Heuristische mijnbouw van hiërarchische genotypen en accessoire genoom loci in bacteriële populaties
7 december 2021
Dit analytische computationele platform biedt praktische richtlijnen voor microbiologen, ecologen en epidemiologen die geïnteresseerd zijn in bacteriële populatiegenomica. In het bijzonder demonstreerde het hier gepresenteerde werk hoe uit te voeren: i) fylogenie-geleide mapping van hiërarchische genotypen; ii) op frequentie gebaseerde analyse van genotypen; iii) verwantschaps- en klonaliteitsanalyses; iv) identificatie van afstammingsonderscheidende accessoire loci.
Dit analytische protocol maakt de studie van pathogene populaties van bacteriën op grote schaal mogelijk. Dat is heel belangrijk omdat het de manier waarop ecologisch en epidemiologisch onderzoek kan worden gedaan, verbetert. Maar om dat te laten gebeuren, hebben we een geautomatiseerde en schaalbare tool nodig, of een computationeel platform waarmee vele duizenden genoomsequenties tegelijk kunnen worden geanalyseerd.
ProkEvo past in die niche en maakt het mogelijk om praktische bacteriële populatieanalyse op schaal uit te voeren, terwijl pan-genomische inhoud in kaart wordt gebracht, die genotypen en unieke kenmerken van die genotypen beoordeelt voor ecologisch en epidemiologisch onderzoek. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is het gebruik van krachtige, geautomatiseerde en schaalbare computationele platforms, zoals ProkEvo om heuristische mijnbouw van hiërarchische genotypen in bacteriële populaties uit te voeren. Het analyseprotocol dat hier vandaag wordt gepresenteerd, heeft verschillende praktische implicaties.
Een daarvan is om diagnostiek te vergemakkelijken in de zin dat bacteriële genotypen in realtime in kaart kunnen worden gebracht en gevolgd, op een schaalbare manier, waardoor pathogene afstammingslijnen van pathogenen kunnen worden onderscheiden en gedefinieerd om die pathogenen in verschillende omgevingen te volgen en in kaart te brengen. Een andere toepassing is om het routinematige toezicht op volksgezondheidslaboratoria en regelgevende instanties te verbeteren, wat wordt gedaan om het volgen van pathogenen in verschillende commerciële omgevingen te vergemakkelijken. Het hier gepresenteerde protocol biedt praktische richtlijnen voor microbiologen, ecologen, epidemiologen en iedereen die geïnteresseerd is in bacteriële populatiegenomica.
ProkEvo is een open source en openbaar beschikbaar platform en de GitHub-pagina biedt gedetailleerde gebruiksinstructies. Het protocol dat hier wordt uitgelegd, is ook te vinden op GitHub. Met de meegeleverde instructies willen we ProkEvo en dit protocol gemakkelijk te gebruiken maken en te gebruiken door beginnende en gevorderde onderzoekers.
Begin met het uitvoeren van de analyses met behulp van Gigi-boom om een fylogenetische boom samen met genotypische informatie te plotten. Optimaliseer hiervoor de gigi-boomfiguurgrootte, inclusief de diameter en breedte van ringen door de numerieke waarden in de x-lim- en G-heatmap te wijzigen. Wanneer u meerdere gegevenslagen plot met de fylogenetische boom, verzamelt u alle metagegevens in het laagst mogelijke aantal categorieën om de keuze van het kleurpaneel te vergemakkelijken.
Voer de gegevensaggregatie uit op basis van de vraag naar interesse en domeinkennis. Als u klaar bent, gebruikt u een staafplot om de relatieve frequenties te beoordelen door gegevens te aggregeren voor het sequentietype of ST-afstammingslijnen en multilocus-sequentietypering van het kerngenoom of cgMLST-varianten om visualisaties te vergemakkelijken. Kies een empirische of statistische drempel die wordt gebruikt voor gegevensaggregatie.
De voorbeeldcode kan worden gebruikt om de frequentieverdeling van de ST-afstammingslijnen te inspecteren en de afsnijding te bepalen. De voorbeeldcode laat zien hoe kleine of laagfrequente ST's worden samengevoegd. De ST's die niet genummerd zijn, kunnen worden gegroepeerd als andere ST's.
Gebruik een vergelijkbare code voor de cgMLST-varianten. Gebruik de geneste benadering om het aandeel van elke ST-afstamming binnen elke BAPS1-subgroep te berekenen om de ST's te identificeren die tot dezelfde BAPS1-subgroep behoren. De code illustreert hoe de op ST gebaseerde verhouding kan worden berekend over de BAPS1-subgroepen.
Om de verdeling van antimicrobiële resistentie of AMR-loci over de ST-afstammingslijnen uit te zetten, gebruikt u een empirische of statistische drempel om de belangrijkste AMR-loci eruit te filteren om visualisaties te vergemakkelijken. Zorg voor een rauwe. csv-bestand met de berekende verhoudingen van alle AMR-loci over alle ST-afstammingslijnen.
Bereken vervolgens de AMR-verhouding voor elke ST met behulp van de code. Nadat de berekeningen voor alle ST's zijn uitgevoerd, combineert u de gegevenssets als één gegevensframe met behulp van de code en exporteert u vervolgens het csv-bestand met de berekende verhoudingen met de code. Voordat u de op AMR gebaseerde verdeling over de ST-afstammingslijnen plot, filtert u de gegevens op basis van een drempelwaarde om visualisaties te vergemakkelijken.
Plot vervolgens de fylogenie van het kerngenoom samen met de hiërarchische genotypische classificaties in AMR-gegevens in een enkele plot met behulp van Gigi-boom. Optimaliseer vervolgens de figuurgrootte in de Gigi-boom met behulp van de eerder genoemde parameters. Optimaliseer de visualisaties door de variabelen samen te voegen of binaire classificatie te gebruiken, zoals de aan- of afwezigheid van het gen.
De hiërarchische populatiestructuur van Salmonella enterica-afstamming één in de context van een kerngenoom fylogenie werd onderzocht. De relatieve frequenties van alle hiërarchische genotypen werden vervolgens gebruikt om de totale verdeling en de meest waargenomen classificaties te evalueren. Minder frequente ST-afstammingslijnen werden samengevoegd als andere ST's om datavisualisatie te vergemakkelijken.
Evenzo werden minder frequente cgMLST-varianten samengevoegd als andere cgMLST's. De voorouderlijke relaties tussen de ST's werden onderzocht met behulp van een geneste benadering door de relatieve frequentie van ST-afstammingslijnen door de BAPS1-subgroepen of haplotypen te beoordelen. De relatieve frequentie van de ST-afstammingslijn die AMR-loci onderscheidt, werd beoordeeld om unieke accessoire genomische handtekeningen te identificeren die verband houden met de serovar Newport-populatiestructuur.
In de resultaten leken MDFA en AAC6IAA loci voorouderlijk te zijn verworven door de serovar Newport-populatie, terwijl ST45 naar verwachting multiresistent is. In vergelijking met de ST45 zijn de andere belangrijke ST-afstammingslijnen, zoals ST5 en ST118, waarschijnlijk vatbaarder voor meerdere geneesmiddelen. Daarnaast werd een fylogenie-verankerde visualisatie gebruikt om de hiërarchische populatiestructuurgegevens systematisch te integreren.
Dit analytische protocol vormt een basis voor datamining van bacteriepopulaties op schaal. Wat het mogelijk maakt, is dat genotypen op schaal in kaart worden gebracht en gevolgd met behulp van ProkEvo, maar het kan ook worden uitgebreid om andere vragen te beantwoorden, zoals het verkennen van de distributie van metabole routes en virulentiefactoren geassocieerd met genotypische informatie. Dat wil zeggen, we kunnen de fenotypen voorspellen die geassocieerd zijn met specifieke genotypen van belang.
Het hier beschreven protocol maakt zeker de weg vrij voor onderzoekers om nieuwe vragen op het gebied van populatiegenomica te verkennen en evolutionaire en ecologische patronen af te leiden voor zowel pathogene als niet-pathogene bacteriesoorten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een praktisch, schaalbaar protocol voor de genomische analyse van bacteriële populaties met behulp van het computationele platform ProkEvo. Door gebruik te maken van whole-genome sequencing (WGS)-gegevens en hiërarchische genotypische mapping, stelt het protocol onderzoekers in staat om duizenden bacteriële genomen te analyseren, wat ecologische en epidemiologische onderzoeken faciliteert. De aanpak wordt gedemonstreerd met Salmonella Newport, waarbij fylogenetische, genotypische en accessoire genomische gegevens worden geïntegreerd om de populatiestructuur en patronen van antimicrobiële resistentie te onthullen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Bacteriële populatiegenomica
- Computationele biologie
- Microbiële epidemiologie
Achtergrond
- Routine WGS transformeert epidemiologische onderzoeken binnen de volksgezondheid.
- Grootschalige analyse van bacteriële populaties vereist geautomatiseerde, schaalbare computationele instrumenten.
- ProkEvo is een open-source platform dat is ontworpen voor hiërarchische populatiegenomische analyse.
- Het combineren van genotypische mapping met het ontsluiten van het accessoire genoom verbetert de ecologische gevolgtrekking.
Doel van de studie
- Om een reproduceerbaar, schaalbaar protocol te bieden voor bacteriële populatiegenomische analyse met behulp van ProkEvo.
- Om onderzoekers te begeleiden bij het in kaart brengen van hiërarchische genotypes en accessoire loci voor ecologische en epidemiologische inzichten.
- Om praktische toepassingen te demonstreren met behulp van een grote dataset van Salmonella Newport-genomen.
Gebruikte methoden
- Geautomatiseerde analyse van WGS-gegevens met behulp van ProkEvo.
- Fylogenie-gestuurde mapping van hiërarchische genotypen (Serovar → BAPS1 → ST → cgMLST).
- Visualisatie van fylogenetische bomen met genotypische en accessoire gegevens met behulp van Gigi tree in R.
- Aggregatie en frequentieanalyse van sequence types (ST's) en core genome MLST-varianten.
- Beoordeling van de distributie van loci voor antimicrobiële resistentie (AMR) over verschillende lineages.
Belangrijkste resultaten
- Hiërarchische genotypische mapping onthulde de populatiestructuur van Salmonella Newport.
- De ST5- en ST118-lijnen delen een recentere gemeenschappelijke voorouder vergeleken met de sterk clonale ST45.
- ST45 wordt voorspeld als multiresistent, terwijl ST5 en ST118 waarschijnlijk multigevoelig zijn.
- Fylogenie-verankerde visualisaties integreerden genotypische en AMR-gegevens, waarbij lineage-specifieke genomische signaturen werden gehighlight.
Conclusies
- Het protocol maakt schaalbare, reproduceerbare genomische analyses van bacteriële populaties mogelijk.
- De combinatie van hiërarchische genotypische mapping met analyse van het accessoire genoom biedt ecologische en epidemiologische inzichten.
- Deze benadering ondersteunt real-time surveillance en het volgen van pathogene lineages in de publieke gezondheidszorg en regelgevende omgevingen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Dit protocol maakt schaalbare, geautomatiseerde analyse van de genomica van bacteriële populaties mogelijk met behulp van data uit whole-genome sequencing, ter ondersteuning van epidemiologische surveillance en ecologische gevolgtrekking in de publieke gezondheidszorg en regulatoire omgevingen. Door hiërarchische genotypering te integreren met het minen van het accessoire genoom, biedt het een kader voor het minimaliseren van risico's bij de validatie van targets in studies naar antimicrobiële resistentie en virulentiefactoren. De aanpak vergroot het voorspellende vertrouwen in lineage-specifieke genomische signaturen, wat bijdraagt aan go/no-go-beslissingen in vroege discovery-pipelines voor antibacteriële interventies.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door hiërarchische genotypen (Serovar → BAPS1 → ST → cgMLST) in kaart te brengen om de populatiestructuur te verduidelijken en cruciale differentiërende genotypen, zoals sequentietypen, te identificeren.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door frequentieverdelingen van genotypen te beoordelen als benadering voor ecologische fitheid, wat helpt bij het prioriteren van targets met stabiele lineage-associaties.
- Wetenschappelijke waarde: Bepaalt verwantschapsrelaties en genetische diversiteit met behulp van genotypische classificaties, waardoor mechanistische ambiguïteit bij de selectie van targets voor antimicrobiële of antivirulentiestrategieën wordt verminderd.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream-workflows door lineage-specifieke accessoire loci, inclusief markers voor antimicrobiële resistentie (AMR), in kaart te brengen om betrouwbare compound-screening tegen gedefinieerde genetische achtergronden mogelijk te maken.
- Operationele waarde: Pakt de standaardisatie en reproduceerbaarheid van assays aan via fylogenetisch verankerde visualisatie van hiërarchische genotypen en AMR-inhoud, wat consistente resultaten tussen laboratoria faciliteert.
- Operationele waarde: Benadrukt de screeningklaarheid en schaalbaarheid door de geautomatiseerde verwerking van 2.365 Salmonella Newport-isolaten aan te tonen, ter ondersteuning van high-throughput genotypische profilering.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Bespreekt de relevantie voor ziekten door accessoire AMR-loci (bijv. MDFA en AAC6IAA) te koppelen aan lineage-specifieke genomische signaturen in zoönotische pathogenen, wat de uitlijning van translationele biomarkers ondersteunt.
- Wetenschappelijke waarde: Beschrijft de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door ST-gebaseerde verschillen te gebruiken om de ancestrale acquisitie van resistentieloci te volgen, wat risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling informeert.
- Wetenschappelijke waarde: Richt zich op voorspellende risicovermindering door lineage-differentiërende accessoire loci te identificeren die correleren met fenotypische kenmerken zoals multi-drug gevoeligheid of resistentie, waardoor fenotypevoorspelling op basis van genotype mogelijk wordt.
Integratie van pijplijn & workflow
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm, van vroege ontdekking tot lead-identificatie en preklinisch werk, door schaalbare genotypische mapping en analyse van het accessoire genoom te bieden die hypothesetests, pathway-verheldering en biologische risicoreductie ondersteunen.
- Discovery Biology: Legt uit hoe de methode hypothese-toetsing, pathway-verduidelijking of biologische risicoreductie ondersteunt door middel van fylogenie-gestuurde mapping van hiërarchische genotypen en frequentiegebaseerde analyse van ST-lineages.
- Screening: Beschrijft de assay-gereedheid, reproduceerbaarheid of kwantitatieve resultaten wanneer dit door het artikel wordt ondersteund, zoals de proportionele distributie van AMR-loci over ST-lineages voor gestandaardiseerde screeningpanels.
- Analytics: Benadrukt metingen, read-outs of statistische outputs die teams helpen om condities te vergelijken, inclusief berekeningen van de relatieve frequentie van ST-lineages binnen BAPS1-subgroepen en AMR-locus-proporties.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt de methode met preklinische continuïteit of biomarker-afstemming alleen wanneer de bron dit ondersteunt, zoals het mappen van lineage-specifieke AMR-inhoud om evolutionaire en ecologische patronen in pathogene populaties af te leiden.
- Enterprise Hergebruik: Presenteert de methode als een herbruikbare capaciteit in plaats van een eenmalige techniek, met nadruk op de automatisering, schaalbaarheid en open-source beschikbaarheid via ProkEvo voor herhaalde toepassing over verschillende bacteriële soorten en studies.
Operationele & Bedrijfsmatige Impact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid, targetvalidatie, vermindering van mechanistische ambiguïteit.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie en verminderd biologisch risico in een late fase.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering en beslissingen over verdere ontwikkeling.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereiste wetenschappelijke expertise in microbiële genomica, fylogenetica en R-programmering voor hiërarchische populatiegenomische analyse.
- Behoeften op het gebied van instrumentatie en analytische infrastructuur omvatten toegang tot whole-genome sequencing-gegevens, computationele middelen voor schaalbare verwerking en tools zoals Gigi tree voor fylogenetische visualisatie.
- Vereisten voor standaardisatie tussen teams omvatten het aggregeren van metadata in minimale categorieën voor consistente kleurpanelen en het toepassen van empirische of statistische drempelwaarden voor datafiltering en visualisatie.
- Overwegingen voor adaptatie over verschillende modelsystemen omvatten het aanpassen van genotypische hiërarchieën (bijv. Serovar → BAPS1 → ST → cgMLST) en drempelwaarden voor het filteren van accessoire loci op basis van het pathogeen en de onderzoeksvraag.
- Praktische beperkingen ondersteund door het bronmateriaal omvatten de noodzaak om laagfrequente ST's of cgMLST-varianten als 'overig' te aggregeren om visualisatie te vergemakkelijken en de afhankelijkheid van domeinkennis voor data-aggregatie en de selectie van drempelwaarden.
