Name: Kwantificering van de potentiële impact van producten op basis van glyfosaat op microbiomen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Ontdek een bio-informatica workflow om de impact van glyfosaat op microbiomen te kwantificeren. Deze methode combineert veldexperimenten met DNA-sequencing en EPSPS-eiwitanalyse voor robuust ecologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door de Academie van Finland (subsidie nr. 311077 aan Marjo Helander).

Belangenverstrengeling: geen.

Dit protocol biedt algemene richtlijnen voor het kwantificeren van het effect van GBP op microbiomen op basis van de analyse van het EPSPS-eiwit. Het protocol heeft drie belangrijke kritische stappen: (i) Kwantificering van het EPSPS-eiwit uit microbioomgegevens. Deze stap is van cruciaal belang omdat EPSPS het directe doelenzym van het herbicide is. Soorten die een kopie van het EPSPS-gen hebben, kunnen dus worden beïnvloed door het gebruik van GBP. Niettemin kunnen zelfs soorten die geen kopie van het EPSPS-gen hebben, door het herbicide worden beïnvloed via alternatieve niet-doelmechanismen43,44. (ii) Als de analyse van het EPSPS-gen niet is opgenomen in de opzet van het onderzoek, is het mogelijk om een goede schatting te krijgen door het 16S-rRNA (bacteriën) of ITS (schimmels) te analyseren. In dit geval is het essentieel om te vertrouwen op een uitgebreide referentietabel (de ATGC-database biedt bijvoorbeeld sequenties van het EPSPS-eiwit van verschillende nauw verwante soorten). iii) Het EPSPS-eiwit is verdeeld in potentieel gevoelig of resistent tegen glyfosaat, afhankelijk van bepaalde aminozuurresiduen van de werkzame plaats van het EPSPS. Mutaties die van invloed zijn op een enkel aminozuur kunnen deze classificatieechter veranderen 45 en overgangen tussen klassen kunnen in een relatief korte periode optreden14.
De potentiële gevoeligheid van organismen voor glyfosaat kan worden bepaald door referentiegenomen, aminozuurmarkers en sequentie-uitlijningen. i) Referentiegenomen: Het EPSPS-enzym kan worden ingedeeld als potentieel gevoelig (klasse I [alfa of bèta]46,47) of resistent (klasse II48,49, III50 en IV51) voor glyfosaat op basis van de aanwezigheid van aminozuurmarkers en -motieven (in het geval van klasse III). Deze aminozuurmarkers en -motieven zijn gebaseerd op de locatie van aminozuurresiduen in het EPSPS-eiwit van Vibrio cholerae (vcEPSPS, klasse I), Coxiella burnetii (cbEPSPS, klasse II), Brevundimonas vesicularis (bvEPSPS, klasse III) en Streptomyces davawensis (sdEPSPS, klasse IV). (ii) Aminozuurmarkers: Glyfosaat interageert met het EPSPS-enzym en concurreert met fosfoenolpyruvaat (PEP, het tweede substraat van het EPSPS-enzym)52,53. Bij bepaalde soorten zorgen kleine aminozuurveranderingen in de EPSPS-sequentie voor een hogere affiniteit voor de PEP en een resistentie tegen glyfosaat 12,14,52,54,55. In andere sequenties bindt glyfosaat de EPSPS-sequentie in een niet-remmende conformatie 45. Hoewel veel resistente 12,14,48,49,52,54,55 en tolerante 56,57 EPSP-sequenties tegen glyfosaat zijn beschreven, is het huidige classificatiesysteem voor de EPSPS verdeeld in vier hoofdklassen (I-IV )12 (tabel 5 ). (iii) Sequentie-uitlijningen: Om een EPSPS-enzym te classificeren, voerden we paarsgewijze uitlijningen uit, met een programma voor meerdere sequentie-uitlijningsprogramma-standaardparameters35-, van de querysequentie tegen elk van de referentiesequenties (vcEPSPS, cbEPSPS, bvEPSPS en sdEPSPS). Deze uitlijningen zijn nodig om de posities van de aminozuurmarkers in de queryvolgorde te identificeren. Als gevolg hiervan wordt een enzym geclassificeerd als beschreven12-klasse I, II en /of IV op basis van de aanwezigheid van aminozuurmarkers en op klasse III gebaseerde motiefmarkers.
Het protocol is gebaseerd op vier bekende soorten EPSPS: één type is gevoelig, de andere drie zijn resistent). Ongeveer 10% van de EPSPS-sequenties in prokaryoten is echter nog niet geclassificeerd (16% in archaea en 8% in bacteriën)12. Verder onderzoek moet die sequenties dus analyseren om de gevoeligheid voor glyfosaat te bepalen. De EPSPSClass-server biedt een optie om nieuwe genetische markers te testen. De identificatie van bekende klassen van de EPSPS is eenvoudig, zoals aangegeven in punt 4.4. en figuur 5. Bovendien biedt de server in die gevallen waarin gebruikers hun eigen query- en referentie-eiwitten willen vergelijken, een optie om handmatig een referentiesequentie en een set aminozuurmarkers op te nemen (figuur 11). Deze optie kan worden gebruikt om nieuwe klassen van de EPSPS te identificeren, evenals om andere herbiciden en doelsequenties te testen.
De analyse van de EPSPS-klasse wordt bepaald door sequentieanalyse en de aan-/afwezigheid van aminozuurmarkers. Dit is een voorlopige schatting die kan worden gebruikt voor het testen van hypothesen in het veld. Aminozuurmarkers zijn bepaald in de literatuur op basis van empirische en observationele studies 46,47,48,49,50,51. Referentie-eiwitsequenties om de EPSPS-klasse te bepalen zijn echter slechts in een beperkt aantal soorten getest en kunnen af en toe de resistentie tegen glyfosaat niet verklaren. Het effect van compenserende mutaties en EPSPS-geassocieerde domeinen (meestal in schimmels) kan ook de gevoeligheid voor glyfosaatbeïnvloeden 58. De analyse van dit artikel is gebaseerd op vier EPSPS-klassen. Een onderzoek naar bacteriën in het menselijke darmmicrobioom toonde aan dat ongeveer 30% van hen niet geclassificeerd was (d.w.z. EPSPS-eiwitten van deze soorten behoren niet tot een van de bekende klassen), en aanvullende studies zijn nodig om andere EPSPS-klassen te identificeren. Ook moet worden opgemerkt dat de EPSPS-eiwitsequentie in bacteriën en planten unidomain is, terwijl schimmel EPSPS-eiwitten verschillende domeinen bevatten59. Een eiwitvouwing in schimmels kan dus leiden tot een andere reactie van het EPSPS-enzym op glyfosaat. Bovendien worden aanvullende niet-doelmechanismen van resistentie (bijv. effluxpompen en overexpressie van het EPSPS-gen 13) of gevoeligheid voor glyfosaat (bijv. het effect van glyfosaat op de mitochondriale transportketen12) niet in aanmerking genomen.
Hoewel GBP's al sinds 1974 bestaan als herbicide en sinds 1991 op grote schaal worden gebruikt, is dit de eerste bio-informaticamethode om de potentiële gevoeligheid van organismen voor glyfosaat te bepalen. De methode is gebaseerd op de identificatie van bekende aminozuurresiduen in de doelsequentie. Onze methode geeft dus een basisschatting van het potentiële effect van glyfosaat op de soort. In de nabije toekomst moeten nieuwe bioinformaticamethoden aanvullende klassen van het EPSPS-eiwit omvatten om de potentiële gevoeligheid voor glyfosaat van niet-geclassificeerde sequenties te bepalen 12,54,55. Aangezien het exacte gedrag van het EPSPS-enzym kan variëren door afzonderlijke aminozuurveranderingen 12,14,52,54,55, moeten verdere in silico-experimenten rekening houden met kleine variaties in de vouwing van het EPSPS-eiwit, evenals het effect van de EPSPS-geassocieerde domeinen op de eiwitstructuur in schimmels58 . Bovendien is aangetoond dat tolerantie voor glyfosaat kan worden geproduceerd door overexpressie van het EPSPS-eiwit56,57; bioinformatica-analyses op basis van de verbetering van het codongebruik 60 kunnen dus worden gebruikt om nieuwe EPSPS-sequenties te identificeren die genexpressie maximaliseren of minimaliseren.
Boeren, politici en besluitvormers hebben dringend behoefte aan een grondig begrip van de risico's die gepaard gaan met het zware gebruik van pesticiden. Dus zowel bioinformatische hulpmiddelen die de potentiële gevoeligheid van organismen voor pesticiden onthullen als goed gerepliceerde, gerandomiseerde en veldrealistische experimentele studies uitgevoerd in verschillende omgevingen zijn noodzakelijk. De gepresenteerde bioinformatische methode die is ontworpen om de gevoeligheid van organismen voor glyfosaat te onderzoeken, kan worden gemoduleerd voor andere pesticiden. Evenzo kunnen de methoden van experimentele ecologie worden toegepast om gerelateerde ecologische vragen te bestuderen. Samen kunnen de methoden worden gebruikt om slachtoffers tussen veldobservaties, genomische gegevens en pesticidengebruik aan te tonen. Alle gepresenteerde methoden zijn van onschatbare waarde bij de risicobeoordeling. Bioinformatische methoden kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt bij het monitoren van microbiële aanpassingen aan agrochemicaliën en om een kwantitatieve methode te bieden om de potentiële andere geassocieerde risico's te testen, zoals een toename van de resistentie van pathogenen tegen agrochemicaliën, negatieve effecten op microben die worden gebruikt als biologische bestrijders in geïntegreerde plaagbestrijding (IPM) en antibioticaresistentie bij bacteriën.

Het zware gebruik van pesticiden in de moderne landbouw draagt duidelijk in belangrijke mate bij aan de achteruitgang van de biodiversiteit1. Dit artikel richt zich op glyfosaat omdat op glyfosaat gebaseerde producten (GBP's) wereldwijd de meest gebruikte pesticiden zijn geworden vanwege hun efficiëntie en betaalbare prijs 2,3. Naast het doden van onkruid in landbouwvelden, worden GBP's vaak gebruikt in bosbouw, stedelijke omgevingen en huistuinen; bovendien zijn ze verklaard als niet-toxisch voor niet-doelorganismen als ze worden gebruikt in overeenstemming met de instructies van de fabrikant. Uit een toenemend aantal recente studies is echter gebleken dat residuen van glyfosaat en de afbraakproducten daarvan in de bodem kunnen worden vastgehouden en getransporteerd, waardoor cascaderende effecten op niet-doelorganismenkunnen optreden 4,5,6,7,8 . De effecten van glyfosaat zijn niet alleen beperkt tot planten - de shikimaatroute is ook aanwezig in veel schimmels en prokaryoten. Glyfosaat richt zich op het enzym 5-enolpyruvylshikimaat-3-fosfaatsynthase (EPSPS) in de shikimaatroute, ook bekend als aroA9. Dit enzym bevindt zich in het centrum van de shikimaatroute in de synthese van de drie essentiële aromatische aminozuren (fenylalanine, tyrosine en tryptofaan) en is aanwezig in de meeste prokaryoten, planten en schimmels10,11. Sommige microbiële soorten hebben gedeeltelijke of absolute resistentie tegen glyfosaat ontwikkeld door middel van verschillende mechanismen, waaronder mutaties in de EPSPS-sequenties. Er is dus gesuggereerd dat het gebruik van GBP's een direct effect kan hebben op plantaardige en dierlijke microbiomen, waaronder het menselijke darmmicrobioom 12,13,14. Niettemin kan het gebruik van GBP een negatieve invloed hebben op vrijwel elke ecosysteemfunctie en -dienst die afhankelijk is van microben en door microben gefaciliteerde processen. De daaruit voortvloeiende bedreigingen kunnen betrekking hebben op biochemische bodemprocessen, bestuivingsbiologie en het welzijn van dieren en mensen. Dit vraagt om een uitgebreider begrip van hoe glyfosaat shikimaatroutes en methoden beïnvloedt om de gevoeligheid van microben voor glyfosaat te beoordelen.
In dit protocol presenteren we een pijplijn om het effect van glyfosaat en GBP op het microbioom te testen, van veldexperimenten tot bioinformatica-analyses. We beschrijven in detail een recent gepubliceerde bioinformatica methode die kan worden gebruikt om de potentiële gevoeligheid van organismen voor glyfosaat12 te bepalen. Voor zover de onderzoekers weten, is dit het eerste en tot nu toe enige bioinformatica-instrument om de intrinsieke gevoeligheid van het enzym EPSPS voor het actieve bestanddeel van GBP's te beoordelen. Deze bioinformatica methode is gebaseerd op de detectie van bekende aminozuurmarkers in het glyfosaat doelenzym (EPSPS)12. De pijplijn is verdeeld in vijf belangrijke werkfasen (figuur 1): 1) een korte inleiding tot twee veldexperimenten om het effect van GBP's te testen, 2) een korte samenvatting van microbioomanalyses (16S rRNA, ITS en EPSPS-gen ), 3) het verzamelen van EPSPS-sequenties uit openbare opslagplaatsen, 4) het bepalen van de potentiële gevoeligheid van organismen voor glyfosaat en 5) het beoordelen van de EPSPS-klasse van universele microbiële markers (16S rRNA en ITS).

<table><tbody><tr><td>2100 Bioanalyzer Instrument</td><td>Agilent</td><td>G2939B</td><td>Om de concentratie en kwaliteit van PCR-producten te controleren</td></tr><tr><td>dNTP mix (10 mM elk)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0192</td><td>Voor PCR-reacties</td></tr><tr><td>GoTaq G2 DNA Polymerase kit</td><td>Promega</td><td>M7848</td><td>PCR-buffer en DNA-polymerase voor PCR-amplificatie</td></tr><tr><td>Invisorb Spin Plant Mini Kit</td><td>INVITEK Molecular</td><td>1037100300</td><td>Genoom DNA-extractie uit plantweefsels</td></tr><tr><td>Ion Chip Minifuge</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4479672</td><td>Voor gerichte sequencing van microbiële PCR-producten</td></tr><tr><td>Ion PGM System</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4462921</td><td>Voor gerichte sequencing van microbiële PCR-producten</td></tr><tr><td>Ion PGM Torrent Server</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4483643</td><td>Voor gerichte sequencing van microbiële PCR-producten</td></tr><tr><td>Pippinprep</td><td>SageScience</td><td>PIP0001</td><td>Voor grootte fractie van PCR-amplicons</td></tr><tr><td>Druktank</td><td>Berthoud</td><td>102140</td><td>Voor het spuiten van glyfosaat-gebaseerde producten in het veld</td></tr><tr><td>Primers</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Op maat gemaakt</td><td>Voor PCR-amplificatie</td></tr><tr><td>Rotorfrees</td><td>Grillo</td><td>984511</td><td>Voor het bewerken van de bodem in experimentele percelen</td></tr><tr><td>S1000 ThermalCycler</td><td>BIO-RAD</td><td>1852196</td><td>Voor PCR-amplificatie</td></tr></tbody></table>

kwantificering van de potentiële impact van producten op basis van glyfosaat op microbiomen

Quantification of the Potential Impact of Glyphosate-Based Products on Microbiomes

Producten op basis van glyfosaat (GBP) zijn wereldwijd de meest voorkomende breedspectrumherbiciden. Het doelwit van glyfosaat is het enzym 5-enolpyruvylshikimaat-3-fosfaatsynthase (EPSPS) in de shikimaatroute, die vrijwel universeel is in planten. De remming van het enzym stopt de productie van drie essentiële aminozuren: fenylalanine, tyrosine en tryptofaan. EPSPS is ook aanwezig in schimmels en prokaryoten, zoals archaea en bacteriën; het gebruik van GBP kan dus een impact hebben op de samenstelling van het microbioom van bodems, planten, herbivoren en secundaire consumenten. Dit artikel is bedoeld om algemene richtlijnen te presenteren om het effect van GBP op microbiomen te beoordelen, van veldexperimenten tot bioinformatica-analyses en een paar testbare hypothesen te bieden. Twee veldexperimenten worden gepresenteerd om de GBP te testen op niet-doelorganismen. Eerst worden plant-geassocieerde microben van 10 gerepliceerde controle- en GBP-behandelingspercelen die no-till-teelt simuleren, bemonsterd en geanalyseerd. In het tweede experiment werden monsters verkregen van experimentele percelen die werden bemest door pluimveemest die glyfosaatresiduen of niet-behandelde controlemest bevatte. Bioinformatica-analyse van EPSPS-eiwitsequenties wordt gebruikt om de potentiële gevoeligheid van microben voor glyfosaat te bepalen. De eerste stap bij het schatten van het effect van GBP op microbiomen is het bepalen van hun potentiële gevoeligheid voor het doelenzym (EPSPS). Microbiële sequenties kunnen worden verkregen uit openbare opslagplaatsen of door middel van PCR-amplificatie. In de meeste veldstudies is de samenstelling van het microbioom echter bepaald op basis van universele DNA-markers zoals het 16S-rRNA en de interne getranscribeerde spacer (ITS). In deze gevallen kan de gevoeligheid voor glyfosaat alleen worden geschat door een probabilistische analyse van EPSPS-sequenties met behulp van nauw verwante soorten. De kwantificering van de potentiële gevoeligheid van organismen voor glyfosaat, gebaseerd op het EPSPS-enzym, biedt een robuuste aanpak voor verdere experimenten om doel- en niet-doelresistente mechanismen te bestuderen.

Het doel van dit protocol is om een algemene pijplijn te bieden, van veldexperimenten tot bioinformatica-analyses, die de potentiële gevoeligheid van organismen voor het herbicide glyfosaat kwantificeert. In experiment 2 was de gemiddelde glyfosaatconcentratie in het kwartelvoer 164 mg/kg en de gemiddelde glyfosaatconcentratie van de uitwerpselenmonsters (urine en fecale stof gecombineerd) 199 mg/kg. Strooisel dat werd verzameld van kwartels die met GBP-besmet voer waren gevoed, had gemiddeld 158 mg/kg en controlebedden van 0,17 mg/kg glyfosaat (tabel 3). In de veldexperimenten reageerden plantensoorten verschillend op glyfosaatresiduen in de bodem (sectie 1). Biomassa van haver en raapzaad was groter in controlebodems in vergelijking met GBP-behandelde bodems. Fababonen en aardappelen bleken echter aan het einde van het groeiseizoen15 baat te hebben bij een GBP-behandeling. Glyfosaat in pluimveemest verminderde de plantengroei in gras (Festuca pratensis) en aardbei (Fragaria x vescana) (sectie 1). De microbiota-analyses van de veldexperimenten zijn nog niet volledig geanalyseerd en worden hier niet gepresenteerd (paragraaf 2). De resultaten van dit protocol, wanneer ze direct (zoals weergegeven in rubrieken 3 en 4) of indirect (rubriek 5) worden gelezen, geven een maat voor het aandeel potentieel gevoelige en resistente organismen tegen glyfosaat in een dataset (figuur 9). Het gebruik van deze methode werd getest met een verzameling EPSPS-eiwitsequenties van microbiële soorten van het kernmicrobioom van de menselijke darm die werden verkregen uit openbare opslagplaatsen12. In de studie werden 890 stammen van de 101 meest voorkomende bacteriesoorten geanalyseerd met de EPSPSClass-methode om het aandeel gevoelige en resistente bacteriën te kwantificeren. De resultaten toonden aan dat 54% van de soorten in het kernmicrobioom van de menselijke darm potentieel gevoelig zijn voor glyfosaat12. Deze trend wordt ook waargenomen in het grootste deel van de prokaryote wereld; bovendien is bij eukaryoten (voornamelijk planten en schimmels) het aandeel potentieel gevoelige soorten nog hoger12. Bovendien hebben we deze methode gebruikt om veranderingen in gevoeligheid in het EPSPS-eiwit op micro-evolutionair niveau te kwantificeren (figuur 10)14. We identificeerden veranderingen in gevoeligheidsstatus in 12 van de 32 nauw verwante groepen geanalyseerde prokaryoten (tabel 4)14. Het continue gebruik van de GBP's kan dus microbiële dysbiose veroorzaken (d.w.z. een onbalans van gevoelige en resistente bacteriesoorten) in planten-, dier- en bodemmicrobiomen. Bovendien is verondersteld dat een toename van glyfosaatresistente bacteriën multiresistente microbiomen kan bevorderen 14,41,42. Dit protocol werpt dus licht op de interpretatie van al deze scenario's, aangezien de EPSPS-classificatiemethode een directe schatting geeft van de intrinsieke gevoeligheid van microbiomen voor glyfosaat. Vanwege de intrinsieke gevoeligheid van het EPSPS-eiwit voor glyfosaat dat fylogenetisch geconserveerd is14, is het mogelijk om de resultaten uit bestaande datasets te extrapoleren naar onbekende microbiomen (figuur 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig01.jpg"> Figuur 1: Algemene pijplijn Dit is een algemene pijplijn om de gevoeligheid voor GBP te analyseren van veldexperimenten tot bioinformatica-analyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig02.jpg"> Figuur 2: Veldexperiment 1 om de effecten van GBP-residuen op gewasplant-geassocieerde microben te testen. Het proefveld bestaat uit afwisselend 10 controlepercelen en 10 GBP-zuiveringspercelen (23 m x 1,5 m) met 1,5 m bufferstroken tussen percelen. Twee keer per jaar sinds 2014 werden de GBP-percelen behandeld met commerciële GBP (glyfosaatconcentratie 450 g L-1, toedieningssnelheid 6,4 L ha-1 in 5 L leidingwater per perceel) en de controlepercelen met dezelfde hoeveelheid leidingwater zonder glyfosaat. De behandelingen werden toegepast met een handbediende druktank met behulp van een plastic kap in de sprinklertip om GBP's te beschermen tegen verspreiding buiten de behandelingspercelen. Na een veiligheidsperiode van twee weken na de GBP-toepassing werden haver (Avena sativa), fababonen (Vicia faba) en raapzaad (Brassica rapa subsp. oleifera) gezaaid en aardappelen (Solanum tuberosum) op de percelen geplant. Microbiotamonsters van de bestudeerde gewasplanten, bladeren en wortels werden sinds de start van het experiment in 2014 verschillende keren verzameld. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig03.jpg"> Figuur 3: Veldexperiment 2 testte de gevolgen van GBP-residuen in mestmeststof voor twee meerjarige gewassen en de bijbehorende microbiota. Beddengoed verzameld uit een 12 maanden durend volière-experiment met Japanse kwartels gevoed met controle- of GBP-besmet voer werd gebruikt als mestmeststof in een veldexperiment. Het experimentele veld bestond uit 18 besturings- en 18 GBP-percelen (1 m x 1 m) gerangschikt in een schaakbordraster van 6 x 6. Het beddengoed werd twee keer verspreid op het proefveld, in augustus 2018 en mei 2019 (25 L / plot). De controlepercelen werden bemest met strooisel dat werd verzameld van kwartels die werden gevoed met controlevoer en GBP-percelen met strooisel van kwartels die werden gevoed met met GBP besmet voer. Glyfosaatresiduen in controlebedden waren 0,17 mg /kg glyfosaat en in GBP-beddengoed was de hoeveelheid 158 mg / kg glyfosaat. Twee endofytensymbiotische (E+), twee endofytenvrije (E-) Festuca pratensis en twee Fragaria x vescana werden per perceel geplant in september 2018, ongeveer een maand na de verspreiding van de eerste beddingen. Metingen van de prestaties en fitheid van planten, evenals bemonstering voor wortel- en bladgerelateerde microbiota werden uitgevoerd tijdens twee opeenvolgende groeiseizoenen (2019 en 2020). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig04.jpg"> Figuur 4: Analyse van de microbiële taxa met behulp van het 16S-rRNA-gen / ITS-gebied en gevoeligheid van microbiomen voor glyfosaat met behulp van het EPSPS-gen . (A) Analyse van 16S-rRNA- of ITS-sequenties om microbiële taxa te identificeren. (B) Analyse van EPSPS-sequenties om de gevoeligheid van microben voor glyfosaat te identificeren (GS-glyfosaatgevoelig/GR-glyfosaatresistent) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig05.jpg"> Figuur 5: Algoritme om de klasse van EPSPS-eiwitsequenties te identificeren. De invoer is een EPSPS-eiwitsequentie in FASTA-formaat. Het algoritme voert vergelijkingen uit met bekende aminozuurmarkers in referentie-eiwitsequenties die de potentiële gevoeligheid voor glyfosaat bepalen. Het algoritme werd geïmplementeerd op de vrij toegankelijke webserver EPSPSClass29. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig06.jpg"> Figuur 6: Basis in- en uitgangen van de EPSPSClass webserver. (A) Input: een EPSPS-eiwitsequentie in FASTA-formaat. (B) Output 1 - identiteit: fractie van aminozuurmarkers aanwezig in de querysequenties (klassen I-IV) en motieven (klasse III). (C) Output 2 - identiteit: uitlijningen van de query- en referentiesequenties. (D) Uitvoer 3 - paarsgewijze uitlijningen van de query- en referentiesequenties. (E) Referentie EPSPS-sequenties: Vibrio cholerae (vcEPSPS, klasse I), Coxiella burnetii (cbEPSPS, klasse II), Brevundimonas vesicularis (bvEPSPS, klasse III), Streptomyces davawensis (sdEPSPS, klasse IV). (F) Links om add-blastp-zoekopdrachten uit te voeren en geconserveerde domeinen <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig06large.jpg" target="_blank">te identificeren Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig07.jpg"> Figuur 7: Toegang tot vooraf berekende datasets van EPSPS-sequenties. Volg de aanwijzingen in de afbeelding om toegang te krijgen tot de vooraf berekende dataset van EPSPS-sequenties. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig07large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig08.jpg"> Figuur 8: Voorbeeld van het schatten van de potentiële gevoeligheid in microbioomprojecten zonder EPSPS-sequenties. Het voorbeeld gebruikt waarden uit de database van Alignable Tight Genomic Clusters30, die sequenties van prokaryote soorten bevat. Hypothetische soorten uit een microbioomproject zijn Staphylococcus aureus, Corynebacterium diphtheriae, Campylobacter jejuni, Chlamydia psittaci en Sulfolobus islandicus. De gevoeligheidsscore voor glyfosaat wordt berekend als Number_Sensitive_Sequences/Total_Number_Of_Sequences. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig08large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig09.jpg"> Figuur 9: Schema van de interpretatie van de resultaten van dit protocol en hypothetische evolutionaire scenario's. (A) In een microbioom is het aandeel potentiële gevoeligheid (in groen) en resistentie (in rood) bacteriën ongeveer 50:50. Zwarte stippen duiden op microbiële soorten die niet zijn geclassificeerd; hun gevoeligheid voor glyfosaat is dus onbekend. In sommige microbiomen is het aandeel gevoelige bacteriën iets hoger, zoals in het menselijke darmmicrobioom12. (B) Na verloop van tijd kan het gebruik van glyfosaat leiden tot microbiële dysbiose (d.w.z. een onbalans in het aandeel gevoelige en resistente bacteriën), wat leidt tot verschillende hypothetische scenario's. (C) Hypothetisch geval 1 (geen selectie): Het gebruik van glyfosaat heeft geen invloed op het microbioom; zo blijft het aandeel gevoelige en resistente bacteriën constant. (D) Hypothetisch geval 2: Het gebruik van glyfosaat verwijdert bacteriën die gevoelig zijn voor glyfosaat uit de populatie. We speculeren dat dit scenario dosisafhankelijk kan zijn. (E) Hypothetisch geval 3: Selectiedruk door het gebruik van glyfosaat verbetert mutaties in het EPSPS-gen die de gevoeligheidsstatus van bacteriën veranderen. Zo wordt de hele microbiële populatie resistent tegen glyfosaat. Bovendien kan er in dit scenario een toename zijn van multiresistente bacteriën. (F) Hypothetisch geval 4: het gebruik van glyfosaat verandert de samenstelling van bepaalde bacteriesoorten, waardoor een onevenwicht ten opzichte van resistente bacteriën ontstaat, terwijl sommige bacteriesoorten ongewijzigd blijven, mogelijk als gevolg van aanvullende resistente mechanismen zoals effluxpompen of door overexpressie van het EPSPS-gen 13. Dit scenario kan ook leiden tot een toename van glyfosaatresistente bacteriën, evenals een toename van bacteriële resistentie tegen extra antibiotica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig09large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig10v2.jpg"> Figuur 10: Verdeling van de voorspelde gevoeligheid voor glyfosaat over de soort boom. Cirkeldiagrammen geven het aandeel soorten aan dat vermoedelijk gevoelig (groen) of resistent (rood) is voor glyfosaat en niet geclassificeerd (zwart). Dit cijfer is aangepast met toestemming van Rainio et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig10largev2.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig10.jpg"> Figuur 11: In- en uitgangen van de EPSPSClass webserver om de eigen referentiesequentie van de gebruiker te testen. (A) Input 1: query sequence. (B) Ingang 2: referentievolgorde. (C) Input 3: aminozuurmarkers in de referentiesequenties. (D) Output: identiteit: fractie van aminozuurmarkers in de querysequenties (klasse I-IV en de eigen referentiesequenties van de gebruiker). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig10large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Tabel 1: Lijst van primers voor PCR-amplificatie van het 16S rRNA-gen en ITS-gebied in microbioomanalyse <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/Table%201-63109R2.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Tabel 2: Codes van het enzym 5-enolpyruvylshikimaat-3-fosfaatsynthase (EPSPS) in verschillende databases <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/Table%202_63109R2.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Tabel 3: Gemiddelde glyfosaatconcentratie <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/Table%203-63109R2.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Tabel 4: Overzichtstabel van het percentage soorten dat gevoelig/resistent is tegen glyfosaat. Deze tabel is aangepast met toestemming van Rainio et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/Table%204-63109R2.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Tabel 5: Posities van de aminozuurmarkers in de referentiesequenties <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/Table%205-63109R2.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>

Producten op basis van glyfosaat (GBP) zijn wereldwijd de meest voorkomende breedspectrumherbiciden. In dit artikel introduceren we algemene richtlijnen om het effect van GBP op microbiomen te kwantificeren, van veldexperimenten tot bioinformatica-analyses.

Kwantificering van de potentiële impact van producten op basis van glyfosaat op microbiomen

Glyphosate-based products (GBP) are the most common broad-spectrum herbicides worldwide. The target of glyphosate is the enzyme ...

Hier bieden we een workflow met de beste bio-informaticamethode om de experimenten uit te voeren om het effect van glyfosaat op microbiomen te beoordelen. Het belangrijkste voordeel is dat het een robuuste testbare hypothese biedt voor toekomstige veld- en laboratoriumexperimenten. De beschreven methodologie kan worden toegepast op verschillende systemen, waaronder planten, dieren en microben.Elk onderdeel van de methodologie is vrij eenvoudig. Misschien wel het meest uitdagende deel is om een multidisciplinair team te integreren dat in staat is om verschillende delen van het werk uit te voeren. Suni Matthew, een onderzoeker uit mijn laboratorium, demonstreert de procedure.Om te beginnen, start experiment één door het experimentele veld te verdelen in 10 replicaties van controle en GBP-behandeling met bufferstroken vegetatie tussen de percelen. Behandel de controlepercelen met leidingwater en de GBP-percelen met commerciële GBP om de maximaal toegestane glyfosaatdosering in landbouwpraktijken na te bootsen. Bemonster de microbiota van experimentele planten.Verzamel 10 replica's van de plantenmonsters uit het veld, plaats ze onmiddellijk op ijs en breng ze naar het laboratorium voor verdere verwerking. Verzamel voor experiment twee beddengoed, inclusief houtkrullen, uitwerpselen en wat gemorst voer van kwartels gevoed met GBP-verontreinigde of controlevoeders in een volière-experiment van 12 maanden. Stuur de beddingmonsters naar een geaccrediteerd laboratorium voor de glyfosaatconcentratiemetingen direct nadat het is verspreid.Plant meerjarige gras- en aardbeiplanten in elk perceel om hun wortel- en bladmicrobiota te bestuderen. Identificeer en verwijder de endofytische microben door de plantenmonsters te wassen en te steriliseren. Zodra de monsters zijn gesteriliseerd, extraheert u genomisch DNA met behulp van een in de handel verkrijgbare plant-DNA-extractiekit volgens het protocol van de fabrikant.Met behulp van een geneste benadering versterkt u de variabele gebieden V6 tot V8 van het 16S-rRNA-gen en maakt u een PCR-mastermix voor het vereiste aantal monsters zoals beschreven in het tekstmanuscript. Gebruik voor de eerste ronde van PCR primers 799 vooruit en 1492 achteruit. Stel het versterkingsprofiel in de thermocycler in gedurende 35 cycli.Om de versterking te controleren, voert u elektroforese uit met behulp van vijf microliter versterkt product en verdunt u vervolgens de rest 25 microliter van het PCR-product in geautoclaveerd ultrapuur water in de verhouding van één tot 10. Gebruik de universele primers 1062 voorwaarts en 1390 achteruit, voer de tweede versterkingsronde uit met 25 cycli. Verdun de resulterende PCR-producten in geautoclaveerd ultrapuur water in een gelijke verhouding.Voer de derde ronde van versterking uit met acht cycli om de producten te labelen met de barcodes en P1-adaptervolgorde. Controleer de concentratie in kwaliteit van PCR-producten op een bioanalysator en bundel de volumes bestaande uit 30 nanogram DNA van elk monster in een buis van 1,5 milliliter om een equimolaire bibliotheek te bereiden. Selecteer de amplicons van maat 350 tot 550 basenparen op maatfractionering met behulp van een geautomatiseerd DNA-grootteselectiesysteem op een agarose-gelcassette.Verzamel de elu die de ampliconen van de opgegeven grootte bevat in een injectieflacon in de cassette, wat resulteert in een gezuiverde 16S rRNA-genenbibliotheek. Breng het verzamelde eluent over in een buis van 1,5 milliliter en controleer de zuiverheid en concentratie op de bioanalysator. Verdun de DNA-bibliotheek met behulp van geautoclaveerd ultrapuur water tot een eindconcentratie van 26 picomolair.Om het ITS-gebied te versterken, stelt u na het instellen van de reactie met ITS-primers het versterkingsprofiel in op de thermocycler. Analyseer vervolgens vijf microliter van het versterkte product op 1,5% agarosegel en verdun de resterende 25 microliter product in de verhouding van één tot 10 met behulp van geautoclaveerd ultrapuur water. Maak een PCR-mastermix voor het vereiste aantal monsters met voorwaartse primers met streepjescode en omgekeerde primers met P1-adapterlabel.Gebruik het verdunde PCR-product als sjabloon en voer de tweede versterkingsronde uit. Vergelijkbaar met de bibliotheekvoorbereiding voor het 16S rRNA-gen, bereidt u de bibliotheek voor op het gezuiverde ITS-gebied. Initiëren van de bioinformatica analyses van de EPSPS eiwitsequentie.Beoordeel de potentiële gevoeligheid van de querysequentie voor glyfosaat van de door de server geleverde uitgangen waarbij output één de fractie van aminozuurmarkers toont die aanwezig zijn in de querysequenties en het aantal motieven. Uitvoer twee toont uitlijningen van de query- en referentiesequenties op basis van markerresiduen. Uitvoer drie toont volledige paarsgewijze uitlijningen van de query- en referentiesequenties.Output vier toont EPSPS-referentiesequenties van Vibrio cholerae, Coxiella burnetii, Brevundimonas vesicularis en Streptomyces davawensis. Zoek aan het einde van de uitvoerpagina koppelingen naar externe hulpprogramma's zoals BLASTp en bewaarde domeinen om de EPSPS-reeks van de query verder te analyseren. Nadat u de EPSPS-sequenties uit de openbare opslagplaatsen hebt geïdentificeerd, opent u deze gegevenssets vanaf de hoofdpagina van de EPSPS-klasseserver met taxonomische informatie en de EPSPS-klasse van meer dan 50.000 sequenties.Weeg de bovengrondse biomassa van de planten aan het einde van het veldseizoen om de groei van de planten in GBP en controlepercelen te vergelijken. Breng in een spreadsheet de bacteriële OTU's voor microbioomexperimenten in kaart in vooraf berekende datasets. En bereken op basis van een probabilistische score de intrinsieke gevoeligheid voor glyfosaat.Deze methode werd gebruikt om veranderingen in gevoeligheid in het EPSPS-eiwit op micro evolutionair niveau te kwantificeren. We identificeerden veranderingen in gevoeligheidsstatus in 12 van de 32 nauw verwante groepen geanalyseerde prokaryoten. Het continue gebruik van de op glyfosaat gebaseerde producten kan dus microbiële dysbiose veroorzaken in de microbiomen van planten, dieren en bodems.Zorg voor de kwaliteit van pre- en post-PCR-procedures om optimale ampliconbibliotheken te verkrijgen. Zorg er ook voor dat de EPSPS-eiwitsequentie niet gedeeltelijk is voordat u de software gebruikt. Zorg er bij veldexperimenten voor dat besmetting van controles met glyfosaat wordt voorkomen.

quantification-potential-impact-glyphosate-based-products-on

Research

JoVE Journal

Environment

Milieu

Microbiële consortia binnen bumble bee-hives verrijken en behouden van pollen voor larven van de honingbij. Met behulp van de volgende generatie sequencing, samen met laboratorium en veld gebaseerde experimenten, dit manuscript wordt beschreven protocollen gebruikt om te testen van de hypothese dat fungicide residuen veranderen de stuifmeel microbiome, en de kolonie demografie, uiteindelijk leidde tot de kolonie verlies.

Empirische, Metagenomic en computationele technieken verlichten de mechanismen door welke fungiciden compromis Bee gezondheid

Opgraving van plantenwortels uit het veld en verwerking van de monsters in endosphere, rhizosfeer en bodem worden in detail, met inbegrip van DNA-extractie en gegevens analysemethoden beschreven. Dit document is bedoeld om andere laboratoria maken gebruik van deze technieken voor de studie van de bodem, endosphere en microbiomes van de rhizosfeer.

Isolatie en analyse van microbiële gemeenschappen in bodem, rhizosfeer en wortels in de overblijvende gras experimenten

Hier bieden wij gedetailleerde protocollen voor de orale toediening van antibiotica aan muizen, verzameling van fecale monsters, DNA-extractie en kwantificering van fecale bacteriën door qPCR.

Kwantitatieve Polymerase Chain Reaction gebaseerde Analyses van lymfkliertest intestinale Microbiota na behandeling met mondelinge antibiotica

Dit protocol beschrijft een in vitro batch cultuur fermentatiesysteem van menselijke fecale microbiota, met behulp van inuline (een bekende prebiotisch en een van de meest bestudeerde microbiota modulatoren) om het gebruik van dit systeem te demonstreren bij het inschatten van de effecten van specifieke interventies op fecale microbiota samenstelling en metabole activiteiten.

Een in vitro batch cultuur model om de effecten van Interventionele regimes op menselijke fecale microbiota te schatten

De afscheiding van wortelexsudaten is meestal een externe ontgiftingsstrategie voor planten onder stressomstandigheden. Dit protocol beschrijft hoe de impact van xenobiotica op alfalfa kan worden beoordeeld via niet-gerichte metabolomische analyse.

Verzameling van alfalfawortelexsudaten om de impact van di (2-ethylhexyl) ftalaat op de productie van metabolieten te bestuderen

Caenorhabditis elegans is een krachtig model om de moleculaire determinanten te onderzoeken die de interacties tussen gastheer en microbioom aansturen. We presenteren een pijplijn met hoge doorvoer die de niveaus van darmmicrobioomkolonisatie bij één dier profileert, samen met belangrijke aspecten van de fysiologie van C. elegans.

Toepassing van flowvermimetrie voor kwantificering en analyse van het darmmicrobioom van Caenorhabditis elegans

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de bepaling van de absorptie, translocatie en distributie van imidacloprid in tarwe onder hydroponische omstandigheden met behulp van vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS-MS). De resultaten toonden aan dat imidacloprid kan worden opgenomen door tarwe, en imidacloprid werd gedetecteerd in zowel de tarwewortels als de bladeren.

Bepaling van de absorptie, translocatie en distributie van imidacloprid in tarwe

Dit protocol beschrijft een eenvoudige en efficiënte methode voor de identificatie van 2,4-dibroomfenolmetabolieten in planten.

Opheldering van het metabolisme van 2,4-dibroomfenol in planten

Het protocol beschrijft een nieuwe methode om de integrale cytotoxiciteit van metabolieten van triazolpesticiden in planten te beoordelen.

Beoordeling van cytotoxiciteit van metabolieten van typische triazolpesticiden in planten

Dit protocol biedt een systematisch kader om te beoordelen hoe fytochemicaliën de bactericide effecten van traditionele biociden kunnen versterken met behulp van bactericide activiteitsmodellering en combinatorische interactie-assays, die gericht zijn op het identificeren van synergetische mengsels die de microbiële controle verbeteren en het totale biocidegebruik verminderen.

In vitro Evaluatie van de versterkende effecten van plantaardige moleculen op conventionele biociden

Ontdek een bio-informatica workflow om de impact van glyfosaat op microbiomen te kwantificeren. Deze methode combineert veldexperimenten met DNA-sequencing en EPSPS-eiwitanalyse voor robuust ecologisch onderzoek.

Kwantificering van de potentiële impact van producten op basis van glyfosaat op microbiomen

Meer video's verkennen