseerde test om de recycling-endosomen te bestuderen en te analyseren met behulp van SNARE-handel

Recycling endosomes (REs) are tubular-vesicular organelles generated from early/sorting endosomes in all cell types. These organelles play a key role in ...

De op microscopie gebaseerde test om de recycling-endosomen te bestuderen en te analyseren met behulp van SNARE-handel. Dit zijn huidmelanocyten. De zwartgekleurde organellen die je in de cellen ziet, worden melanosomen genoemd.Melanosomen staan bekend als een klasse van organellen genaamd lysozome gerelateerde organellen of LRO. Recycling-endosomen zijn buisvormige vesiculaire organellen van vroege of sorteer-endosomen in alle celtypen. Deze organellen spelen een sleutelrol in de biogenese van melanosomen, een lysozome-gerelateerd organel geproduceerd door melanocyten.Recyclage-endosomen leveren de melanocyt-specifieke lading aan premature melanosomen tijdens hun vorming. de generatie van recycling-endosomen waargenomen in verschillende syndroom is cellen in hyperpigmentatie van huid, haar en oog. Daarom is het bestuderen van de dynamiek van recycling-endosomen nuttig om de functie van deze organellen in normale en ziekteomstandigheden te begrijpen.Deze studie heeft tot doel de dynamiek van recycling-endosomen te meten met behulp van arresterende SNARE-syntaxin-13. De eerste stap is het zaaien van muizenmelanocyten op voorbehandelde coverslips. Bekleed de glazen afdekplaten in petrischaal in keldermembraanmatrixmedium.En droog het 15 minuten in de weefselkweekkap. Was de coverslips eenmaal met 1X PBS voor gebruik. Zaai de cellen op het keldermembraan medium gecoate coverslips op 50 tot 60% competentie.Voeg altijd 200 nanomol PMA toe aan de vergulde celsuspensie in volledige RPMI-media. Na het zaaien van de cellen, incubeer de schaal met cellen in CO2-incubator gedurende 12 tot 24 uur. De tweede stap is de transfectie van cellen met syntaxin-13 plasmiden.Incubeer de uiteinden met DNA en transfectiereagens, meng gedurende vijf minuten en meng zonder herhaaldelijk pipetteren. Tik elke tien minuten met de hand op de buis gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Was de cellen tijdens de incubatie twee keer met 1X PBS, één keer met OPTI-MEM en voeg vervolgens 1 mil OPTI-MEM toe aan de cellen.Voeg na 30 minuten incubatie het transfectiereagens DNA-mengsel op een druppelsgewijze manier toe aan de cellen door de schaal te bedekken. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius gedurende zes uur. Zuig het OPTI-MEM medium aan met transfectiereagens en voeg een compleet RPMI medium toe aangevuld met 200 nanomol PMA.Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius gedurende 48 uur. De derde stap is fixatie van de cellen. Houd er rekening mee dat de volgende procedure buiten de weefselkweekkap wordt uitgevoerd.Na 48 uur transfectie, was de cellen twee keer met 1X PBS en fixeer de cellen vervolgens met 3% formaldehyde gedurende 30 minuten. Was de cellen na fixatie twee keer met 1X PBS en bewaar de coverslips in 1X PBS tot verder gebruik. Als alternatief kunnen cellen op glasplaten worden gemonteerd of bij vier graden Celsius worden opgeslagen.De vierde stap is immunostaining van de cellen. Bereid een vochtige kamer voor. Leg het gesneden stuk parafilm op een muisfilterpapier in een petrischaaltje.Dek af met aluminiumfolie. Bereid 25 microliter primaire antilichaamoplossing voor. Voeg antilichaam toe bij een verdunning van één tot 200.Voeg deze oplossing toe als druppel op de parafilm in de vochtige kamer. Til de deklip voorzichtig op met een tang. Keer het om op de druppel primaire antilichaamkleuringsoplossing en bedek vervolgens het deksel van de vochtige kamer.Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Bereid op dezelfde manier de secundaire antilichaamoplossing bij een verdunning van één tot 500 en plaats deze op de parafilm naast de dekplaat in de vochtige kamer. Voeg voor het kleuren van de kern DAPI met een verdunning van 120.000 tot 130.000 toe aan de oplossing.Pak met behulp van een tang voorzichtig de coverslip van de primaire antilichaamoplossing en dompel deze twee keer in 1X PBS. Tik op de coverslip op tissuepapier om de overtollige PBS op de coverslip te verwijderen. Plaats het op de secundaire antilichaamkleuringsoplossing in de vochtige kamer en stel het niet bloot aan het licht, vanwege de aanwezigheid van fluorescerend geverfde antilichamen in de oplossing.Pak na de incubatie voorzichtig de coverslip van de secundaire antilichaamoplossing en dompel deze vervolgens twee keer in 1X PBS. Tik verder op de coverslip op tissuepapier om de overtollige PBS op de coverslip te verwijderen. Plaats 12 microliter beeldreagens op een glasplaat en plaats de gebrandschilderde afdekkingslip voorzichtig op het montagereagens.Keer de glasplaat om op het vloeipapier en druk vervolgens zachtjes aan. Stel vervolgens de coverslip af met behulp van een fluorescentiemicroscoop en analyseer de afbeeldingen met ImageJ. De zesde stap is de kwantificering van de overlap tussen de recycling endosome gelokaliseerde eiwitten en melanosomen.Kwantificering van syntaxin-13 delta-129 colocalisatie met de melanosomen. Immunofluorescentiemicroscopie van syntaxin-13 in wildtype melanocyten van muizen toonde GFP-syntaxin-13 wild-type gelokaliseerd als vesiculaire en buisvormige structuren. En GFP-syntaxin-13 delta-129 lokaliseert ringachtige structuren naast het celoppervlak.Verder vertoonde intracellulaire ringachtige GFP-syntaxin-13 delta-129 colocalisatie met het melanosoomeiwit TYRP1 in heldere veldbeeldige melanosomen. Zoals eerder getoond, wordt een cohort van overexpressie GFP-syntaxin-13 wild type waargenomen in melanosomen. Om de relatieve lokalisatie van GFP-syntaxin-13 wild type en GFP-syntaxin-13 delta-129 naar melanosomen te meten, werd Fiji-software gebruikt en analyse uitgevoerd met JACOP-plug-in.De gemeten Mander's overlapcoëfficiënt, dat is MOC, tussen GFP-syntaxin-13 delta-129 met TYRP1 is ongeveer 1,5 keer hoger in vergelijking met GFP-syntaxin-13 wild type met TYRP1. Interessant is dat TYRP1 2,9 keer hogere MOC-waarden liet zien met GFP-syntaxin-13 delta-129 in vergelijking met GFP-syntaxin-13 wild type. Deze gegevens geven aan dat de lokalisatie van GFP-syntaxin-13 delta-129 melanosomen relatief hoger is in vergelijking met GFP-syntaxin-13 wild type bij een steady state.Kwantificering van syntaxin-13 wild type lokalisatie van de recycling endosomen. Immunofluorescentiemicroscopie van GFP-syntaxin-13 wildtype toonde colocalisatie met het bekende recycling endosomale eiwit Rab11. De MOC tussen GFP-syntaxin-13 wild type met mCherry-Rab11 is ongeveer 1,4 keer hoger in vergelijking met mCherry-Rab11 met GFP-syntaxin-13 wild type.Om het aantal en de lengte van GFP-syntaxin-13 wildtype positieve endosomale tubuli te meten, werd Fiji-software gebruikt zoals beschreven in de protocolsectie. mCherry-Rab11 wordt gebruikt als een positieve controle in de experimenten. Melanocyten getransfecteerd met GFP-syntaxin-13 wild type vertoonden een hoger aantal tubuli per cel in vergelijking met cellen die mCherry-Rab11 tot expressie brachten.De tubuli worden echter verminderd bij co-expressie van zowel GFP-syntaxin-13 wild type als mCherry-Rab11 in de cellen. De zevende stap is de kwantificering van het buisvormige aantal en de lengte van recycling-endosomen. De tubuli worden gereduceerd bij coexpressie van zowel GFP-syntaxin-13 wild type als mCherry-Rab11 in de cellen.Interessant is dat de gemiddelde tubuluslengte van zowel GFP-syntaxin-13 wild type als mCherry-Rab11 vergelijkbaar is met elkaar in cellen die individueel of samen tot expressie komen. Samen suggereren deze gegevens dat GFP-syntaxin-13 wild type lokaliseert naar recycling endosomen als vergelijkbaar met Rab11. Deze studie toonde aan dat de N-terminale levering van syntaxin-13 mutant, dat wil zeggen GFP-syntaxin-13 delta-129, lokaliseert naar melanosomen GFP-syntaxin-13 delta-129 kan mogelijk worden gebruikt als een verslaggever voor vesiculaire handel van recycling endosomen naar het celoppervlak en LRO.Daarentegen lokaliseert GFP-syntaxin-13 wild type naar recycling endosomen vergelijkbaar met Rab11. Deze studie illustreerde dat GFP-syntaxin-13 wild type ook kan worden gebruikt voor het markeren van recycling endososomen in melanocyten. GFP-syntaxin-13 wild type kan een betere recycling endosomale marker zijn dan Rab11, omdat Rab11 de endosomale dynamiek verandert.Alles bij elkaar werkt GFP-syntaxin-13 wild type als een potentiële recycling endosomale marker om de dynamiek bij steady state-omstandigheden te bestuderen.

the-microscopy-based-assay-to-study-analyze-recycling-endosomes-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We hebben een celfusie test die SNARE-gemedieerde membraanfusie events kwantificeert door geactiveerde expressie van β-galactosidase.

Analyse van SNARE gemedieerde membraanfusie gebruiken enzymatische celfusie Assay

Membraantransport omvat het transport van eiwitten van het plasmamembraan naar het celinterieur (d.w.z. endocytose) gevolgd door transport naar lysosomen voor afbraak of naar het plasmamembraan voor recycling. De methoden die in dit artikel worden beschreven, zijn ontworpen om endocytose en recycling van plasmamembraaneiwitten te bestuderen.

De op cellen gebaseerde L-glutathionebeschermingstests om endocytose en recycling van plasmamembraaneiwitten te bestuderen

Receptor handel moduleert signalering en celgevoeligheid liganden en zelf, reagerend op celomstandigheden, zoals ligand-geïnduceerde signalering. Hier beschrijven we een krachtige en flexibele techniek voor het kwantitatief beoordelen van geneesmiddel-geïnduceerde receptor handel met immunolabeling en colocalizational analyse.

Tracking-Drug geïnduceerde veranderingen in Receptor Post-internalisatie mensenhandel door Colocalizational Analyse

Het onderzoek naar membraanhandel is cruciaal voor het begrijpen van neuronale functies. Hier introduceren we een methode voor het kwantificeren van vesikelmotiliteit in neuronen. Dit is een handige methode die kan worden aangepast aan de kwantificering van membraanhandel in het zenuwstelsel.

Kwantificering van Endosome en Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

Synaptic vesikel endocytose is gedetecteerd door de lichte microscopie van pHluorin gefuseerd met synaptic vesikel eiwit en elektronenmicroscopie van vesikel opname.

Meten van Synaptic vesikel endocytose in gekweekte Hippocampal neuronen

Dit protocol wordt een nieuwe methode voor de kwantitatieve visualisatie van complexe vorming van SNARE-eiwitten, gebaseerd op Förster resonance energie-overdracht en levensduur van de fluorescentie microscopie imaging waardoor beschreven.

Visualiseren van intracellulaire SNARE mensenhandel door fluorescentie levensduur microscopie Imaging

We beschrijven een optische assay voor synaptic Vesikel (SV) recycling in gekweekte neuronen. Dit protocol combineert met dubbele transfectie uitspreken een presynaptische marker en proteïne van belang stelt ons in staat te vinden presynaptische sites, hun synaptic vesikel recycling capaciteit bepalen van de rol van de proteïne van belang.

Een optische Assay voor Synaptic vesikel Recycling in gekweekte neuronen Overexpressing presynaptische eiwitten

Efferocytosis, de fagocytische verwijdering van apoptotic cellen, is nodig om de homeostase te handhaven en wordt vergemakkelijkt door de receptoren en signaalroutes waarmee voor de erkenning, de engulfment, en de internalisering van de apoptotic cellen. Hierin presenteren wij een fluorescentie microscopie protocol voor de kwantificering van efferocytosis en de activiteit van efferocytic signaalroutes.

Kwantificering van Efferocytosis door eencellige fluorescentie microscopie

Neuronale prikkelbaarheid kan worden gedifferentieerd door middel van een dynamisch proces van endo- en exocytose van excitatory ionotropic glutamaat receptoren. Hier beschreven is een toegankelijke, hoge-inhoud assay voor het kwantificeren van de groepen van de bevolking van de oppervlakte en interne receptor.

Een High-inhoud Assay voor het toezicht op AMPA Receptor mensenhandel

Endocytisch en retrograde transport van eiwitten van het plasmamembraan naar het trans-Golgi-netwerk is essentieel voor het handhaven van de membraanhomeostase en het reguleren van signalering. Hier beschrijven we een methode om endocytisch transport van transmembraan ladingeiwitten in beeld te brengen en te kwantificeren door middel van live-cel microscopie met behulp van afgeleide anti-GFP nanobodies in HeLa-cellen.

Beeldvorming van levende cellen van endocytisch transport met behulp van gefunctionaliseerde nanobodies in gekweekte cellen

Leer hoe je recycling-endosomen bestudeert in muismelanocyten met behulp van immunofluorescentiemicroscopie en GFP-STX13-markering. Deze methode onthult de dynamiek van endosomale transportprocessen.

De op microscopie gebaseerde test om de recycling-endosomen te bestuderen en te analyseren met behulp van SNARE-handel

Meer video's verkennen