Kwantificering van de potentiële impact van producten op basis van glyfosaat op microbiomen

Hier bieden we een workflow met de beste bio-informaticamethode om de experimenten uit te voeren om het effect van glyfosaat op microbiomen te beoordelen. Het belangrijkste voordeel is dat het een robuuste testbare hypothese biedt voor toekomstige veld- en laboratoriumexperimenten. De beschreven methodologie kan worden toegepast op verschillende systemen, waaronder planten, dieren en microben.

Elk onderdeel van de methodologie is vrij eenvoudig. Misschien wel het meest uitdagende deel is om een multidisciplinair team te integreren dat in staat is om verschillende delen van het werk uit te voeren. Suni Matthew, een onderzoeker uit mijn laboratorium, demonstreert de procedure.

Om te beginnen, start experiment één door het experimentele veld te verdelen in 10 replicaties van controle en GBP-behandeling met bufferstroken vegetatie tussen de percelen. Behandel de controlepercelen met leidingwater en de GBP-percelen met commerciële GBP om de maximaal toegestane glyfosaatdosering in landbouwpraktijken na te bootsen. Bemonster de microbiota van experimentele planten.

Verzamel 10 replica's van de plantenmonsters uit het veld, plaats ze onmiddellijk op ijs en breng ze naar het laboratorium voor verdere verwerking. Verzamel voor experiment twee beddengoed, inclusief houtkrullen, uitwerpselen en wat gemorst voer van kwartels gevoed met GBP-verontreinigde of controlevoeders in een volière-experiment van 12 maanden. Stuur de beddingmonsters naar een geaccrediteerd laboratorium voor de glyfosaatconcentratiemetingen direct nadat het is verspreid.

Plant meerjarige gras- en aardbeiplanten in elk perceel om hun wortel- en bladmicrobiota te bestuderen. Identificeer en verwijder de endofytische microben door de plantenmonsters te wassen en te steriliseren. Zodra de monsters zijn gesteriliseerd, extraheert u genomisch DNA met behulp van een in de handel verkrijgbare plant-DNA-extractiekit volgens het protocol van de fabrikant.

Met behulp van een geneste benadering versterkt u de variabele gebieden V6 tot V8 van het 16S-rRNA-gen en maakt u een PCR-mastermix voor het vereiste aantal monsters zoals beschreven in het tekstmanuscript. Gebruik voor de eerste ronde van PCR primers 799 vooruit en 1492 achteruit. Stel het versterkingsprofiel in de thermocycler in gedurende 35 cycli.

Om de versterking te controleren, voert u elektroforese uit met behulp van vijf microliter versterkt product en verdunt u vervolgens de rest 25 microliter van het PCR-product in geautoclaveerd ultrapuur water in de verhouding van één tot 10. Gebruik de universele primers 1062 voorwaarts en 1390 achteruit, voer de tweede versterkingsronde uit met 25 cycli. Verdun de resulterende PCR-producten in geautoclaveerd ultrapuur water in een gelijke verhouding.

Voer de derde ronde van versterking uit met acht cycli om de producten te labelen met de barcodes en P1-adaptervolgorde. Controleer de concentratie in kwaliteit van PCR-producten op een bioanalysator en bundel de volumes bestaande uit 30 nanogram DNA van elk monster in een buis van 1,5 milliliter om een equimolaire bibliotheek te bereiden. Selecteer de amplicons van maat 350 tot 550 basenparen op maatfractionering met behulp van een geautomatiseerd DNA-grootteselectiesysteem op een agarose-gelcassette.

Verzamel de elu die de ampliconen van de opgegeven grootte bevat in een injectieflacon in de cassette, wat resulteert in een gezuiverde 16S rRNA-genenbibliotheek. Breng het verzamelde eluent over in een buis van 1,5 milliliter en controleer de zuiverheid en concentratie op de bioanalysator. Verdun de DNA-bibliotheek met behulp van geautoclaveerd ultrapuur water tot een eindconcentratie van 26 picomolair.

Om het ITS-gebied te versterken, stelt u na het instellen van de reactie met ITS-primers het versterkingsprofiel in op de thermocycler. Analyseer vervolgens vijf microliter van het versterkte product op 1,5% agarosegel en verdun de resterende 25 microliter product in de verhouding van één tot 10 met behulp van geautoclaveerd ultrapuur water. Maak een PCR-mastermix voor het vereiste aantal monsters met voorwaartse primers met streepjescode en omgekeerde primers met P1-adapterlabel.

Gebruik het verdunde PCR-product als sjabloon en voer de tweede versterkingsronde uit. Vergelijkbaar met de bibliotheekvoorbereiding voor het 16S rRNA-gen, bereidt u de bibliotheek voor op het gezuiverde ITS-gebied. Initiëren van de bioinformatica analyses van de EPSPS eiwitsequentie.

Beoordeel de potentiële gevoeligheid van de querysequentie voor glyfosaat van de door de server geleverde uitgangen waarbij output één de fractie van aminozuurmarkers toont die aanwezig zijn in de querysequenties en het aantal motieven. Uitvoer twee toont uitlijningen van de query- en referentiesequenties op basis van markerresiduen. Uitvoer drie toont volledige paarsgewijze uitlijningen van de query- en referentiesequenties.

Output vier toont EPSPS-referentiesequenties van Vibrio cholerae, Coxiella burnetii, Brevundimonas vesicularis en Streptomyces davawensis. Zoek aan het einde van de uitvoerpagina koppelingen naar externe hulpprogramma's zoals BLASTp en bewaarde domeinen om de EPSPS-reeks van de query verder te analyseren. Nadat u de EPSPS-sequenties uit de openbare opslagplaatsen hebt geïdentificeerd, opent u deze gegevenssets vanaf de hoofdpagina van de EPSPS-klasseserver met taxonomische informatie en de EPSPS-klasse van meer dan 50.000 sequenties.

Weeg de bovengrondse biomassa van de planten aan het einde van het veldseizoen om de groei van de planten in GBP en controlepercelen te vergelijken. Breng in een spreadsheet de bacteriële OTU's voor microbioomexperimenten in kaart in vooraf berekende datasets. En bereken op basis van een probabilistische score de intrinsieke gevoeligheid voor glyfosaat.

Deze methode werd gebruikt om veranderingen in gevoeligheid in het EPSPS-eiwit op micro evolutionair niveau te kwantificeren. We identificeerden veranderingen in gevoeligheidsstatus in 12 van de 32 nauw verwante groepen geanalyseerde prokaryoten. Het continue gebruik van de op glyfosaat gebaseerde producten kan dus microbiële dysbiose veroorzaken in de microbiomen van planten, dieren en bodems.

Zorg voor de kwaliteit van pre- en post-PCR-procedures om optimale ampliconbibliotheken te verkrijgen. Zorg er ook voor dat de EPSPS-eiwitsequentie niet gedeeltelijk is voordat u de software gebruikt. Zorg er bij veldexperimenten voor dat besmetting van controles met glyfosaat wordt voorkomen.