Name: Intracerebrale transplantatie en in vivo bioluminescentie tracking van menselijke neurale voorlopercellen in de hersenen van de muis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Leer intracerebrale transplantatie van menselijke neurale voorlopercellen met bioluminescentie tracking in muizenhersenen. Deze methode maakt longitudinale in vivo beeldvorming mogelijk om celmigratie en overleving te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs RR en CT erkennen de steun van de Mäxi Foundation en het 3R Competence Center.

OPMERKING: Alle experimenten met muizen werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de overheid, instellingen en ARRIVE en werden goedgekeurd door het Kantonaal Veterinair Bureau van Zürich. Volwassen mannelijke en vrouwelijke niet-obese diabetische SCID gamma (NSG) muizen (10-14 weken, 25-35 g) werden gebruikt. Muizen werden gehuisvest in reguliere Type II/III kooien in groepen van ten minste twee dieren per kooi in een vochtigheids- en temperatuurgecontroleerde ruimte met een constante 12/12 uur licht/donker cyclus. .).
1. Celkweek en virale transductie
<ol><li>Differentieer neurale voorlopercellen (NPC's) van iPSC's met behulp van kleine molecuulremmers zoals eerder beschreven14.</li>
	<li>Kweek NPC's15 vanaf passage 2 in Neural Stem cell Maintenance Medium (NSMM; Tabel 1) aangevuld met kleine moleculen (tabel 1) in 6-putplaten (2 ml medium per put) gecoat met poly-ornithine/laminine521 (pLO/L521). Verander het medium dagelijks. OPMERKING: Om NPC's te passeren, voegt u 1 ml celdissociatiereagens per put toe (zie de tabel met materialen) en incubeert u gedurende 1 minuut bij 37 °C totdat de meeste cellen loskomen.<ol>
<li>Incubeer voor coating 150 μL pLO in 1 ml van 0,1 M fosfaatgebuufferde zoutoplossing (PBS) per put gedurende 2 uur bij kamertemperatuur (RT). Na drie wasbeurten met PBS, incubeer 10 μg L521 in 1 ml PBS per put gedurende 2 uur bij RT.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voor virale transductie, plaats 50.000 cellen per put in een 24-well plaat bedekt met pLO / L521 en voeg voorverpakte virale vectoren (pLL-EF1a-rFLuc-T2A-GFP-mPGK-Puro, LL410PA-1) toe aan elke put. OPMERKING: De totale geleverde infectieuze eenheden (IFU) zijn >2 × 106 IFU en zijn voldoende om 100.000 cellen te infecteren bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 20. Het tellen van cellen is uitgevoerd met een geautomatiseerde celteller. De transductie-efficiëntie is sterk afhankelijk van de gebruikte cellijn. Werken met lentivirus vereist naleving van de lokale richtlijnen voor bioveiligheidsniveau 2 (BSL-2) producten.</li>
	<li>Incubeer de cellen bij 37 °C gedurende 72 uur, terwijl de dagelijkse mediumveranderingen worden voortgezet.</li>
	<li>Bevestig succesvolle transductie door de cellen te controleren op GFP-expressie in een fluorescentiemicroscoop. Stel de microscoopvergroting in op 10x of 20x en gebruik de juiste excitatie (460-480 nm) en emissiebereik (490-520 nm) om getransduceerde GFP-expresserende cellen te detecteren.</li>
	<li>Kwantificeer de verhouding tussen GFP-getransduceerde en totale cellen om de algemene transductie-werkzaamheid te schatten. OPMERKING: Transductiesnelheden van 65-95% werden bereikt met dit protocol. Een transductie-werkzaamheid van >50% wordt aanbevolen als een go/no-go-criterium vóór de transplantatie. Als 50% transductie-werkzaamheid niet kan worden bereikt, voer dan puromycineselectie uit of sorteer de cellen met behulp van flowcytometrie om de opbrengst van getransduceerde cellen te verhogen.</li>
	<li>Optioneel: Invriezen van cellen<ol>
<li>Draai de cellen naar beneden (300 × g, 5 min) en gooi het supernatant weg. Resuspend de pellet in 1 ml vriesmedium (zie de tabel met materialen) en breng de suspensie over in injectieflacons om 106 cellen/injectieflacon te verkrijgen. Breng de cellen gedurende 24 uur over in vriesdozen bij -80 °C en vervolgens op -150 °C voor langdurige opslag.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Celvoorbereiding voor transplantatie
<ol><li>Verzamel een injectieflacon met cellen uit -150 °C opslag en breng deze over naar het laboratorium. Tel de cellen met behulp van een geautomatiseerde celteller. OPMERKING: De injectieflacon bevat 1,5-2 × 106 cellen.</li>
	<li>Breng de injectieflacon snel over in een waterbad van 37 °C totdat er geen ijskristallen achterblijven (2-3 min). OPMERKING: Het is belangrijk om snel te ontdooien om eventuele schade aan celmembranen te minimaliseren. Dompel de injectieflacon niet volledig onder in het waterbad, omdat dit het risico op besmetting kan verhogen.</li>
	<li>Breng de injectieflacon over naar de bioveiligheidskast en pipetteer de hele inhoud (~ 1 ml) in een steriele conische buis van 15 ml. OPMERKING: Werken met lentiviraal getransduceerde cellen vereist BSL-2. Wassende en passerende cellen verwijderen echter virale deeltjes uit het medium. Informatie over wanneer een overdracht van BSL-2 naar BSL-1 is toegestaan, moet worden verkregen bij de lokale autoriteiten.</li>
	<li>Voeg 9 ml steriele 1x PBS toe en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 × g, RT.</li>
	<li>Verwijder het supernatant door aspiratie met behulp van een pipet (1-10 ml); kantel de ophanging voorzichtig naar de pipetpunt en begin met aspirateren. Pas op dat u de pellet niet verstoort.</li>
	<li>Was de cellen door ze opnieuw te verdelen in 10 ml steriele 1x PBS. OPMERKING: Plak de buis voorzichtig om cellen in het resterende volume te resuspenderen. Trituraleer de celsuspensie langzaam met behulp van een pipet van 1 ml totdat deze geen klonten of aggregaten bevat.</li>
	<li>Tel de cellen voor de laatste spin met behulp van een geautomatiseerde celteller.</li>
	<li>Centrifugeer gedurende 5 min bij 300 × g, RT.</li>
	<li>Verwijder het supernatant (stap 2.5) en suspend de celkorrel in het vereiste volume steriel PBS tot een concentratie van 8 × 104 cellen/μL. Plaats de cellen op ijs en gebruik ze voor transplantatie binnen de volgende 5 uur. OPMERKING: In dit protocol werd een volume van 1,6 × 105 cellen/2 μL PBS gebruikt.</li>
</ol>3. Transplantatieprocedure
<ol><li>Voorbereiding op een operatie<ol>
<li>Reinig en steriliseer de operatieapparatuur.</li>
		<li>Bereid het stereotaxische apparaat en het micro-injectiepompsysteem voor. OPMERKING: Het is van cruciaal belang om de Hamilton-spuit en de naald van 30 G, 2 inch te testen voordat u begint. Steek de naald in een buis met steriele 0,9% NaCl en trek de oplossing langzaam in en uit.</li>
		<li>Stel het anesthesieapparaat in. Test de machine voordat u dieren erbij betrekt. Reinig de inductiekamer met 70% ethanol.</li>
	</ol></li>
	<li>Voorbereiding van dieren<ol>
<li>Houd de muizen minstens 7 dagen voorafgaand aan de experimenten in standaardomstandigheden om ze te laten acclimatiseren. OPMERKING: De volgende dieren werden gebruikt voor dit protocol: vrouwelijke NOD / SCID / IL2rγnull (30-35 g, ook bekend als NSG) en vrouwelijke C57BL / 6J (20-25 g, ook bekend als B6). De procedure kan ook worden uitgevoerd met mannelijke muizen.</li>
		<li>Meet het lichaamsgewicht van de muis en pas de dosis van de in te spuiten pijnstiller aan. Dien carprofen (5 mg/kg lichaamsgewicht) intraperitoneaal toe om pijn te verminderen en/of een ontstekingsreactie te voorkomen.</li>
		<li>Anesthetiseer de dieren met isofluraan (3% in de inductiefase en 1,5-2% in de onderhoudsfase tijdens de operatie) verdampt in zuurstof. OPMERKING: Gasvormige anesthesie heeft de voorkeur vanwege een snelle wake-up na de chirurgische ingreep en omdat de niveaus van anesthetisch gas gemakkelijk kunnen worden aangepast.</li>
		<li>Gebruik nociceptieve reflexen om ervoor te zorgen dat het dier diep wordt verdoofd (bijv. Teen knijpen). Wanneer diepe anesthesie is bereikt, transporteert u het dier van de inductiekamer naar het stereotaxische frame. Zorg voor anesthesie met behulp van een gezichtsmasker. OPMERKING: De ademhalingsfrequentie moet gedurende de hele procedure visueel worden gecontroleerd (40-60 ademhalingen per minuut). Gebruik een opwarmkussen om onderkoeling tijdens de procedure te voorkomen.</li>
		<li>Breng oogheelkundig glijmiddel aan om te voorkomen dat de ogen uitdrogen.</li>
		<li>Scheer de hoofdhuid van de muis met een elektrisch scheermes en desinfecteer de huid met 5% betadine-oplossing met wattenstaafjes.</li>
		<li>Zet de muiskop vast en steek de oorstaven in de externe meatus. OPMERKING: Pas op dat u de trommelvliezen niet beschadigt. Breng lidocaïnezalf aan op beide gehoorgangen voordat u de oorstaven inbrengt. Om te controleren of het hoofd van het dier zich in een stabiele positie bevindt, duwt u voorzichtig op het hoofd om te zien of er beweging is. Als beweging wordt opgemerkt, zijn de oorbalk, de plaatsing van het neusstuk of beide onjuist en moeten ze opnieuw worden aangepast.</li>
	</ol></li>
	<li>Craniotomie<ol>
<li>Gebruik een chirurgisch mes om een snee langs de middellijn te maken die groot genoeg is om de lambda- en bregma-oriëntatiepunten te onthullen. OPMERKING: Oprolmechanismen voor de huid kunnen worden aangebracht om de schedel bloot te houden.</li>
		<li>Trek het botvlies en de fascia terug met een scalpel en gebruik steriele wattenstaafjes om het schedeloppervlak te drogen.</li>
		<li>Pas de oor- en mondbalken aan om de hoofdpositie te standaardiseren. OPMERKING: De verticale coördinaten voor bregma en lambda moeten identiek zijn voor anteroposterior positionering.</li>
		<li>Plaats de naald op de bregma en bereken de coördinaten van de gewenste injectiepunten (de coördinaten van belang gekozen voor dit protocol: anterior-posterior (AP): + 0,5 mm, mediaal-lateraal (ML): + 1,5 mm). Beweeg de naald naar dat punt en markeer deze met inkt. OPMERKING: De coördinaten zijn gekozen op basis van de Franklin en Paxinos Mouse Brain Atlas 16. Afstanden zijn mm vanaf de bregma.</li>
		<li>Breng steriele 0,9% NaCl aan op de schedel en boor een gat met een diameter van 2-3 mm door de schedel met een chirurgische, tandheelkundige boor.</li>
		<li>Verplaats de naald naar het oppervlak van de dura en bereken de dieptecoördinaten.</li>
	</ol></li>
	<li>Transplantatie procedure<ol>
<li>Resuspend de cellen in de buis (stap 2.9) en zuig 2 μL celsuspensie in een spuit (5 μL of 10 μL). OPMERKING: Zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn in de celsuspensie. De spuit moet in een horizontale positie worden gehouden totdat deze in het stereotactische apparaat is gemonteerd om celbezinking te voorkomen.</li>
		<li>Plaats de spuit boven de doelplaats (berekende coördinaten: AP: + 0,5 mm, ML: + 1,5 mm) en beweeg de naald langzaam naar het oppervlak van de dura. OPMERKING: Als u niet zeker bent van de juiste coördinaten, voer dan injecties uit met een kleurstof en histologische evaluatie van de injectieplaats voordat u cellen transplanteert (zie 17 voor meer informatie).</li>
		<li>Leid de naald met een snelheid van 0,02 mm /s in de hersenen tot de juiste diepte (de coördinaat die voor dit protocol is gekozen, is dorsaal-ventraal (DV) - 0,8 mm). Schiet de diepte met 0,1 mm en trek de naald over dezelfde afstand terug om een zak voor de geïnjecteerde cellen te creëren.</li>
		<li>Breng weefsellijm aan rond de naald met een tang om lekkage van cellen te voorkomen.</li>
		<li>Injecteer 2 μL van de bereide celsuspensie met een constante snelheid van 3-5 nL/s. OPMERKING: De injectieprocedure duurt tussen de 7 en 12 minuten.</li>
		<li>Laat de naald na de injectie minstens 5 minuten op zijn plaats voordat u deze langzaam terugtrekt. Breng weefsellijm aan om het gat in de schedel af te dichten en wacht nog eens 2 minuten.</li>
	</ol></li>
	<li>Hechtingen en nazorg
	<ol>
<li>Breng steriele 0,9% NaCl-oplossing aan op de blootgestelde schedel om uitdroging te voorkomen.</li>
		<li>Sluit de wond met een 5/0 zijden hechtdraad.</li>
		<li>Hydrateer het dier met 0,5 ml ringerlactaatoplossing die subcutaan in de onderrug wordt geïnjecteerd.</li>
		<li>Onderbreek de anesthesietoediening en verwijder de muis voorzichtig uit het stereotaxische apparaat en plaats deze terug in een kooi op een verwarmingskussen.</li>
		<li>Monitor de dieren tijdens de acute fase na de verwonding. Controleer de hechting, het gewicht van het dier en de algehele gezondheid minstens twee keer per dag.</li>
	</ol></li>
</ol>4. In vivo beeldvorming
<ol><li>Bereiding van luciferine<ol>
<li>Ontdooi D-luciferine kaliumzout bij RT en bereid een verse bouillon-oplossing van D-luciferine op 30 mg / ml in PBS.</li>
		<li>Steriliseer de stamoplossing door een spuitfilter van 0,22 μm. OPMERKING: Onmiddellijk gebruik van de werkoplossing wordt aanbevolen. Indien nodig kan opgelost luciferine worden bewaard bij -20 °C. Langdurige opslag kan echter leiden tot degradatie van het signaal. Luciferine is een lichtgevoelig reagens; houd het waar mogelijk uit direct licht. Alternatieve substraten kunnen ook worden overwogen, bijvoorbeeld cycluc, om de resolutielimiet18 te verbeteren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beeldvorming<ol>
<li>Eerste installatie OPMERKING: Bioluminescentiebeeldvorming werd uitgevoerd met behulp van een in vivo beeldvormingssysteem (zie de tabel met materialen) bestaande uit een donkere kamer en een ccd-camera (gekoeld charge-coupled device).<ol>
<li>Dubbelklik op het softwarepictogram van Living Image en selecteer een gebruikers-ID in de vervolgkeuzelijst.</li>
			<li>Klik op Initialiseren in het configuratiescherm dat wordt weergegeven. Zodra het initialisatieproces is voltooid, wordt de temperatuurbox in het bedieningspaneel groen.</li>
			<li>Schakel in het configuratiescherm de selectievakjes Luminescent en Photograph in en selecteer Automatische belichting (~60 s). Selecteer een gezichtsveld (D/12,5 cm is gekozen voor dit protocol). Voer de hoogte van het onderwerp (1,5 cm) in en selecteer de optie Voor het gebruik van de hoogte van het onderwerp . Stel handmatig de volgende parameters in: grote binning, f/2, geblokkeerd excitatiefilter en open emissiefilter.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bepaal de injectiehoeveelheid D-luciferine bij 300 mg/kg lichaamsgewicht. OPMERKING: De standaard aanbevolen dosis is 150 mg / kg D-luciferine. Deze procedure werd aangepast volgens een protocol dat een hogere gevoeligheid rapporteerde met 300 mg/kg18.</li>
		<li>Injecteer de luciferine intraperitoneaal (i.p.). OPMERKING: Als het dier vóór de injectie moet worden verdoofd, moet u er rekening mee houden dat dit de piekmoment van luciferase-expressie kan verlengen.</li>
		<li>Wacht 5 minuten en verdoof de dieren vervolgens met een continue toevoer van isofluraan (4,5% in de inductiefase en 1,5-2% in de onderhoudsfase tijdens de beeldvormingsprocedure).</li>
		<li>Breng oogheelkundig glijmiddel aan op de ogen en scheer vervolgens de verdoofde dieren op het hoofdgebied met behulp van een conventioneel scheerapparaat. Plaats de dieren in de beeldvormingskamer en begin 15 minuten na de luciferinininjectie met beeldvorming door in het bedieningspaneel op Verwerven te klikken.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Perfusie
<ol><li>Verdoof de dieren door een o.a. injectie van natriumpentobarbital (150 mg/kg lichaamsgewicht). Wacht tot de muis niet meer reageert op pijnlijke prikkels, zoals teenknijpen.</li>
	<li>Leg de muis op zijn rug en gebruik een pincet en schaar om de borstholte te openen.</li>
	<li>Gebruik een standaard schaar om het diafragma te openen.</li>
	<li>Stel het hart bloot en steek een naald (uit de slang met ringer/4% paraformaldehyde-oplossing (PFA)) in de top van de linker ventrikel. OPMERKING: Zorg ervoor dat u de punt van de naald in het lumen van de ventrikel houdt.</li>
	<li>Knip de rechter ventrikel met een schaar.</li>
	<li>Perfuseer met ringeroplossing (kan worden bewaard bij RT) gedurende 3-4 minuten (debiet: 17 ml / min). Ga door totdat het hart schoon is.</li>
	<li>Schakel de stopkraan om de stroom van PFA mogelijk te maken (bewaren bij 4 °C; op ijs houden tijdens de procedure) en nog eens 5 minuten (~ 100 ml) doorlaten.</li>
	<li>Stop de pomp en verwijder de naald uit de linker ventrikel. OPMERKING: De perfusie met PFA behoudt de weefselintegriteit uniform. Het vergemakkelijkt ook het behoud van GFP-signaal in de transplantaties dat anders verloren kan gaan als gevolg van diffusie.</li>
</ol>6. Verwerking
<ol><li>Weefselverzameling<ol>
<li>Verwijder het hoofd met een standaard schaar en maak een middellijnincisie in de huid.</li>
		<li>Draai de huid over de ogen om de schedel bloot te leggen.</li>
		<li>Begin bij het caudale deel op het punt van het pariëtale bot en maak een kleine incisie met behulp van een veerschaar. Schuif de schaar langs de midsagittale hechting tot een punt tussen de ogen. Begin opnieuw vanaf het caudale deel en maak twee sneden parallel en ~ 4 mm uit elkaar in het sagittale vlak. OPMERKING: Pas op dat u de hersenen niet beschadigt door de schaar tegen het binnenoppervlak van de schedel te drukken.</li>
		<li>Gebruik een tang om voorzichtig een kant van het pariëtale bot te kantelen en af te breken. Doe hetzelfde met de andere kant. OPMERKING: Gebruik een microspatula om het bot te bevrijden van de hersenvliezen; anders kunnen ze de hersenen beschadigen terwijl ze de schedel afbreken. Als er delen van het voorste bot achterblijven, maak dan een kleine snede om de botplaat te kantelen en af te breken.</li>
		<li>Om de hersenen vrij te maken, schuift u de microspatula voorzichtig onder de hersenen (olfactorische bollen) en kantelt u deze voorzichtig naar boven.</li>
		<li>Houd na het verzamelen de hersenen gedurende 4-6 uur bij 4 °C in 4% PFA-oplossing. Breng het daarna over op steriele 1x PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Immunohistochemie<ol>
<li>Breng de hersenen over op een 30% sucrose-oplossing gedurende ten minste 48 uur bij 4 °C om de vorming van kristallen tijdens het invriezen te voorkomen.</li>
		<li>Gebruik een glijdende microtoom om coronale secties met een dikte van 40 μm te snijden. Verzamel en bewaar de secties als vrij zwevende secties (in een 24-well-plaat) in een cryoprotectieve oplossing (tabel 1) bij -20 °C tot verdere verwerking.</li>
		<li>Spoel de secties af met 450 μL van 1x PBS voor elke put (3 keer, 5 min elk, RT).</li>
		<li>Blokkeer niet-specifieke locaties met 450 μL blokkeringsoplossing voor elke put (tabel 1) gedurende 1 uur bij RT.</li>
		<li>Incubeer elke put met 450 μL primaire antilichamen bij 4 °C 's nachts. Verdun de antilichamen 1:200 in 3% ezelserum; 0,1% Triton-X-100 in PBS. Om donormateriaal in de gastheeromgeving te identificeren, gebruikt u een antilichaam tegen mensspecifieke kernen (Anti-Human Nuclei Antibody, kloon 235-1).</li>
		<li>Was de secties met 450 μL van 1x PBS voor elke put (3 keer, 5 min elk, RT).</li>
		<li>Incubeer elke put met 450 μL overeenkomstige fluorescerende secundaire antilichamen gedurende 2-3 uur (RT). Verdun de antilichamen in 3% ezelserum; 0,1% Triton-X-100 in 1x PBS.</li>
		<li>Was de secties met 450 μL van 1x PBS voor elke put (3 keer, 5 min elk, RT).</li>
		<li>Kleur de kernen met 450 μL 0,1 μg/ml 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Rust, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nogo-A+targeted+therapy+promotes+vascular+repair+and+functional+recovery+following+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nogo-A targeted therapy promotes vascular repair and functional recovery following stroke.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14270-14279 (2019).</li>
<li>Rust, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-Nogo-A+antibodies+prevent+vascular+leakage+and+act+as+pro-angiogenic+factors+following+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Anti-Nogo-A antibodies prevent vascular leakage and act as pro-angiogenic factors following stroke.</a> Scientific Reports. 9 (1), 20040(2019).</li>
<li>Weber, R. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+blood+brain+barrier+disruption+in+the+photothrombotic+stroke+model%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the blood brain barrier disruption in the photothrombotic stroke model.</a> Frontiers in Physiology. 11, 58226(2020).</li>
<li>Sweeney, M. D., Sagare, A. P., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+breakdown+in+Alzheimer%27s+disease+and+other+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neurology%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier breakdown in Alzheimer's disease and other neurodegenerative disorders.</a> Nature Reviews. Neurology. 14 (3), 133-150 (2018).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3K3A-APC+stimulates+post-ischemic+neuronal+repair+by+human+neural+stem+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">3K3A-APC stimulates post-ischemic neuronal repair by human neural stem cells in mice.</a> Nature Medicine. 22 (9), 1050-1055 (2016).</li>
<li>Llorente, I. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+glial+enriched+progenitors+repair+functional+deficits+due+to+white+matter+stroke+and+vascular+dementia+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Patient-derived glial enriched progenitors repair functional deficits due to white matter stroke and vascular dementia in rodents.</a> Science Translational Medicine. 13 (590), (2021).</li>
<li>Kokaia, Z., Llorente, I. L., Carmichael, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Customized+brain+cells+for+stroke+patients+using+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Customized brain cells for stroke patients using pluripotent stem cells.</a> Stroke. 49 (5), 1091-1098 (2018).</li>
<li>Parmar, M., Grealish, S., Henchcliffe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+stem+cell+therapies+for+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The future of stem cell therapies for Parkinson disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 103-115 (2020).</li>
<li>Galgano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traumatic+brain+injury%3A+current+treatment+strategies+and+future+endeavors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Traumatic brain injury: current treatment strategies and future endeavors.</a> Cell Transplantation. 26 (7), 1118-1130 (2017).</li>
<li>Schweitzer, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+iPSC-derived+dopamine+progenitor+cells+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Personalized iPSC-derived dopamine progenitor cells for Parkinson's disease.</a> The New England Journal of Medicine. 382 (20), 1926-1932 (2020).</li>
<li>Muir, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracerebral+implantation+of+human+neural+stem+cells+and+motor+recovery+after+stroke%3A+multicentre+prospective+single-arm+study+%28PISCES-2%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurology%2C+Neurosurgery+%26+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Intracerebral implantation of human neural stem cells and motor recovery after stroke: multicentre prospective single-arm study (PISCES-2).</a> Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry. 91 (4), 396-401 (2020).</li>
<li>Kawabori, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+therapy+for+chronic+TBI%3A+interim+analysis+of+the+randomized+controlled+STEMTRA+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Cell therapy for chronic TBI: interim analysis of the randomized controlled STEMTRA trial.</a> Neurology. 96 (8), 1202-1214 (2021).</li>
<li>George, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+stem+cell+mimics+to+enhance+stroke+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Engineered stem cell mimics to enhance stroke recovery.</a> Biomaterials. 178, 63-72 (2018).</li>
<li>Sancho-Martinez, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+iPSC-based+models+for+the+study+and+targeting+of+glioma+initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Establishment of human iPSC-based models for the study and targeting of glioma initiating cells.</a> Nature Communications. 7 (1), 1-14 (2016).</li>
<li>Rust, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xeno-free+induced+pluripotent+stem+cell-derived+neural+progenitor+cells+for+in+vivo+applications%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Xeno-free induced pluripotent stem cell-derived neural progenitor cells for in vivo applications.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Franklin, K., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFranklin%2C+K+%22Paxinos+and+Franklin%27s+the+Mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates%2C+compact%3A+The+coronal+plates+and+diagrams%22">Paxinos and Franklin's the Mouse brain in stereotaxic coordinates, compact: The coronal plates and diagrams</a>. , Academic Press. (2019).</li>
<li>Baker, S., Götz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+local+insult+of+okadaic+acid+in+wild-type+mice+induces+tau+phosphorylation+and+protein+aggregation+in+anatomically+distinct+brain+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">A local insult of okadaic acid in wild-type mice induces tau phosphorylation and protein aggregation in anatomically distinct brain regions.</a> Acta Neuropathologica Communications. 4, 32(2016).</li>
<li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+optical+imaging+of+myelination+events+in+a+myelin+basic+protein+promoter-driven+luciferase+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22ASN+Neuro%22%5BJournal%5D)">In vivo optical imaging of myelination events in a myelin basic protein promoter-driven luciferase transgenic mouse model.</a> ASN Neuro. 10, (2018).</li>
<li>Aswendt, M., Adamczak, J., Couillard-Despres, S., Hoehn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boosting+bioluminescence+neuroimaging%3A+an+optimized+protocol+for+brain+studies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Boosting bioluminescence neuroimaging: an optimized protocol for brain studies.</a> PLoS One. 8 (2), 55662(2013).</li>
<li>Roth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-released+alarmins+and+stress+response+synergize+in+accelerating+atherosclerosis+progression+after+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Brain-released alarmins and stress response synergize in accelerating atherosclerosis progression after stroke.</a> Science Translational Medicine. 10 (432), (2018).</li>
<li>Rust, R., Hofer, A. -S., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stroke+promotes+systemic+endothelial+inflammation+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Stroke promotes systemic endothelial inflammation and atherosclerosis.</a> Trends in Molecular Medicine. 24 (7), 593-595 (2018).</li>
<li>Rust, R., Gantner, C., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-+and+antiangiogenic+therapies%3A+current+status+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Pro- and antiangiogenic therapies: current status and clinical implications.</a> FASEB Journal. 33 (1), 34-48 (2018).</li>
<li>Rust, R., Grönnert, L., Weber, R. Z., Mulders, G., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refueling+the+ischemic+CNS%3A+guidance+molecules+for+vascular+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Refueling the ischemic CNS: guidance molecules for vascular repair.</a> Trends in Neurosciences. 42 (9), 644-656 (2019).</li>
<li>Nih, L. R., Gojgini, S., Carmichael, S. T., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-function+injectable+angiogenic+biomaterial+for+the+repair+of+brain+tissue+following+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Dual-function injectable angiogenic biomaterial for the repair of brain tissue following stroke.</a> Nature Materials. 17 (7), 642(2018).</li>
<li>Montagne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericyte+degeneration+causes+white+matter+dysfunction+in+the+mouse+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pericyte degeneration causes white matter dysfunction in the mouse central nervous system.</a> Nature Medicine. 24 (3), 326-337 (2018).</li>
<li>Montagne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APOE4+leads+to+blood-brain+barrier+dysfunction+predicting+cognitive+decline%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">APOE4 leads to blood-brain barrier dysfunction predicting cognitive decline.</a> Nature. 581 (7806), 71-76 (2020).</li>
<li>George, P. M., Steinberg, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+stroke+therapeutics%3A+unraveling+stroke+pathophysiology+and+its+impact+on+clinical+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Novel stroke therapeutics: unraveling stroke pathophysiology and its impact on clinical treatments.</a> Neuron. 87 (2), 297-309 (2015).</li>
<li>Weber, R. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+learning+based+behavioral+profiling+of+rodent+stroke+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Deep learning based behavioral profiling of rodent stroke recovery.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Nair, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uses+for+humanised+mouse+models+in+precision+medicine+for+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mammalian+Genome%22%5BJournal%5D)">Uses for humanised mouse models in precision medicine for neurodegenerative disease.</a> Mammalian Genome. 30 (7), 173-191 (2019).</li>
<li>Kirabali, T., Rust, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPS-derived+pericytes+for+neurovascular+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">iPS-derived pericytes for neurovascular regeneration.</a> European Journal of Clinical Investigation. 51 (9), 13601(2021).</li>
<li>Weber, R. Z., Perron, P., Rust, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+for+brain+repair%3A+More+than+just+a+neuron%27s+sidekick%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathology%22%5BJournal%5D)">Astrocytes for brain repair: More than just a neuron's sidekick.</a> Brain Pathology. 31 (5), Zurich, Switzerland. 12999(2021).</li>
<li>Johansen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Tet-on+system+to+avoid+transgene+down-regulation+in+ex+vivo+gene+transfer+to+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Tet-on system to avoid transgene down-regulation in ex vivo gene transfer to the CNS.</a> Gene Therapy. 9 (19), 1291-1301 (2002).</li>
<li>Vogel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+graft+size+and+not+the+innate+immune+response+limit+survival+of+engrafted+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Initial graft size and not the innate immune response limit survival of engrafted neural stem cells.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 784-793 (2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen potentiële belangenconflicten te melden.

Het regenereren van de gewonde hersenen om functioneel herstel mogelijk te maken, blijft een onvervulde uitdaging. Veel innovatieve preklinische benaderingen zijn geëvolueerd gericht op bijvoorbeeld immuunmodulatie19,20, angiogenese 1,21,22,23, bloed-hersenbarrière-integriteit 2,3,24,25 en celvervanging 5,26 . Vooral in de afgelopen jaren zijn celgebaseerde therapieën naar voren gekomen als een veelbelovende behandelingsstrategie voor de hersenen vanwege grote vooruitgang in stamceltechnologie en efficiënte differentiatieprotocollen15,28. Dit artikel biedt een waardevol protocol voor het transplanteren en volgen van neurale cellen in het muizenbrein. De methode is toepasbaar voor alle transduceerbare cellijnen voor in vivo toepassingen in het muizenbrein.
De gepresenteerde opstelling maakt gebruik van transplantaties van menselijke oorsprong in een muis. Deze transplantaties zijn op de lange termijn niet levensvatbaar bij immunocompetente wild-type muizen vanwege immunogeniciteit. Vandaar dat immunodeficiënte NSG-muizen werden gebruikt om deze beperking te overwinnen. Als alternatief kan het gebruik van muistransplantaties de voorkeur krijgen om de immunogene aspecten te overwinnen. Als transplantatie van menselijke cellen nodig is, vormen gehumaniseerde muismodellen een opkomend alternatief om de kans op transplantaatafstoting te verminderen29.
Een commerciële dual-reporter virale vector bestaande uit firefly luciferase en eGFP onder de EF1α promotor werd gebruikt om de transplantaties te visualiseren. Deze promotor werd geselecteerd om een hoge signaalintensiteit15 te bereiken. Afgezien van NPC's is echter aangetoond dat andere celtypen de hersenfunctie na letsel bevorderen, waaronder pericyten30 en astrocyten31; vandaar dat, afhankelijk van de gebruikte cellijn, andere promotors meer geschikt kunnen zijn om hoge expressieniveaus te bereiken. Bovendien kan het gebruik van transgene promotors, zoals CMV, leiden tot downregulatie, vooral in langetermijnexperimenten32. De transductie-efficiëntie van de lentivirale vector is sterk afhankelijk van de gebruikte cellijn en kan variëren tussen afzonderlijke experimenten. Daarom moet de transductie-efficiëntie worden geëvalueerd voordat met de in vivo experimenten wordt begonnen en om variaties in transductie-werkzaamheid tussen experimenten te corrigeren. Het hersengebied van transplantatie beïnvloedt ook de signaalsterkte. Hoewel een detectielimiet van < 6.000 cellen werd bereikt voor corticale transplantaties, kan het zijn dat er meer cellen nodig zijn om een signaal te detecteren in diepere hersengebieden, bijvoorbeeld striatum of hippocampus.
Transplantatievolumes in de hersenen van de muis zijn beperkt tot 1-2 μL. Daarom is het belangrijk om een geschikt celnummer voor de experimenten te identificeren. Eerder is waargenomen dat toenemende celaantallen leiden tot een verminderde overlevingskans, hoogstwaarschijnlijk als gevolg van beperkte beschikbaarheid van voedingsstoffen en zuurstof in het gebied van transplantatie33. In vivo bioluminescentie beeldvorming biedt een relatief lage ruimtelijke resolutie in vergelijking met andere in vivo beeldvormingsmethoden zoals MRI of CT. Daarom kunnen korte migratieroutes van getransplanteerde cellen alleen betrouwbaar worden beoordeeld in de daaropvolgende post-hocanalyse .
De absolute signaalsterkte van de bioluminescentie is over het algemeen evenredig met het getransplanteerde celnummer. De signaalsterkte kan echter worden verminderd als grafts worden getransplanteerd in diepere hersenstructuren of als de signaalsterkte buiten het lineaire detectiespectrum van het in vivo beeldvormingssysteem ligt. Momenteel worden nieuwe substraten ontwikkeld om te zorgen voor een efficiëntere penetratie over de bloed-hersenbarrière dan D-luciferine, inclusief cycluc1. Deze substraten kunnen de detectiegrens van de getransplanteerde cellen in de toekomst verder verbeteren18. Over het algemeen maakt dit protocol een eenvoudige, minimaal invasieve procedure mogelijk om grafts in de hersenen van de muis te transplanteren en te observeren.

Het zoogdierbrein heeft beperkte regeneratieve capaciteiten na letsel of ziekte, waardoor innovatieve strategieën nodig zijn om weefsel- en functioneel herstel te bevorderen. Preklinische strategieën richten zich op verschillende aspecten van hersenregeneratie, waaronder neuroprotectie, neurogenese, angiogenese 1,2, bloed-hersenbarrièreherstel 3,4 of celtherapie 5,6. Celtherapie heeft het voordeel dat het veel van deze pro-reparatieprocessen tegelijkertijd kan bevorderen. In experimenten met transplantatie van cellen heeft weefselherstel plaatsgevonden door (1) directe celvervanging en (2) productie van cytokines die leiden tot angiogenese en neurogenese7. Recente ontwikkelingen in stamceltechnologie hebben de ontwikkeling van schaalbare, goed gekarakteriseerde neurale celbronnen die nu in de pijplijn zitten voor klinische onderzoeken verder vergemakkelijkt (beoordeeld in 7,8,9). Hoewel celtherapieën het klinische stadium hebben bereikt voor een paar neurologische ziekten (bijv. De ziekte van Parkinson10, beroerte11 en dwarslaesie12), is hun werkzaamheid variabel geweest en is meer preklinisch onderzoek nodig om de mechanismen van graft-host interacties te begrijpen.
Een belangrijke beperking van veel preklinische studies is het continu volgen van de getransplanteerde cellen in de gastheer. Vaak worden alleen eindpuntmetingen uitgevoerd, waarbij de dynamische migratie- en overlevingsprocessen in de gastheerworden weggelaten 6,13. Deze beperkingen resulteren in de slechte karakterisering van de getransplanteerde cellen en vereisen hoge dieraantallen om longitudinale veranderingen te begrijpen. Om deze beperkingen te overwinnen, transduceren we in deze studie geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC)-afgeleide neurale voorlopercellen met een commercieel verkrijgbare dual-reporter lentivirale vector bestaande uit rode vuurvlieg luciferase en verbeterd groen fluorescerend eiwit (rFluc-eGFP). Deze cellen worden getransplanteerd via stereotaxische intraparenchymale injectie in de hersenen van de muis en worden longitudinaal gevolgd met behulp van in vivo bioluminescentie beeldvorming gedurende 5 weken. Na het verzamelen van hersenweefsel worden de GFP-tot expressie brengende getransplanteerde cellen geïdentificeerd en verder gekarakteriseerd in histologische hersensecties. Deze methode kan soepel worden aangepast aan alternatieve transduceerbare celbronnen en transplantatieroutes voor in vivo toepassingen in het knaagdierbrein. Over het algemeen is de procedure waardevol om longitudinale informatie te verkrijgen over de overleving en migratie van transplantaten in de hersenen van de muis en vergemakkelijkt de daaropvolgende histologische karakterisering.

<table><tbody><tr><td>Viral Transductie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pLL-EF1a-rFLuc-T2A-GFP-mPGK-Puro (Lenti-Labeler virus)</td><td>Systembio</td><td>LL410VA-1</td><td></td></tr><tr><td>Verbruiksartikelen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf microtubes; 1,5 mL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z606340</td><td></td></tr><tr><td>Falcon buizen; 15 mL</td><td>TPP</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop dekglasjes</td><td></td><td></td><td>Product naar keuze</td></tr><tr><td>Microscoop glaasjes</td><td></td><td></td><td>Product naar keuze</td></tr><tr><td>Sterlie wattenstaafjes</td><td></td><td></td><td>Product naar keuze</td></tr><tr><td>Hechtdraad; 5/0 zijde met gebogen naald</td><td>B. Braun</td><td>G0762482</td><td></td></tr><tr><td>Spuitfilter; 0,22 &micro;m</td><td>TPP</td><td>99722</td><td></td></tr><tr><td>Spuit; 1 mL en 0,5 mL</td><td>B. Braun</td><td>9166017V</td><td></td></tr><tr><td>Weefselkweekplaat (24-well)</td><td>TPP</td><td>92024</td><td></td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Automatische celteller (Vi-CELL XR)</td><td>Beckmann Coulter Life Science</td><td>383721</td><td></td></tr><tr><td>Pincet</td><td>Fine Science Tools</td><td>11064-07</td><td></td></tr><tr><td>Pincet, fijn</td><td>Fine Science Tools</td><td>11412-11</td><td></td></tr><tr><td>Verwarmingskussen</td><td></td><td></td><td>Product naar keuze</td></tr><tr><td>High Speed Brushless Micromotor Kit</td><td>Foredom</td><td>K.1060-22.</td><td></td></tr><tr><td>Ideal Micro Drill Burr Set Of 5</td><td>Cell Point Specific</td><td>60-1000</td><td></td></tr><tr><td>In-Vivo beeldvormingssysteem (IVIS Lumina III met Living Imaging 4.2 softwarepakket)</td><td>Perkin Elmer</td><td>CLS136334</td><td></td></tr><tr><td>Isofluraannevelgenerator</td><td>Provet AG</td><td>330724</td><td></td></tr><tr><td>Micro-injectie spuitpomp systeem</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3T-1</td><td></td></tr><tr><td>Microlieterspuit; 700-serie; Volume: 5-10 &micro;L</td><td>Hamilton</td><td>7635-01</td><td></td></tr><tr><td>Microtoom</td><td>Leica</td><td>HM430</td><td></td></tr><tr><td>NanoFill-33 G-Naald (verwijderbaar en herbruikbaar)</td><td>World Precision Instruments</td><td>NF33BV-2</td><td></td></tr><tr><td>Naaldhouder</td><td>Fine Science Tools</td><td>12001-13</td><td></td></tr><tr><td>Perfusie pomp en slangen</td><td>Masterflex</td><td>HV-77120-42</td><td></td></tr><tr><td>Schaar</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Kleine bonn schaar, recht</td><td>Fine Science Tools</td><td>14184-09</td><td></td></tr><tr><td>Kleine veer schaar, recht</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>Spatel</td><td>Merck</td><td>Z243213-2EA</td><td></td></tr><tr><td>Stereotactisch frame voor knaagdieren; gemotoriseerd</td><td>World Precision Instruments</td><td>99401</td><td></td></tr><tr><td>Farmaceutische middelen en reagentia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Invitrogen</td><td>A11105-01</td><td>Proteolytisch en collagenolytisch; celdissociatie reagens</td></tr><tr><td>Anti-Human Nuclei Antilichaam, clone 235-1, Biotine Conjugaat</td><td>Merck</td><td>MAB1281B</td><td></td></tr><tr><td>B27 &ndash; Supplement (50x)</td><td>Gibco</td><td>17504-001</td><td></td></tr><tr><td>Betadine (11 mg Iod als Povidon-Iod pro 1 ml L&ouml;sung)</td><td>Mundipharma Medical Company</td><td>Alle farmacologische middelen werden geleverd door de kantonnale apotheek, Zürich, Zwitserland</td><td></td></tr><tr><td>Blokkingsoplossing (3% ezelsserum; 0,1% Triton-X-100 in PBS)</td><td></td><td></td><td>Product naar keuze; kan zelf worden gemaakt</td></tr><tr><td>CHIR99021 (10 mM &ndash; 2.500x)</td><td>StemMACS</td><td>130-103-926</td><td></td></tr><tr><td>Cryoprotectieve oplossing</td><td></td><td></td><td>Product naar keuze; kan zelf worden gemaakt</td></tr><tr><td>DAPI oplossing (1 mg/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferine Kaliumzout</td><td>Perkin Elmer</td><td>122799</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320-074</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secundaire Antilichaam, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A-31570</td><td></td></tr><tr><td>Ezelsserum</td><td></td><td></td><td>Product naar keuze</td></tr><tr><td>Esconarcon (Pentobarbitalum natricum 300 mg)</td><td>Streuli Pharma AG</td><td>Alle farmacologische middelen werden geleverd door de kantonnale apotheek, Zürich, Zwitserland</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol; 70%</td><td></td><td></td><td>Product naar keuze</td></tr><tr><td>FGF Basic recombinant humaan eiwit, Dierproefvrij</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp;PHG6015</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax (100x)</td><td>Gibco</td><td>A12860-01</td><td></td></tr><tr><td>hLif (10 &micro;g/mL &ndash; 1.000x)</td><td>PeproTech</td><td>AF-300-05-25UG</td><td></td></tr><tr><td>Isofluraan (Isofluran (1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl-difluormethyl&shy;ether) 99,9%)</td><td>Provet AG</td><td>Alle farmacologische middelen werden geleverd door de kantonnale apotheek, Zürich, Zwitserland</td><td></td></tr><tr><td>Laminine-L521 (L-521)</td><td>Biolaminin LN</td><td>LN521</td><td></td></tr><tr><td>Lidocaine zalf (Lidocain: 25 mg, Prilocain: 25 mg)</td><td>Aspen Pharma Schweiz GmbH</td><td>Alle farmacologische middelen werden geleverd door de kantonnale apotheek, Zürich, Zwitserland</td><td></td></tr><tr><td>Montagemedium</td><td></td><td></td><td>Product naar keuze; kan zelf worden gemaakt</td></tr><tr><td>N2- Supplement (100x)</td><td>Gibco</td><td>&nbsp;75202-001</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Gibco</td><td>&nbsp;21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Ophtalmisch smeermiddel (Retinol palmitat: 15.000 UI)</td><td>Bausch &amp; Lomb Swiss AG</td><td>Alle farmacologische middelen werden geleverd door de kantonnale apotheek, Zürich, Zwitserland</td><td></td></tr><tr><td>Paraform

intracerebrale transplantatie en in vivo bioluminescentie tracking van menselijke neurale voorlopercellen in de hersenen van de muis

Intracerebral Transplantation and In Vivo Bioluminescence Tracking of Human Neural Progenitor Cells in the Mouse Brain

Celtherapie is al lang een opkomend behandelingsparadigma in de experimentele neurobiologie. Celtransplantatiestudies zijn echter vaak gebaseerd op eindpuntmetingen en kunnen daarom slechts in beperkte mate longitudinale veranderingen van celmigratie en overleving evalueren. Dit artikel biedt een betrouwbaar, minimaal invasief protocol voor het transplanteren en longitudinaal volgen van neurale voorlopercellen (NPC's) in het volwassen muizenbrein. Vóór transplantatie worden cellen getransduceerd met een lentivirale vector bestaande uit een bioluminescente (firefly-luciferase) en fluorescerende (groen fluorescerend eiwit [GFP]) reporter. De NPC's worden getransplanteerd in de rechter corticale hemisfeer met behulp van stereotaxische injecties in de sensomotorische cortex. Na transplantatie werden getransplanteerde cellen gedetecteerd door de intacte schedel gedurende maximaal vijf weken (op dag 0, 3, 14, 21, 35) met een resolutielimiet van 6.000 cellen met behulp van in vivo bioluminescentie beeldvorming. Vervolgens worden de getransplanteerde cellen geïdentificeerd in histologische hersensecties en verder gekarakteriseerd met immunofluorescentie. Dit protocol biedt dus een waardevol hulpmiddel om cellen in het muizenbrein te transplanteren, te volgen, te kwantificeren en te karakteriseren.

We streven ernaar om getransplanteerde neurale voorlopercellen in de hersenen van de muis longitudinaal te volgen met behulp van in vivo bioluminescentiebeeldvorming en de getransplanteerde cellen te identificeren in daaropvolgende histologische analyse (figuur 1A). Daarom worden neurale voorlopercellen getransduceerd met een lentivirale vector bestaande uit EF1α-rFluc-eGFP. Vóór de transplantatie werden cellen getest op succesvolle transductie door expressie van eGFP in vitro (figuur 1B). De succesvol getransduceerde cellen werden stereotiep getransplanteerd in de muizenhersenen op de gewenste coördinaten (bijvoorbeeld in de sensomotorische cortex). Na transplantatie werden de muizen systemisch geïnjecteerd met D-luciferine, het substraat voor rFluc, en werden signaalintensiteiten van de getransplanteerde cellen gemeten om een succesvolle transplantatie te bevestigen (figuur 1C).
Om de detectiegrens van de in vivo bioluminescentiebeeldvorming te evalueren, werd een bereik van 6.000-180.000 cellen getransplanteerd in de rechter sensomotorische cortex van de muis (figuur 2A). We detecteerden <6.000 cellen en een bioluminescentiesignaal dat evenredig is met het aantal getransplanteerde cellen direct na transplantatie (figuur 2B). Omdat menselijke celbronnen immunogeen zijn voor immunocompetente muizen, werden NOD scid gamma (NSG) immunodeficiënte muizen gebruikt om de overleving op lange termijn van de celtransplantaten te observeren. Overleving op lange termijn en detectie van een bioluminescentiesignaal gedurende maximaal 5 weken werden bevestigd na celtransplantatie (figuur 2C,D). De getransplanteerde cellen werden met succes ex vivo gedetecteerd in een daaropvolgende histologische analyse via de eGFP-reporter en immunostaining met anti-menselijke kernen en anti-menselijke mitochondriale antilichamen (figuur 2E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63102/63102fig01.jpg"> Figuur 1: Transplantatie van neurale voorlopercellen. (A) Schematisch overzicht van generatie en transplantatie van rFluc-eGFP NPC's. (B) Representatief immunofluorescentiebeeld van getransduceerde NPC's (GFP-reporter, groen) tellers gekleurd met DAPI (blauw); schaalstaven = 5 μm. (C) In vivo detectie van bioluminescentiesignaal in getransplanteerde cellen; color bar = blue (0, min, no signal), red (4 flux, p/s × 105, max signal) Afkortingen: NPC's = neurale voorlopercellen; GFP = groen fluorescerend eiwit; rFluc-eGFP = rode vuurvlieg luciferase en verrijkt groen fluorescerend eiwit; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool; p/s = fotonen/s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63102/63102fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63102/63102fig2v2.jpg"> Figuur 2: Tijdsverloop van getransplanteerde cellen. (A) Schematische weergave van celnummers voor transplantatie. (B) Detectiegrens van getransplanteerde cellen 1 uur na transplantatie. (C, D) Tijdsverloop van transplantatie (180.000 cellen) gedurende maximaal 35 dagen bij NSG-muizen; kleurenbalk = blauw (0, min, geen signaal), rood (4 flux, p/s × 105, max signaal) Gegevens zijn gemiddeld ± SEM (n = 3). (E) Representatieve fluorescentiebeelden van histologische secties en getransplanteerde cellen 5 weken na transplantatie. Schaalbalk = 10 μm. Afkortingen: D = dag na transplantatie; NSG = immunodeficiënt NOD scid gamma; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool; GFP = groen fluorescerend eiwit; HuNu = Anti-Human Nuclei Antibody, kloon 235-1; p/s = fotonen/s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63102/63102fig2v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

We beschrijven de intraparenchymale transplantatie van menselijke neurale voorlopercellen getransduceerd met een dual reporter vector die luciferase-groen fluorescerend eiwit (GFP) in de hersenen van muizen tot expressie brengt. Na transplantatie wordt het luciferasesignaal herhaaldelijk gemeten met behulp van in vivo bioluminescentie en GFP-tot expressie brengende getransplanteerde cellen geïdentificeerd in hersensecties met behulp van fluorescentiemicroscopie.

Intracerebrale transplantatie en in vivo bioluminescentie tracking van menselijke neurale voorlopercellen in de hersenen van de muis

Cell therapy has long been an emerging treatment paradigm in experimental neurobiology. However, cell transplantation studies often rely on end-point ...

Celgebaseerde therapie heeft een enorm potentieel voor hersenregeneratie. Het protocol dat we hier demonstreren is waardevol, omdat het longitudinale in vivo beeldvorming van getransplanteerde cellen in het muizenbrein mogelijk maakt. Dit protocol is vooral handig om inzicht te krijgen in de migratie en de overleving van het transplantaat in hetzelfde dier over een bepaalde periode.Deze procedure kan worden toegepast op elke luciferase-expresserende cellijn die naar de hersenen van de muis wordt getransplanteerd. De signaalsterkte kan echter variëren afhankelijk van de diepte van de transplantatie of de luciferase-expressie in de respectieve cellijn. Rebecca Weber, een uitstekende promovendus in ons laboratorium, demonstreert de procedure.Begin met het verzamelen van een flacon met cellen van minus 150 graden Celsius opslag en breng het over naar het laboratorium. Breng de injectieflacon snel over in een waterbad dat gedurende twee tot drie minuten is getemperd op 37 graden Celsius totdat ijskristallen oplossen. Breng vervolgens de injectieflacon over naar de bioveiligheidskast en pipetteer de hele inhoud in een steriele conische buis van 15 milliliter.Voeg negen milliliter steriel PBS toe en centrifugeer bij 300 G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant door aspiratie zonder de pellet te verstoren en tel de cellen voor de laatste spin met behulp van een geautomatiseerde celteller. Transporteer het dier van de inductiekamer naar het stereotaxische frame en behoud de anesthesie met behulp van een gezichtsmasker.Breng oogheelkundig glijmiddel aan om te voorkomen dat de ogen uitdrogen. Scheer de hoofdhuid van de muis met een elektrisch scheermes en desinfecteer de huid met 5% betadine-oplossing met wattenstaafjes. Zet de muiskop vast en steek de oorstaven in de externe meatus.Boor een gat met een diameter van twee tot drie millimeter door de schedel met een chirurgische tandartsboor. Resuspend de voorbereide cellen in de buis en trek twee microliter celsuspensie in een spuit. Plaats de spuit boven de doelplaats en beweeg de naald langzaam naar het oppervlak van de dura en bereken de dieptecoördinaten.Dubbelklik op het pictogram Living Image-software en selecteer een gebruikers-ID in de vervolgkeuzelijst. Klik vervolgens op Initialiseren in het Configuratiescherm dat wordt weergegeven. Schakel in de Living Image-software de selectievakjes Luminescent en Photograph in het Configuratiescherm in en selecteer Automatische belichting.Selecteer een gezichtsveld. Voer de hoogte van het onderwerp in en selecteer de optie Voor het scherpstellen van de hoogte van het onderwerp gebruiken. Stel handmatig de filterparameters in, waaronder grote Binning, F/Stop, geblokkeerd excitatiefilter en open emissiefilter.Injecteer de luciferine intraperitoneaal en verdoof dieren na vijf minuten met een continue isofluraantoevoer. Scheer de verdoofde dieren op het hoofdgebied met behulp van een conventioneel scheerapparaat. Plaats het dier in de beeldvormingskamer en begin 15 minuten na de luciferine-injectie met beeldvorming door in het configuratiescherm op Verwerven te klikken.Voordat neurale voorlopercellen in het muizenbrein werden getransplanteerd, werden de cellen getest op succesvolle transductie door expressie van EGFP in vitro. De succesvolle transplantatie werd bevestigd door de aanwezigheid van het rode Firefly luciferase signaal. Na transplantatie van 6.000 tot 180.000 cellen in de rechter sensorische motorische cortex van de muis was het bioluminescentiesignaal bij alle concentraties detecteerbaar.De cellen overleefden minstens vijf weken na transplantatie. De getransplanteerde cellen werden met succes ex vivo gedetecteerd in een daaropvolgende histologische analyse via de EGFP-reporter en immunostaining met anti-menselijke kernen. Het is erg belangrijk om de injectiecoördinaten zorgvuldig te berekenen om te voorkomen dat u de doellocatie mist.En laat de spuit ook minstens vijf minuten na de transplantatie op zijn plaats om reflux te voorkomen. Na in vivo bioluminescente beeldvorming kan het hersenweefsel worden voorbereid voor histologische analyse, of de getransplanteerde cellen kunnen worden geïsoleerd met behulp van FACS en worden gekenmerkt met verschillende of gemengde technologieën. Over het algemeen biedt deze techniek een kwantitatieve en continue tracking van getransplanteerde cellen in de hersenen, en het kan worden toegepast op een groot aantal neurologische ziekten, waaronder beroerte en traumatisch hersenletsel.

intracerebral-transplantation-vivo-bioluminescence-tracking-human

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Met de groeiende belangstelling voor stamceltherapieën, moleculaire imaging technieken zijn ideaal voor de bewaking stamceltransplantatie gedrag na transplantatie. Luciferase reporter genen hebben ingeschakeld non-invasieve, repetitieve evaluatie van de overleving van de cel, de locatie en de proliferatie in vivo. Deze video zal laten zien hoe je hESC proliferatie track in een levende muis.

In vitro en in vivo bioluminescente reportergen-beeldvorming van menselijke embryonale stamcellen

Luciferase-gemodificeerd menselijk brein tumor xenotransplantaten kan intracranially worden vastgesteld athymische muizen, met de daaropvolgende controle van de tumorgroei en de respons op de therapie met behulp van bioluminescentie beeldvorming. In combinatie met survival analyse, bioluminescentie monitoring is een essentieel onderzoeksinstrument voor pre-klinisch testen van therapieën worden overwogen voor de behandeling van hersentumoren.

Tot vaststelling van Intracraniële hersentumor xenotransplantaten Met verdere analyse van de tumorgroei en de respons op de therapie met behulp van bioluminescentie Imaging

Intracraniële implantatie van GL261 cellen in C57BL / 6 muizen produceert kwaadaardige gliomen dat veel van de kenmerken van de menselijke glioblastoma multiforme samenvatten. We gebruikten GL261 cellen die stabiel uitdrukken luciferase om ons in staat om te...

Intracraniële Implantatie met Latere 3D In Vivo Bioluminescent Imaging van Murine Gliomen

Dit artikel beschrijft een optimale volgorde van de gebeurtenissen voor de multimodale beeldvorming van cellulaire grafts in knaagdier hersenen met behulp van: (i) in vivo bioluminescentie en magnetische resonantie beeldvorming, en (ii) post mortem histologische analyse. De combinatie van deze beeldvorming op een enkel dier laat cellulaire graft evaluatie met een hoge resolutie en gevoeligheid en specificiteit.

Multimodal Imaging van Stem Cell implantatie in het centrale zenuwstelsel van Muizen

Source: Weber, R. Z., et al. Intracerebral Transplantation and In Vivo Bioluminescence Tracking of Human Neural Progenitor Cells in the Mouse Brain. J. Vis. Exp. (2022)This video demonstrates the stereotaxic transplantation of genetically modified human neural progenitor cells (NPCs) into the mouse brain. Researchers inject NPCs expressing luciferase and fluorescent proteins, enabling in vivo bioluminescence imaging and post-mortem fluorescence microscopy to study cell survival, migration, and...

Transplantation of Human Neural Progenitor Cells in the Mouse Brain

Source: Weber, R. Z., et al., Intracerebral Transplantation and In Vivo Bioluminescence Tracking of Human Neural Progenitor Cells in the Mouse Brain. J. Vis. Exp. (2022)This video demonstrates the method for in vivo bioluminescence imaging of genetically modified human neural progenitor cells injected in a mouse brain. The process involves luciferin injection, imaging preparation, and detection of bioluminescent signals from the transplanted cells at the injection site.

In Vivo Bioluminescence Imaging of Human Neural Progenitor Cells in a Mouse Brain

Op basis van in vitro lentivirale engineering van neuronale precursoren, hun co-transplantatie in wild-type hersenen en gepaarde morphometrische evaluatie van "test" en "Control" derivaten, maakt deze methode nauwkeurige modellering van in vivo gencontrole van neocorticale neuron morfologie op een eenvoudige en betaalbare manier.

Intraveneuze triculaire transplantatie van engineered neuronale precursoren voor in vivo Neuroarchitecture studies

Dit protocol demonstreert methodologieën voor een muismodel van open-schedel traumatisch hersenletsel en transplantatie van gekweekte menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cellen in de wond site. Gedrags-en histologische tests van uitkomsten van deze procedures worden ook in het kort beschreven.

Gecontroleerde corticale impact model van muis hersenletsel met therapeutische transplantatie van menselijk geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide neurale cellen

Deze studie demonstreert de toediening van een repetitief traumatisch hersenletsel aan muizen en gelijktijdige implantatie van een schedelvenster voor daaropvolgende intravitale beeldvorming van een tot expressie gebracht neuron EGFP met behulp van twee-fotonmicroscopie.

Intravitale beeldvorming van fluorescerende eiwitexpressie bij muizen met een gesloten schedel traumatisch hersenletsel en schedelvenster met behulp van een microscoop met twee fotonen

Hier beschrijven we een protocol voor de transplantatie en het volgen van gelabelde neurale cellen in menselijke cerebrale organoïden.

Een menselijk cerebraal organoïdemodel van neurale celtransplantatie

Leer intracerebrale transplantatie van menselijke neurale voorlopercellen met bioluminescentie tracking in muizenhersenen. Deze methode maakt longitudinale in vivo beeldvorming mogelijk om celmigratie en overleving te bestuderen.

Intracerebrale transplantatie en in vivo bioluminescentie tracking van menselijke neurale voorlopercellen in de hersenen van de muis (Video) | JoVE Journal

Intracerebrale transplantatie en in vivo bioluminescentie tracking van menselijke neurale voorlopercellen in de hersenen van de muis

Meer video's verkennen