Live-3D-cel immunocytochemie Assays van pediatrische diffuse middellijn glioom

Diffuus midline glioom is een zeer invasieve hersentumor. Deze methode helpt om in realtime te bestuderen hoe DMG-cellen migreren en binnendringen in een 3D-context met specifieke inzichten over de potentiële rol van een sleuteladhesiemolecuul. Door gebruik te maken van een etiketteringsreagens en een specifiek antilichaam anti-CD44, kunnen we door middel van live cell imaging de expressie van CD44 op plasmamembraan op de DMG-cellen bestuderen, ook in 3D-migratie en invasie.

De toepassing van deze techniek benadrukte de potentiële rol van CD44 in de beweeglijkheid van deze cellen, wat suggereert dat het een waardevol en invasief moleculair doelwit zou kunnen vertegenwoordigen. Om te beginnen, rehydrateer de ALR door 100 microliter steriel water toe te voegen en meng de oplossing door pipetteren. Meng het antilichaam met de ALR in het TSM-medium in een multi-well plaat met ronde bodem of in een amberkleurige buis en bescherm het tegen licht.

Bereid voldoende hoeveelheid van het medium voor om 25 microliter per put af te geven bij driemaal de uiteindelijke testconcentratie en incubeer vervolgens gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Verdun BSR in het TSM-medium met een concentratie van 1,5 millimol om aan het einde van de test een eindconcentratie van 0,5 millimol te verkrijgen. Verwijder vervolgens voorzichtig en langzaam 75 microliter van het medium uit elke put, vermijd het aanraken van de bodem van de put waar de NS zit en controleer de aanwezigheid van de NS visueel.

Voeg voorzichtig 25 microliter van het BSR- en ALR-antilichaamcomplex toe aan elke put en laat het ALR-antilichaamcomplex gedurende twee tot drie minuten mengen met het medium. Zorg er met een omgekeerde microscoop voor dat elke NS centraal op de bodem van de put staat. Vermijd de vorming van bubbels door ze met een naald te verwijderen.

Leg de plaat vijf minuten op ijs om de bodem van de plaat koud te laten worden. Doseer 75 microliter BMM per put door een voorgekoelde P200-punt op de binnenwand van de put te plaatsen, waardoor bubbelvorming wordt vermeden en de bodem van de put wordt aangeraakt. Laat de plaat vijf minuten op het ijs staan om de BMM te laten mengen met het medium.

Controleer met een omgekeerde microscoop de locatie van NS. En als het niet centraal aanwezig is, centrifugeer de plaat dan vijf minuten bij vier graden Celsius bij 180 keer G. Breng vervolgens de plaat over in het analyse-instrument voor levende cellen dat in de incubator is geplaatst op 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide en 95% vochtigheid. Zodra de putten zijn gecoat met BMM, snijdt u een P200-punt.

Neem 50 microliter van het celmedium en NS uit elke geselecteerde put en breng deze over naar een gecoate platte bodemput. Controleer de aanwezigheid en de positie van de NS in elke put visueel. Voeg voorzichtig 50 microliter van het verdunde BSR- en ALR-antilichaam toe aan elk putje en wacht twee tot drie minuten om de reagentia te laten mengen.

En zorg er met behulp van een omgekeerde microscoop voor dat de meeste replicerende NS centraal in de put staan. Nadat u de afwezigheid van een bel hebt gecontroleerd, brengt u de plaat voorzichtig over in het analyse-instrument voor levende cellen, zoals eerder is aangetoond. Selecteer in de software voor livecelanalyse-instrumenten het optieschema dat u wilt verkrijgen, klik vervolgens op het plustabblad en selecteer scannen op schema om de platen te scannen met intervallen zoals vermeld in het tekstmanuscript.

Maak of herstel in het softwarevenster het schip en klik vervolgens op de optie Nieuw. Selecteer het sferoïde scantype, fase plus brightfield, groene beeldkanalen voor de invasietest en 4X-doelstelling. Selecteer verdunningskloonscan, type 4X-doelstelling en fase en groen voor de migratietest.

Selecteer het plaattype en definieer de te scannen putten door ze te markeren op de plaatkaart en stel vervolgens de scanfrequentie in. Klik op Toevoegen aan schema en start de scan. Selecteer het tabblad Nieuwe analysedefinitie maken.

Selecteer vervolgens sferoïde invasie of basisanalysatortoepassing voor respectievelijk invasie en migratie op het tabblad. Selecteer de juiste invasie- en migratiekanalen in het afbeeldingskanaal. Selecteer een paar representatieve afbeeldingen van drie tot vier putten om een voorbeeld te bekijken en de analyse-instelling te verfijnen.

Voor de invasietest past u op het tabblad analysedefinitie de toepassingsinstellingen in de heldere en groene kanalen aan met de instellingen die in het tekstmanuscript worden vermeld om een nauwkeurige segmentatie tussen de sferoïde en binnendringende cellen te genereren. Voor migratietest past u de toepassingsinstellingen aan zoals vermeld in het tekstmanuscript in de fase- en groene kanalen om een nauwkeurige segmentatie tussen de samenvloeiing en groene cellen te genereren. Controleer of de analyse-instellingen correct zijn voor de NS door willekeurig op meerdere putten te klikken.

Selecteer de putten en tijdpunten die u wilt analyseren. Sla de analysedefinitie op en klik op Voltooien. De representatieve immunofluorescente confocale beelden van CD44-expressie in primaire DMG-patiënt-afgeleide cellen toonden de rol van CD44 in celmigratie en invasie.

De live 3D-celimmunochemie maakt het mogelijk om CD44-expressie te visualiseren. De representatieve frames van het tijdsverloop voor zowel migratie als invasie tonen de aan- en afwezigheid van het groene fluorescerende signaal op dezelfde cel dat in de loop van de tijd wordt waargenomen, wat suggereert dat de expressie van CD44 aan en uit is terwijl cellen migreren en binnendringen. De migratie- en invasieprocessen worden gedurende 96 uur gevolgd, waarbij QCTB-R059-cellen met een hoog CD44-niveau worden getoond.

De kwantificering van CD44-expressie en de toename ervan in de loop van de tijd werd gemeten door het totale groene fluorescentiesignaal geassocieerd met de ALR voor zowel migratie als invasie. Wanneer het anti-CD44-antilichaam op levende cellen wordt gebruikt, beïnvloedt het de celmorfologie, waardoor een overgang van mesenchymale-achtige naar amoeboïde-achtige invasie en een vermindering van de invasieve en migrerende capaciteit van deze cellen wordt geïnduceerd. De meest kritische stap van de methode zijn het mengen van etiketteringsreagens met een antilichaam, de toevoeging van het mengsel aan de Matrigel en van het medium, en toegang tot het instrument voor beeldvorming van levende cellen.

Deze methode kan verder worden geïmplementeerd door het gebruik van twee of meer onderscheidende etiketteringsreagentia en antilichamen om de DMG-celinteractie gemedieerd door directe cellen en contact te onderzoeken. Onze methode biedt nieuwe hulpmiddelen om in 3D de cellulaire en moleculaire mechanismen van DMG-migratie en -invasie te onderzoeken en biedt nieuwe richtingen voor het remmen van hun infiltratieve fenotype.