3D-beeldvorming van de extracellulaire levermatrix in een muismodel van niet-alcoholische steatohepatitis

NASH is een van de belangrijkste chronische leverziekten ter wereld. Het kan zich ontwikkelen tot fibrose, cirrose en uiteindelijk de leverkanker. Het bestuderen van de dynamische verandering van de ECM in de NASH kan helpen om de fibrose beter te begrijpen.

Traditionele beeldvorming kan geen 3D ECM-structuurveranderingen aantonen, waardoor het begrip van het dynamische ECM-remodelleringsproces in de leverfibrose wordt beperkt. Weeg om te beginnen de muis vóór de procedure. Na het verdoven van de muis scheer je het ventrale gebied met een tondeuse en desinfecteer je de huid met 70% ethanol.

Plaats de muis op zijn rug en immobiliseer de benen op de operatieplaat met tape. Gebruik een Mayo-schaar en een Adson-tang om een incisie van drie centimeter lateraal in de onderbuik te maken. En dan een incisie van vijf centimeter verticaal van de lage buik naar het xiphoid-proces zonder de borstholte te openen.

Na het openen van het peritoneum, plaatst u de darmen voorzichtig naar links van het dier en verhoogt u de rechterkwab van de lever met een applicator met rayonpunt om de poortader bloot te leggen. Om de poortader te katheteriseren, induceert u een 24 gauge IV-katheter in het distale uiteinde van de poortader. Plaats de katheterpunt voordat de poortader zich vertakt in de leverkwabben.

Trek de naald onmiddellijk terug wanneer de katheter in de ader komt. Controleer of de katheter correct in de ader is geplaatst door de lever te perfuseren met PBS met behulp van een spuit van één milliliter via de katheter. Gebruik Dumont microtang, een Castroviejo micronaald en 4-0 hechtdraad om een steek onder de vertakking van de poortader te plaatsen en een tweede steek een centimeter lager om de katheter vast te zetten.

Sluit de katheter aan op een siliconen slang van een meter lengte, drie millimeter binnendiameter en 4,1 millimeter buitendiameter met een lokconnector. Sluit de siliconenslang aan op een peristaltische pomp en een reservoir met gedeïoniseerd water. Verwijder voorzichtig de luchtbellen in de buis en vermijd het genereren van nieuwe bellen tijdens de perfusie.

Stel de peristaltische pomp in op een debiet van 0,2 milliliter per minuut. Blader eerst met gedeïoniseerd water gedurende twee uur en de kleur van de lever zal tijdens de perfusie veranderen van rood naar geel. Schakel de perfusieoplossing over op 0,5% natriumdeoxycholaat en ga 's nachts verder en de lever wordt wit aan het einde van de perfusie.

Schakel de perfusieoplossing over op gedeïoniseerd water en laat gedurende twee uur doorstromen. Gebruik Dumont microtangen en micros verende scharen om de gedecellulariseerde lever te verzamelen en voorzichtig te wassen in een petrischaaltje met PBS. Breng een klein stukje gedecellulariseerde lever over op een microscoopglaasje en plaats het weefsel in het midden.

Voeg 10 microliter antifade montagemedium toe aan het weefsel met een pipet om uitdroging van het weefsel te voorkomen. Bedek de tissue met een dekglas en oefen een kleine kracht uit om het monster plat te maken. Sluit de randen van het afdekglas af met kleurloze en transparante nagellak.

Plaats een druppel van een dompelolie op de bovenkant van het afdekglas en plaats de dia op de microscoopglaashouder. Laat de 20X olieobjectieflens zakken totdat deze in contact komt met de dompelolie. Schakel over naar het violette kanaal met een golflengte van 405 nanometer.

Zet de sluiter aan en stel het monster scherp. Navigeer en positioneer het interessegebied voor beeldvorming. Schakel de sluiter uit voordat u naar beeldacquisitie gaat met behulp van laserlicht.

Om de twee fotonenlaser te starten, schakelt u over naar de computerbesturing en schakelt u eerst de twee fotonenlaser in. Schakel vervolgens de twee fotonenlasercontroller en sluiter in om ervoor te zorgen dat het uitgangsvermogen hoger is dan 2,5 watt. Verminder het laservermogen om fluorescentie-blussen te voorkomen.

Selecteer en pas detectoren aan, zowel fotovermenigvuldigers als de hybride, om plaats te bieden aan de gekozen fluoroforen. Kies gelijktijdige of opeenvolgende beeldacquisities. Stel het gaatje in op de hoogste waarde.

Pas lasergolflengten, versterking, vermogen, verschuiving van de pixelverblijftijd, pixelgroottemiddeling en zoom aan. Schuif door de Z-controller van de computer en stel de Z-afmetingen in. Definieer het begin- en eindpunt en kies het aantal afbeeldingen dat binnen een volume wordt gegeven.

Verkrijg afbeeldingen. Na het uitvoeren van de twee fotonenmicroscopie onthulden collageenvezels zonder decellularisatie een afbeelding met een lage resolutie van het collageennetwerk. In de gedecellulariseerde extracellulaire matrix werden schijnbare verschillen waargenomen in de morfologie en ruimtelijke verdeling tussen chow en fastfooddieetlevers.

Collageenvezels en muizen op een chow-dieet vertoonden een verweven en goed georganiseerd netwerk, terwijl de muizen op een fastfooddieet collageenbundels vertoonden met minder connectiviteit. De driedimensionale structuur van de lever extracellulaire matrix laat zien dat de collageenvezels bij muizen op het chow-dieet een goed georganiseerd netwerk vertoonden, maar niet bij fastfooddieetmuizen. Om de kwaliteit van het fibrillaire collageen in de gedecellulariseerde extracellulaire matrix te bevestigen, werden de dia's gekleurd met Hematoxyline Eosin en Picrosirius rood.

Hematoxyline en Eosine laten zien dat alle cellen zijn verwijderd. In de Picrosirius-rode kleuringsafbeeldingen onthulde de extracellulaire matrix van de met chow gevoede muizen een goed georganiseerd netwerk. En daarentegen vertoonden muizen op een fastfooddieet dichtere collageenvezels.

Verwijder voorzichtig de bubbel in een buis voor de perfusie. De bel blokkeert het vat in de lever en beïnvloedt de perfusie.