Isolatie, vermeerdering en identificatie van bacteriële soorten met koolwaterstof metaboliserende eigenschappen uit aquatische habitats

Dit protocol schetst de isolatie, teelt en identificatie van koolwaterstofafbrekende micro-organismen uit ecologische habitats. Deze methode vereist geen geavanceerde instrumenten en kan gemakkelijk worden uitgevoerd in een standaard laboratoriumopstelling. Het kan ook gemakkelijk worden aangepast om andere substraten te bestuderen.

Deze techniek kan eenvoudig worden vertaald naar verschillende ecologische niches en de afbraak van verschillende substraten kan worden beoordeeld. De procedure wordt gedemonstreerd door Deepa Sethi, een promovendus uit het laboratorium van Dr. Richa Priyadarshini. Verzamel om te beginnen 500 milliliter watermonster in vijf steriele glazen flessen van verschillende waterlichaamlocaties en meet de pH en temperatuur van elk monster.

Filter het monster vervolgens onder aseptische omstandigheden in batches van 100 milliliter door filtervellen met een poriegrootte van 0,22 micron. En plaats de vellen over verschillende voedingsmediaplaten en plaats één papier per bord. Trek na twee uur het papier eraf met een steriele tang.

Verdun vervolgens de ongefilterde watermonsters door 100 microliter van het verzamelde watermonster toe te voegen aan 900 microliter steriel dubbel gedestilleerd water. Ga door met de tienvoudige verdunningen totdat een verdunningsverhouding van één op 1.000.000 is bereikt. Meng door pipetteren en zorg ervoor dat het uiteindelijke volume van elke verdunning één milliliter is.

Verdeel 100 microliter van de verdunde watermonsters afzonderlijk over alle groeimediaplaten, in drievoud. Incubeer de platen bij 30 graden Celsius gedurende 24 tot 48 uur, afhankelijk van de groei van kolonies. Om geïsoleerde kolonies te krijgen, kies je een kolonie met behulp van een steriele tandenstoker of pipetpunt.

Voer kwadrantstrepen uit en incuber de plaat een nacht. De volgende dag screent u de kolonies op basis van hun morfologische kenmerken, zoals kleur, textuur, vorm, grootte, marge en hoogte. Re-streak de kolonies om zuivere culturen te verkrijgen.

Na het uitvoeren van gramkleuring van elke zuivere cultuur, bereidt u glycerolvoorraden voor door een enkele kolonie in drie milliliter geschikte groeimedia te enten en te incuberen bij 30 graden Celsius. Voeg de volgende dag 700 microliter van de nachtcultuur toe en 300 microliter 100% glycerol in cryoflacons. Vries de injectieflacons in bij min 80 graden Celsius voor langdurige opslag.

Pluk van een vers gestreept bord een kolonie en ent deze in vijf milliliter triptyc sojabouillon of voedingsbouillon. Laat de cultuur 's nachts groeien bij 30 graden Celsius, met schudden bij 200 RPM, totdat de absorptie ongeveer twee bereikt. Pellet de cellen de volgende dag.

Gooi het supernatant weg en was de pellet twee keer met twee milliliter geautoclaveerde zoutoplossing. Draai de cellen opnieuw, suspensie de pellet opnieuw in twee milliliter vloeibaar koolstofvrij basaal medium of LCFBM en meet de absorptie. Label vervolgens twee steriele erlenmeyers van 150 milliliter als A en B, voor respectievelijk de controle- en experimentele groep.

Voeg in kolf A 40 milliliter LCFBM toe, gevolgd door een styreen met een eindconcentratie van vijf millimol. Voeg in kolf B 35 milliliter LCFBM en styreen toe. Voeg vervolgens de celsuspensie toe met een uiteindelijke absorptie van ongeveer 0,1.

Nadat u het volume in kolf B met LCFBM tot 40 milliliter hebt gebracht, incubeer u beide kolven bij 30 graden Celsius met schudden bij 200 RPM gedurende 30 dagen. Meet om de vijf dagen de absorptie van elke kolf en zet een groeicurve uit. Verhoog de incubatie met maximaal 45 dagen als de bacteriën styreen kunnen gebruiken.

Een toename van de absorptie geeft aan dat de bacterie styreen kan metaboliseren. Om genomisch DNA te isoleren van gramnegatieve bacteriën, kiest u een enkele kolonie en ent u deze in een vers groeimedium in een steriele reageerbuis. Na een nacht incubatie in een schuddende incubator, pellet 1,5 milliliter van de gegroeide cultuur.

Verwijder het supernatant en resuspensie van de pellet in 200 microliter lysisbuffer. Voeg vervolgens 66 microliter vijfmolaire natriumchlorideoplossing toe en meng goed. Na het centrifugeren van het resulterende mengsel, pipetteer het heldere supinaat in een verse microcentrifugebuis en voeg een gelijk volume chloroform toe.

Meng de oplossing door deze meerdere keren om te keren, totdat een melkachtige oplossing wordt waargenomen. Draai de buis opnieuw en breng het supernatant over in een schone injectieflacon. Voeg vervolgens een milliliter ijskoude 100% ethanol toe en meng door inversie, totdat witte strengen DNA neerslaan.

Centrifugeer het neergeslagen DNA. Gooi het supernatant weg. En was de pellet met één milliliter 70% ethanol.

Laat de DNA-pellet na het weggooien van de was vijf minuten drogen bij kamertemperatuur. Eenmaal gedroogd, suspensie de pellet opnieuw in 100 microliter Tris-EDTA buffer. Meet de DNA-concentratie met behulp van een spectrofotometer en voer het DNA uit op een 1% agarose-gel om de kwaliteit ervan te beoordelen.

Om de stammen te identificeren, versterkt u het DNA geïsoleerd uit de pure bacterieculturen door PCR, met universele primers gericht op de 16S ribosomale RNA-sequentie voor bacteriën. Bereid 25 microliter van het PCR-mengsel op ijs, voeg één microliter van het DNA-sjabloon toe en stel de cyclusomstandigheden in voor genamplificatie. Meng na de PCR vijf microliter van het monster met één microliter van vijf keer DNA-ladende kleurstof.

En voer het uit op een 1% agarose-gel om de versterking te verifiëren. Voor 16S ribosomal, rNA-gensequencing, zet dezelfde reactie op als eerder beschreven, maar in een hoger volume. Om vervolgens de amplicons te zuiveren voor Sanger-sequencing, mengt u het hele monster met DNA-ladingskleurstof en laadt u het op een agarose-gel om de gelextractiemethode uit te voeren.

Zodra de volgorde is voltooid, converteert u het resultatenbestand naar een sneller formaat en controleert u de gelijkenis van de reeks met behulp van de BLAST-tool op NCBI. Bacteriekolonies geïsoleerd uit watermonsters uit een wetland in Dadri, India worden hier getoond. De geïsoleerde bacteriën werden individueel gekweekt in de respectievelijke media, met vloeibaar styreen als enige bron van koolstof.

Het koolwaterstofafbrekend vermogen van de bacteriële isolaten werd beoordeeld met behulp van een catecholafbraaktest. Een representatieve test voor een van de isolaten wordt hier weergegeven. De integriteit van het genomische DNA werd bevestigd door een klein DNA-monster op een agarosegel te visualiseren.

En het 16S ribosomale rNA-gen werd versterkt met behulp van universele primers. Een fylogenetische boom werd gebouwd om de verwantschap tussen exiguobacteriumstammen geïsoleerd uit een wetland weer te geven, met de bekende exiguobacterium-soorten. Een cruciale stap van het protocol is het controleren van het gebruik van het substraat dat wordt getest.

Afhankelijk van de groeikenmerken past de microbe zich mogelijk niet onmiddellijk aan het gebruik van het geteste substraat aan en kan een verrijkingsproces nodig zijn. Deze methode richt zich op de kweekbare bacteriepopulatie in omgevingsmonsters. Onderzoekers kunnen verder experimenten uitvoeren, zoals bacteriële sequentiebepaling van het hele genoom en metabole profilering, die waardevolle inzichten kunnen bieden in genen en routes die betrokken zijn bij de afbraak van koolwaterstoffen.