Name: Een epitheel schuurmodel voor het bestuderen van corneawondgenezing (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 45 s
Description: Leer een reproduceerbaar epitheel schuurmodel voor corneawondgenezing bij muizen. Deze techniek creëert een precieze wond zonder de basale membraan te beschadigen en maakt onderzoek naar ontsteking en genezing mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Financiering: Ondersteund door: NIH EY018239 (A.R.B., C.W.S., en R.E.R.), P30EY007551 (A.R.B.), en Sigma Xi Grant in Aid of Research (P.K.A.). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet de officiële standpunten van de National Institutes of Health, of Sigma Xi.

Alle dierprotocollen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committees van de Universiteit van Houston en Baylor College of Medicine. De richtlijnen die zijn uiteengezet in de verklaring van de Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) over het gebruik van dieren in visie en oogheelkundig onderzoek werden gevolgd bij het hanteren en gebruiken van de muizen.
1. Voorbereiding
<ol><li>Bereiding van fluoresceïne-oplossing<ol>
<li>Bereid 1% fluoresceïneoplossing door 10 mg natriumfluoresceïnezout op te lossen in 1 ml steriele zoutoplossing of steriele 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). OPMERKING: Bereid natriumfluoresceïne-oplossing op de dag van gebruik of een dag ervoor om microbiële besmetting te voorkomen. Wanneer fluoresceïneoplossing een dag voor gebruik wordt bereid, bewaren bij 4 °C uit de buurt van licht. Wikkel buizen met aluminiumfolie om fotobleken te voorkomen.</li>
		<li>Verdeel de oplossing in aliquots die geschikt zijn voor gebruik in één experiment. Per muis per tijdstip wordt 1-1,5 μL fluoresceïneoplossing gebruikt. Gebruik de volgende formule om het aliquotvolume te berekenen dat geschikt is voor één experiment: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63112/63112eq01.jpg"> OPMERKING: Als bijvoorbeeld zes muizen worden bestudeerd in een enkel experiment met wondgrootte die op vijf tijdstippen wordt gecontroleerd, zou het volume aliquot dat geschikt is voor dat ene experiment zijn: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63112/63112eq02.jpg">
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiding van ketamine / xylazine cocktail voor anesthesie van muizen.<ol>
<li>Om 10 ml cocktail te bereiden, mengt u 2,0 ml ketamine (100 mg / ml) met 1,0 ml xylazine (20 mg / ml) en voegt u 7,0 ml steriel PBS toe. Bereid ketamine / xylazine cocktail een dag voor of op de dag van de operatie. OPMERKING: Alle oplossingen moeten bij kamertemperatuur worden gebruikt, tenzij anders vermeld.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Anesthesie
<ol><li>Weeg de muis (8-12 weken oude C57BL/6 wildtype muizen) om de juiste hoeveelheid verdoving te bepalen om toe te dienen. Gebruik de tweehandige muisvergrendelingstechniek om muizen in bedwang te houden en te hanteren voor de injectie van het verdovingsmiddel18. Ketamine/xylazinecocktail intraperitoneaal (i.p.) toedienen in een eindconcentratie van 80 mg/kg ketamine en 8 mg/kg xylazine.</li>
	<li>Wacht tot volledige anesthesie is bereikt voordat u hoornvlieswonden op de muis uitvoert. Evalueer de diepte van de anesthesie door de pedaalreflex na het knijpen van de teen te beoordelen. Wanneer adequate anesthesie is bereikt, mag de muis niet bewegen bij het knijpen van de teen. OPMERKING: Omdat muizen snel lichaamswarmte verliezen tijdens anesthesie, is het belangrijk om een bron van warmte voor muizen te bieden om onderkoeling te voorkomen. Plaats muizen op een warmtebron (verwarmingskussen) tijdens anesthesie- en herstelfasen.</li>
</ol>3. Creatie van hoornvlieswonden
<ol><li>Wond alleen het rechter- of linkeroog. Zorg voor consistentie met het oog (d.w.z. links of rechts) dat gewond is bij het verplaatsen van muis naar muis. OPMERKING: Omdat schaafwonden de zenuwen van het hoornvlies beschadigen en de scherpte verminderen, kan het verwonden van beide ogen aanzienlijk ongemak en aantasting veroorzaken. Omdat pijnstillers het potentieel hebben om ontstekingsreacties te onderdrukken, kan het gebruik ervan een confounder zijn in bepaalde experimenten gericht op het begrijpen van hoornvliesontsteking. Het vermijden van pijnstillers in hoornvlieswondexperimenten werd goedgekeurd door onze Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).</li>
	<li>Om de epitheliale hoornvlieswond te creëren<ol>
<li>Gebruik onder een ontleedmicroscoop de trephine met een diameter van 2 mm (zie figuur 1) om het midden van het hoornvlies af te bakenen, waarbij u het oog wijd open houdt met de duim en wijsvinger om de oogleden vast te houden. Draai de trephine voorzichtig om indruk te maken op het hoornvliesepitheel. OPMERKING: Er moet voor worden gezorgd dat er geen overmatige druk wordt uitgeoefend bij het gebruik van de trephine, omdat dit kan leiden tot perforatie van het hoornvlies. Ook moet ervoor worden gezorgd dat de trephine centraal wordt geplaatst. De pupillen kunnen worden gebruikt als een oriëntatiepunt om het midden van het hoornvlies te lokaliseren.</li>
		<li>Houd onder een ontleedmicroscoop de stompe golfclubspud (zie figuur 1) op ongeveer 45° van het oppervlak van het hoornvlies binnen het gebied afgebakend met de trephine. Schraap het epitheel zorgvuldig en voortdurend binnen het afgebakende gebied met de spud om het epitheel te debrideren. OPMERKING: Oefen geen overmatige kracht toe in debridement, omdat dit ook corneaperforatie kan veroorzaken. De ogen van muizen kunnen tijdens het verwondingsproces opdrogen, waardoor debridement moeilijk wordt. Breng in een dergelijk geval steriel PBS aan op het oogoppervlak om een optimale hydratatie te behouden.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63112/63112fig01.jpg"> Figuur 1: 2 mm trephine en stompe golfclub spud. De trephine wordt gebruikt om een cirkelvormig gebied in het centrum van het hoornvlies af te bakenen en de golfclubspud wordt gebruikt om het epitheel binnen het afgebakende gebied te verwijderen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63112/63112fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
4. Monitoring van wondsluiting en herepitheelvorming
<ol><li>Pipetteer 1-1,5 μL 1% fluoresceïneoplossing op het gewonde oppervlak en beeld hoornvlies in met behulp van een digitale microscoop met een blauwe lichtbron.</li>
	<li>Verkrijg beelden binnen de eerste minuut van toevoeging van fluoresceïne-oplossing om verspreiding naar het omliggende epitheel te voorkomen, wat leidt tot overschatting van de wondgrootte. Gewonde hoornvliezen worden op specifieke tijdstippen (d.w.z. 0 h, 12 h, 18 h, 24 h en 30 h) na verwonding in beeld gebracht. OPMERKING: Op alle tijdstippen wordt beeldvorming uitgevoerd onder anesthesie; ketamine/xylazine wordt gebruikt op het moment van verwonden, terwijl isofluraan op latere tijdstippen wordt gebruikt. Muizen worden individueel gehuisvest in afzonderlijke kooien voor de duur van de wondsluitingsmonitoring. Wanneer ze samen worden gehuisvest, hebben muizen de neiging om de ogen van de nestgenoot te likken, een gedrag waarvan is aangetoond dat het de wondgenezing in verschillende weefsels beïnvloedt19,20.</li>
	<li>Analyseer vastgelegde beelden, traceer het wondgebied met behulp van een beeldanalysesoftware. Het wondgebied voor elk tijdstip wordt uitgedrukt als een percentage van het oorspronkelijke wondgebied op 0 uur.</li>
</ol>5. Immunofluorescentie beeldvorming en analyse
<ol><li>Euthanaseer muizen door een IACUC-goedgekeurde methode (in dit geval een overdosis koolstofdioxide gevolgd door cervicale dislocatie) op de gewenste tijdstippen na het verwonden.</li>
	<li>Oogst oogbollen door zachtjes op de laterale canthus te drukken om de oogbol te verplaatsen met behulp van een irisgebogen schaar. Leid de schaar achter de oogbol om de oogzenuw stevig vast te pakken en knip vervolgens de zenuw door, waardoor de oogbol kan worden verwijderd.</li>
	<li>Bevestig elke oogbol in 1 ml 1x PBS met 2% paraformaldehyde gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en was vervolgens drie keer in 1 ml 1x PBS gedurende 5 minuten elk.</li>
	<li>Gebruik onder een ontleedmicroscoop een chirurgisch mes om een incisie te maken in de sclera, ongeveer 500 μm distale naar de limbus, en snijd vervolgens door de wereldbol. Verwijder met een tang voorzichtig de irisstof uit het hoornvlies en snijd vervolgens voorzichtig het sclerale weefsel weg, zorg ervoor dat de limbus intact blijft.</li>
	<li>Maak vier gedeeltelijke radiale sneden, elk ongeveer 1 mm lang, die zich uitstrekken van het perifere hoornvlies en kort van het midden stoppen om het hoornvlies af te vlakken.</li>
	<li>Permeabiliseren en blokkeren cornea's in 1 ml 2% runderserumalbumine (BSA) en 0,01% TritonX -100 in 1x PBS gedurende 15 minuten gevolgd door blokkering in 2% BSA in 1x PBS gedurende nog eens 45 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Incubeer hoornvliezen 's nachts bij 4 °C in een cocktail van direct gelabelde unieke fluorochroom geconjugeerde antilichamen bereid in 1x PBS met 2% BSA. OPMERKING: Antilichamen zijn gericht op het labelen van specifieke cellen en weefsels van belang. Endotheel, neutrofielen en bloedplaatjes zijn bijvoorbeeld gelabeld met respectievelijk anti-CD3121,22, anti-Ly-6G 23,24 en anti-CD41 25,26 antilichamen. 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) wordt toegevoegd aan de antilichaamcocktail om kernen te visualiseren.</li>
	<li>Was na de incubatie de hoornvliezen driemaal in 1x PBS gedurende 15 minuten elk.</li>
	<li>Monteer hoornvliezen op een microscoopglaasje in een druppel anti-fade fluorescentie montagemedium, bedek met een coverslip en beeld met de gewenste vergroting (4x tot 100x objectief) met behulp van een fluorescentielichtmicroscoop. Maak afbeeldingen van volledige dikte van het hoornvlies in verschillende regio's, zoals geïllustreerd in figuur 2A. OPMERKING: Het patroon van microscopische analyse geïllustreerd in figuur 2A wordt gebruikt voor het analyseren van specifieke regionale veranderingen in ontsteking en celdeling. Zowel DAPI- als Ly-6G-kleuring worden gebruikt om de extravasculaire neutrofielen te identificeren. Bij DAPI-kleuring hebben bolvormige neutrofielen een duidelijke hoefijzer- of donutvormige kern (figuur 2B).</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63112/63112fig02.jpg"> Figuur 2: Corneabeeldvormingsstrategie en neutrofiele infiltratie na centrale slijtage. (A) Schematische weergave van een hoornvlies wholemount met negen microscopische velden over de diameter van het hoornvlies. Het grijze gebied vertegenwoordigt het oorspronkelijke wondgebied. De breedte van elk gebied is 500 μm. (B) Let op de verschillende hoefijzer- of donutvorm van neutrofiele kernen met DAPI-kleuring. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63112/63112fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het doel van dit methodedocument was om een protocol te beschrijven voor het maken van een centrale cornea-epitheliale schuurwond in de muis met behulp van een trephine en een stompe golfclubspud. Dit muizenmodel is gebruikt om hoornvliesontsteking en de bijdrage ervan aan wondgenezing te bestuderen. Dit type model kan worden gebruikt om hoornvlieswondgenezingsmechanismen te bestuderen onder normale fysiologische omstandigheden en bij pathologieën 17,28,29,41,42....

Het hoornvlies is het transparante voorste een derde van het oog. Het hoornvlies heeft verschillende functies, waaronder het beschermen van de binnenste structuren van het oog en het vormen van een structurele barrière die het oog beschermt tegen infecties1. Wat nog belangrijker is, het hoornvlies is van cruciaal belang voor het gezichtsvermogen en levert ongeveer tweederde van de brekingskracht van het oog 2,3. Cruciaal voor de rol van het hoornvlies in het zicht is de transparantie ervan. Vanwege de naar buiten gerichte positie wordt het hoornvlies echter dagelijks blootgesteld aan een breed scala aan verwondingen die kunnen leiden tot verstoring van de barrièrefunctie, verlies van transparantie en uiteindelijke blindheid. Verlies van hoornvliestransparantie is wereldwijd een belangrijke oorzaak van slechtziendheid 4,5. Cornea-schaafwonden zijn een veel voorkomende reden voor bezoeken aan de eerste hulp (ER), goed voor de helft van de ooggerelateerde gevallen die op de ER6 worden gepresenteerd. Meer dan 1 miljoen mensen lijden naar schatting jaarlijks aan ooggerelateerd letsel in de Verenigde Staten7. Efficiënte hoornvlieswondgenezing als reactie op deze verwondingen is cruciaal voor het behoud van corneahomeostase en het behoud van de transparantie en refractieve mogelijkheden. In geval van gecompromitteerde hoornvlieswondgenezing wordt het hoornvlies kwetsbaar voor infecties, ulceraties en littekens 8,9. Ook de toenemende populariteit van refractieve operaties plaatst een unieke traumatische uitdaging op het hoornvlies10. Gezien het fundamentele belang van cornea wondgenezing voor het behoud van corneatransparantie en visie, is een beter begrip van het normale hoornvlieswondgenezingsproces een voorwaarde voor het begrijpen van verminderde hoornvlieswondgenezing geassocieerd met infectie en ziekte.
Daartoe zijn verschillende diermodellen van hoornvlieswondgenezing ontwikkeld 11,12,13,14,15. Murine-modellen van hoornvlieswondgenezing zijn nuttig gebleken bij het bevorderen van ons begrip van de hoornvlieswondgenezingsmechanismen die onder normale fysiologische omstandigheden werken. Verschillende soorten hoornvlieswonden zijn gebruikt bij het bestuderen van hoornvlieswondgenezing, elk geschikt voor het onderzoeken van verschillende aspecten van het wondgenezingsproces. De meest voorkomende soorten wondmodellen die worden gebruikt in hoornvlieswondgenezingsstudies zijn de mechanische en chemische wondmodellen. Chemische hoornvlieswonden, meestal met betrekking tot het creëren van alkalische brandwonden op het hoornvlies, zijn nuttig voor het bestuderen van hoornvlieszweren, opacificatie en neovascularisatie13. Mechanische hoornvlieswonden omvatten debridement (slijtage) wonden en keratectomiewonden 14,15,16. Een intact of gebroken cornea-epitheelkelkelmembraan definieert respectievelijk debridement- en keratectomiewonden. Bij debridementwonden blijft het epitheliale keldermembraan intact, terwijl bij keratectomiewonden het keldermembraan wordt doorbroken met penetratie meestal in het voorste stroma. Debridementwonden zijn het meest nuttig voor het bestuderen van re-epithelisatie, epitheelcelproliferatie, immuunrespons en zenuwregeneratie na hoornvlieswonden. Keratectomie wonden, aan de andere kant, zijn het meest nuttig voor het bestuderen van cornea littekens14,15.
Hier wordt een protocol beschreven voor het maken van een centrale hoornvliesepitheelslijtagewond in de muis met behulp van een trephine en een stompe golfclubspud. Dit eenvoudige hoornvlies wondgenezingsmodel is zeer reproduceerbaar en goed gepubliceerd en wordt nu gebruikt om gecompromitteerde hoornvlieswondgenezing te evalueren in de context van ziekte17.

<table><tbody><tr><td>Anti-CD31 antilichaam</td><td>BD Bioscience, Pharmingen</td><td>550274</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD41 antilichaam</td><td>BD Bioscience, Pharmingen</td><td>553847</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ly6G antilichaam</td><td>BD Bioscience, Pharmingen</td><td>551459</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumine (BSA)</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>B14</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 muizen</td><td>Jackson Laboratories</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8417</td><td></td></tr><tr><td>DeltaVision wide-field deconvolutiefluorescentiemicroscoop</td><td>GE Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektronische Toploading-weegschalen (weegschaal)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>T038181000CS</td><td></td></tr><tr><td>Golfclub-aardappelschep</td><td>Stephens Instruments</td><td>S2-1135</td><td></td></tr><tr><td>Iriscurve schaar</td><td>Fisher Scientific</td><td>31212</td><td></td></tr><tr><td>Isofluraan</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-893-1389</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-890-8598</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>Natriumfluoresceine zout</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46970</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgisch mes (scapellemes)</td><td>Fine Science Tools</td><td>10022-00</td><td></td></tr><tr><td>Trefine</td><td>Integra Miltex</td><td>33-31</td><td></td></tr><tr><td>TritonX -100</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-295-34</td><td></td></tr><tr><td>Pincet</td><td>Fine Science Tools</td><td>11923-13</td><td></td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-808-1947</td><td></td></tr></tbody></table>

een epitheel schuurmodel voor het bestuderen van corneawondgenezing

An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing

Het hoornvlies is van cruciaal belang voor het gezichtsvermogen en is goed voor ongeveer tweederde van de brekingskracht van het oog. Cruciaal voor de rol van het hoornvlies in het zicht is de transparantie ervan. Vanwege de externe positie is het hoornvlies echter zeer gevoelig voor een breed scala aan verwondingen die kunnen leiden tot het verlies van corneatransparantie en uiteindelijke blindheid. Efficiënte hoornvlieswondgenezing als reactie op deze verwondingen is cruciaal voor het behoud van corneahomeostase en het behoud van corneatransparantie en brekingsvermogen. In geval van gecompromitteerde hoornvlieswondgenezing wordt het hoornvlies kwetsbaar voor infecties, ulceraties en littekens. Gezien het fundamentele belang van cornea wondgenezing voor het behoud van corneatransparantie en visie, is een beter begrip van het normale hoornvlieswondgenezingsproces een voorwaarde voor het begrijpen van verminderde hoornvlieswondgenezing geassocieerd met infectie en ziekte. In de richting van dit doel zijn murinemodellen van hoornvlieswonden nuttig gebleken bij het bevorderen van ons begrip van de genezingsmechanismen van de hoornvlieswond die onder normale fysiologische omstandigheden werken. Hier wordt een protocol beschreven voor het creëren van een centrale cornea-epitheliale slijtage bij muizen met behulp van een trephine en een stompe golfclubspud. In dit model wordt een cirkelvormige trephine met een diameter van 2 mm, gecentreerd over het hoornvlies, gebruikt om het wondgebied af te bakenen. De golfclubspud wordt met zorg gebruikt om het epitheel te debriden en een cirkelvormige wond te creëren zonder het hoornvliesepitheelkelmembraan te beschadigen. De resulterende ontstekingsreactie verloopt als een goed gekarakteriseerde cascade van cellulaire en moleculaire gebeurtenissen die van cruciaal belang zijn voor efficiënte wondgenezing. Dit eenvoudige hoornvlies wondgenezingsmodel is zeer reproduceerbaar en goed gepubliceerd en wordt nu gebruikt om gecompromitteerde hoornvlieswondgenezing in de context van ziekte te evalueren.

Figuur 3 toont een transmissie-elektronenmicrograaf van een hoornvlieswond gemaakt met de stompe golfclubspud, waaruit blijkt dat het epitheliale keldermembraan inderdaad intact is na letsel.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63112/63112fig03.jpg"> Figuur 3: Epitheliaal keldermembraan blijft intact na cornea-abrasie. Transmissie-elektronenmicrograaf van een...

Hier wordt een protocol beschreven voor het maken van een centrale hoornvliesepitheelslijtagewond in de muis met behulp van een trephine en een stompe golfclubspud. Dit hoornvlies wondgenezingsmodel is zeer reproduceerbaar en wordt nu gebruikt om gecompromitteerde hoornvlieswondgenezing in de context van ziekten te evalueren.

Een epitheel schuurmodel voor het bestuderen van corneawondgenezing

The cornea is critical for vision, accounting for about two-thirds of the refractive power of the eye. Crucial to the role of the cornea in vision is its ...

Dit protocol is belangrijk omdat het een uitstekend model is voor het bestuderen van hoornvliesontsteking en de bijdrage ervan aan wondgenezing onder normale en pathologische omstandigheden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een nauwkeurige en reproduceerbare epitheliale wond creëert zonder het keldermembraan te doorbreken. Dit model van hoornvlieswonden is eenvoudig en snel uit te voeren.De procedure wordt gedemonstreerd door Prins Akowuah, een promovendus uit mijn laboratorium. Bereid om te beginnen een 1% fluoresceïneoplossing door 10 milligram natriumfluoresceïnezout op te lossen in één milliliter steriele zoutoplossing of PBS. Bereid vervolgens voor anesthesie 10 milliliter van een ketamine-xylazinecocktail door twee milliliter ketamine, één milliliter xylazine en zeven milliliter steriele PBS te mengen.Na het verdoven van een 8 tot 12 weken oude C57 zwarte 6 wild-type muis, evalueert u de diepte van de anesthesie door de pedaalreflex na teenknijpen te beoordelen. Om de epitheliale hoornvlieswond te maken, plaatst u de verdoofde muis onder een dissectiemicroscoop. Wond alleen het rechter- of linkeroog en behoud de consistentie met het oog dat gewond raakt bij het verplaatsen van muis naar muis.Houd het oog wijd open door de oogleden met duim en wijsvinger vast te houden. Vervolgens, met behulp van een steriele trephine met een diameter van twee millimeter, bakent u het midden van het hoornvlies af en draait u voorzichtig de trephine om indruk te maken op het cornea-epitheel. Oefen geen overmatige druk uit, omdat dit kan leiden tot perforatie van het hoornvlies.Houd vervolgens de steriele stompe golfclubspud in een hoek van ongeveer 45 graden ten opzichte van het oppervlak van het hoornvlies en debrideer het epitheel door zorgvuldig en continu te schrapen binnen het afgebakende gebied met behulp van de spud. Oefen geen overmatige kracht uit en handhaaf de hydratatie indien nodig met behulp van steriel PBS. Voor het bewaken van wondsluiting en herepitheel, pipetteer 1 tot 1,5 microliter 1% fluoresceïne-oplossing op het gewonde oppervlak en stel het hoornvlies in beeld met behulp van een digitale microscoop met een blauwe lichtbron.Stel je het gewonde hoornvlies voor op specifieke tijdstippen na de verwonding. Maak foto's binnen de eerste minuut van toevoeging van fluoresceïneoplossing om verspreiding van de oplossing naar het omliggende epitheel te voorkomen, wat kan leiden tot een overschatting van de wondgrootte. Traceer vervolgens met behulp van een beeldanalysesoftware het wondgebied en druk het wondgebied op elk tijdstip uit als een percentage van het oorspronkelijke wondgebied op nul uur.Een transmissie-elektronenmicrograaf van de hoornvlieswond toont aan dat het epitheelkeldermembraan intact blijft, zelfs na de verwonding. Bij 8 tot 12 weken oude wildtype muizen is de wondsluiting 24 uur na verwonding voltooid. Ontstekingsreactie op verwonding wordt gekenmerkt door celbeeldvorming bij de limbus.Hier afgebeeld is de limbale vasculatuur van een niet-afgewikkeld hoornvlies met extra-vasculaire neutrofielen en die van een gewond hoornvlies met extravasculaire bloedplaatjes en neutrofielen 30 uur na slijtage. Om dit protocol met succes te reproduceren, moet dezelfde spanning in elk bereik van de muis worden gebruikt en moet de wondgrootte en -diepte worden gecreëerd zoals beschreven.

an-epithelial-abrasion-model-for-studying-corneal-wound-healing

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Hier wordt de oprichting beschreven van een klinisch relevant ex vivo model voor een nabootste cataractoperatie dat kan worden gebruikt om mechanismen van het letselrespons van epitheelweefsels binnen hun oorspronkelijke micro-omgeving te onderzoeken.

Oprichting van een klinisch relevante<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mock Cataract Surgery model voor het onderzoeken van Epithelial Wound Repair in een Inheems Microenvironment

Dit protocol beschrijft een methode om een slijtage aan de oculaire oppervlakte van de muis toebrengen, en volgen de wond genezingsproces daarna. Het protocol maakt gebruik van een oogbeschadigingen en/of burr gedeeltelijk verwijderen van de oppervlakte-epitheel van het oog bij verdoofde muizen.

Hoornvlies epitheliale schuren met oogbeschadigingen en/of Burr als een Model voor hoornvlies wondgenezing

Een protocol voor een ex vivo hoornvlies orgel cultuur model nuttig voor wond genezing studies wordt beschreven. Dit modelsysteem kan worden gebruikt om te beoordelen van de effecten van de drug toxiciteit in een georganiseerde 3D meercellige omgeving of agenten om regeneratieve genezing te bevorderen.

Ex Vivo wondgenezing hoornvlies orgel cultuur Model voor Studies

Hier worden diermodellen op basis van muis en konijn ontwikkeld voor mechanisch en chemisch letsel van hoornvliesepitheel om nieuwe therapieën en het onderliggende mechanisme te screenen.

Ex vivo en in vivo diermodellen voor mechanische en chemische verwondingen van cornea-epitheel

Het huidige protocol demonstreert de verschillende stappen die betrokken zijn bij het verwonden van het hoornvlies van een embryonaal kuiken in ovo. De regenererende of volledig herstelde hoornvliezen kunnen worden geanalyseerd op regeneratief potentieel met behulp van verschillende cellulaire en moleculaire technieken na de verwondingsprocedure.

Onderzoek naar littekenloze weefselregeneratie bij embryonale gewonde kikkererwtenhoorns

Dit protocol richt zich op het beschadigen van het oculaire oppervlak van zebravissen door middel van slijtage om de daaropvolgende wondsluiting op cellulair niveau te beoordelen. Deze benadering maakt gebruik van een oculaire braam om het hoornvliesepitheel gedeeltelijk te verwijderen en maakt gebruik van scanning elektronenmicroscopie om veranderingen in de celmorfologie tijdens wondsluiting te volgen.

Zebrafish Corneal Wound Healing: van abrasie tot wond closure imaging analyse

Hier stellen we drie verschillende methoden voor om de sensorische vezels die het hoornvlies innerveren te beschadigen. Deze methoden vergemakkelijken de studie van axonregeneratie bij muizen. Deze drie methoden, die kunnen worden aangepast aan andere diermodellen, zijn ideaal voor de studie van de fysiologie en regeneratie van de innervatie van het hoornvlies.

Drie strategieën om neurotrofe keratitis en zenuwregeneratie in het hoornvlies van muizen te induceren

We ontwikkelden een rattenmodel van ernstige hoornvliesontsteking door middel van hoornvliesepitheelcurettage in combinatie met hoornvlieshechtingen. De studie evalueerde ontstekingspatronen van het hoornvlies, epitheliale proliferatie en veranderingen in limbale stamcellen onder ontstekingsomstandigheden.

Het opzetten van een model voor ernstige hoornvliesontsteking bij ratten op basis van hoornvliesepitheelcurettage in combinatie met hoornvlieshechtingen

We hebben een minimaal invasieve techniek om een ​​konijn ischemische oor wond model te creëren door het verdelen van de centrale ader en zenuw-en de craniale neurovasculaire bundel. Een subcutane tunnel snijdt dan alle onderhuidse weefsels. Deze procedure zorgt ervoor dat een minimale verstoring van de huid en kan veilig gebruikt worden bij diabetische dieren.

Een vereenvoudigde methode voor het produceren van een ischemische Wound Model

Een murine model van cutane wondgenezing die kunnen worden gebruikt om therapeutische samenstellingen te beoordelen fysiologische en pathofysiologische instellingen.

Muizenmodel van wondgenezing

Leer een reproduceerbaar epitheel schuurmodel voor corneawondgenezing bij muizen. Deze techniek creëert een precieze wond zonder de basale membraan te beschadigen en maakt onderzoek naar ontsteking en genezing mogelijk.

Een epitheel schuurmodel voor het bestuderen van corneawondgenezing

Meer video's verkennen