Name: Cellulaire membraanaffiniteitschromatografiekolommen om gespecialiseerde plantenmetabolieten te identificeren die interageren met geïmmobiliseerde tropomyosinekinasereceptor B (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Leer cellulaire membraanaffiniteitschromatografie om gespecialiseerde plantenmetabolieten te identificeren die interageren met geïmmobiliseerde tropomyosinekinasereceptor B. Deze methode versnelt de ontdekking van biologisch actieve verbindingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Z.C.A. werd ondersteund door de Scientific and Technological Research Council of Turkey (TUBITAK) 2219 - International Postdoctoral Research Fellowship Program. Onderzoek gerapporteerd in deze publicatie werd ondersteund door het National Center for Complimentary and Integrative Medicine van de National Institutes of Health onder toekenningsnummer 1R41AT011716-01. Dit werk werd ook gedeeltelijk ondersteund door de American Society of Pharmacognosy Research Starter Grant, Regis Technologies-subsidie aan L.C. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health.

1. Celkweek van SH-SY5Y neuroblastoomcellen (TrkB en TrkB-NULL (ouderlijke) cellijnen)
OPMERKING: Cellijnen (SH-SY5Y Cell Line (TrkB, BR6) en SH-SY5Y Parental Cell Line (TrkB NULL))49,50 werden gekocht bij Kerafast. Gekweekte cellen worden gebruikt als bron van de transmembraanreceptoren die moeten worden geïmmobiliseerd voor de bereiding van CMAC-kolommen. In de volgende stappen wordt beschreven hoe u celmembraanfragmenten kunt verkrijgen en functionele CMAC-kolommen kunt samenstellen.
<ol><li>Kweek de cellen in een celkweekmedium bereid door 450 ml RPMI-media, 50 ml FBS, 5 ml penicilline / streptomycine-oplossing en 0,3 mg / ml geneticine (G418) te mengen in een celkweekschaal van 150 mm bij 37 ° C in een vochtige atmosfeer met 5% CO2.</li>
</ol>2. Celoogst
<ol><li>Bevestig de celconfluentie (80%-90%) met behulp van een microscoop, bereikt na 3-4 dagen na celpassageing.</li>
	<li>Zuig celkweekmedium op van boven de cellen en was de cellen tweemaal met fosfaatgebuufferde zoutoplossing (PBS, 1x, pH 7,4). Verwijder PBS en voeg 2 ml laag geconcentreerd trypsine (0,25%) toe om cellen los te maken.</li>
	<li>Draai de plaat voorzichtig om alle cellen gelijkmatig te bedekken met trypsine-oplossing en incamineer de cellen gedurende ongeveer 2 minuten bij 37 °C in een vochtige atmosfeer met 5% CO2. Voeg 8 ml celkweekmedium toe aan losmakende cellen en breng losgemaakte cellen over naar een conische buis van 50 ml en plaats deze op ijs.</li>
	<li>Gebruik een hemocytometer om het aantal cellen (ongeveer 3 x 107 cellen) te schatten. Meng celsuspensie door op en neer te pipetteren om een gelijkmatige celdichtheid in het mengsel te verkrijgen. Plaats 10 μL celsuspensie onder de coverslip en tel de cellen onder een microscoop met behulp van een 40x objectief.</li>
</ol>3. Celhomogenisatie
<ol><li>Bereid voorraadoplossingen van de volgende proteaseremmers: benzamidine (200 mM), fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF, 10 mM) en in de handel verkrijgbare proteaseremmers cocktail (100x concentratie) met 4-(2-aminoethyl)benzeensulfonylfluoridehydrochloride (AEBSF), aprotinine, bestatine en leupeptine. LET OP: PMSF mag alleen in de zuurkast worden gehanteerd.<ol>
<li>Bereid benzamidine-stamoplossing (200 mM) door 120 mg benzamidine op te lossen in 5 ml ultrapuur gedeïoniseerd water. Bewaren bij 4 °C en binnen een dag gebruiken. Bereid de oplossing vers voor elk gebruik (aanbevolen).</li>
		<li>Bereid PMSF-stamoplossing (10 mM) door 0,017 g PMSF op te lossen in 10 ml ethanol. Bewaren bij - 20 °C.</li>
		<li>Bereid proteaseremmercocktail (100x) door het in de handel verkrijgbare proteaseremmermengsel op te lossen in 1 ml ultrapuur gedeïoniseerd water. Meng grondig en aliquot 200-300 μL van de cocktail en bewaar bij - 20 °C voor gebruik.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereid ATP-stamoplossing (100 mM) door 55,114 mg ATP-dinatriumzouthydraat op te lossen in 1 ml gedeïoniseerd ultrapuur water. Meng grondig en aliquot 100 μL van het mengsel en bewaar bij - 20 °C voor gebruik.</li>
	<li>Bereid de buffer voor door 3,03 g tris(hydroxymethyl)aminomethaanhydrochloride (Tris-HCl, 50 mM), 2,9 g natriumchloride (NaCl, 100 mM), 0,22 g watervrij calciumchloride (CaCl2, 3 mM), 0,2 g magnesiumchloridehexahydraat (MgCl2, 2 mM) en 0,19 kaliumchloride (KCl, 5 mM) op te lossen in 500 ml ultrapuur gedeïoniseerd water.</li>
	<li>Bereid homogenisatiebuffer door 17,3 ml van de in stap 3.3 bereide buffer te mengen met 0,3 ml (3 mM) benzamidine-stamoplossing, 0,2 ml (0,1 mM) PMSF-stamoplossing, 0,2 ml cocktailmengsel met proteaseremmer, 20 μl (100 μM) ATP-voorraadoplossing, 2 ml (10%) glycerol en 0,029 g (5mM) EDTA (tabel 1). Stel de pH in op 7,4 met behulp van zoutzuuroplossing.</li>
	<li>Draai de in stap 2.3 geoogste cellen gedurende 5 minuten bij 400 x g bij 4 °C af. Verwijder het supernatant en was de resterende celkorrel met 10 ml ijskoude PBS (1x, pH 7,4). Draai de cellen opnieuw af bij 4 °C gedurende 5 minuten bij 400 x g.</li>
	<li>Gooi het supernatant weg en vervang het door 20 ml homogenisatiebuffer die in stap 3.4 is voorbereid. Plaats de conische buis op ijs.</li>
	<li>Breng de celsuspensie over in een 40 ml Dounce homogenisator weefselslijper en plaats deze op ijs. Homogeniseer de ophanging handmatig, op ijs, met behulp van 40 op-en-neer stamperslagen. Breng gehomogeniseerde celsuspensie over in een conische buis van 50 ml.</li>
	<li>Centrifugeer het homogenaat bij 4 °C gedurende 7 minuten bij 400 x g. Gooi de pellet weg en breng het supernatant over in een nieuwe conische buis en centrifugeer het gedurende 30 minuten bij 4 °C bij 47900 x g. Bewaar de celmembraankorrel en gooi het supernatant weg.</li>
</ol>4. Oplosbaarheid van het celmembraan
<ol><li>Bereid de oplosbuffer door 8,7 ml van de in stap 3.3 gemaakte bufferoplossing te mengen met 0,1 ml (0,1 mM) PMSF-stamoplossing, 0,15 ml (3 mM) benzamidine-stamoplossing, 0,1 ml proteaseremmercocktail, 10 μl (100 μM) ATP-voorraadoplossing, 1 ml (10%) glycerol en 0,2 g (2%) natrium cholaat (tabel 2).</li>
	<li>Breng de oplosbuffer over in de conische buis met celmembraanfragmenten verkregen in stap 3.8 en resuspend de pellet. Draai het resulterende mengsel gedurende 18 uur bij 150 tpm bij 4 °C. OPMERKING: Op dit punt kan het experiment worden gepauzeerd voor nachtelijke oplosbaarheid van celmembraankorrels.</li>
</ol>5. Immobilisatie van het celmembraan op IAM. PC. DD2 deeltjes
<ol><li>Centrifugeer na 18 uur het oplosbaarheidsmengsel bij 4 °C gedurende 30 minuten bij 47900 x g.</li>
	<li>Bewaar het bovennatuurlijk en gooi de pellet weg. Voeg 100 mg IAM toe. PC. DD2-deeltjes, naar het supernatant, vortex en roteren het resulterende suspensiemengsel bij 150 tpm bij 4 °C gedurende 1 uur.</li>
	<li>Om de immobilisatie van celmembraanfragmenten op de IAM te vergemakkelijken. PC. DD2-deeltjes gaan verder met de dialysestap zoals hieronder beschreven.<ol>
<li>Bereid dialysebuffer voor in 4 l ultrapuur gedeïoniseerd water door toevoeging van 24 g tris-HCl (50 mM), 23,4 g NaCl (100 mM), 0,06 g CaCl2 (0,1 mM), 5,85 g EDTA (5 mM) en 0,07 g PMSF (0,1 mM; Tabel 3). OPMERKING: PMSF is niet oplosbaar in water, los het daarom eerst op in een klein volume ethanol en voeg het vervolgens langzaam toe aan het bekerglas met de buffer.</li>
		<li>Stel de pH in op 7,4 met zoutzuuroplossing. Plaats de buffer minimaal 1 uur bij 4 °C voordat u overgaat tot de dialysestap.</li>
		<li>Bereid de dialysebuis voor door 10 cm cellulosemembraandialysebuis te snijden (10 K MWCO, 35 mm) en breng de suspensie met IAM over. PC. DD2-deeltjes en celmembraanfragmenten in de dialysebuis. Gebruik dialysebuisclips om beide uiteinden van de dialysebuis te sluiten.</li>
		<li>Plaats de dialysebuis met daarin de IAM. PC. DD2 stationaire fase in de dialysebuffer en dialyseer bij 4 °C gedurende 24 uur onder zacht roeren.</li>
		<li>Plaats na 24 uur de dialyseslang in de vers voorbereide dialysebuffer en ga nog 24 uur verder met dialyse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. CMAC kolom verpakking
<ol><li>Bereid ammoniumacetaatbuffer (10 mM, pH 7,4) voor die zal worden gebruikt om de IAM te wassen. PC. DD2-deeltjes en in kolomkarakteriseringsexperimenten door het oplossen van 0,7708 g ammoniumacetaat in 1 L ultrapuur gedeïoniseerd water. Stel de pH in op 7,4 met zoutzuuroplossing.</li>
	<li>Verwijder na 48 uur dialyse de dialysebuis uit de dialysebuffer en breng de inhoud van de dialysebuis over in een conische buis van 15 ml.</li>
	<li>Centrifugeer het mengsel bij 4 °C gedurende 5 minuten bij 400 x g. Gooi het supernatant weg en was de resterende pellet driemaal met 10 ml ammoniumacetaatbuffer, waarbij u het mengsel na elke wasbeurt gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 400 x g centrifugeert.</li>
	<li>Na de derde wasbeurt, resuspend de resterende pellet in 1 ml ammoniumacetaatbuffer. Meng het grondig en gebruik de resulterende slurry om de 5/20 glazen kolom te verpakken tot CMAC chromatografie kolom.</li>
	<li>Om de kolom te verpakken, plaatst u eerst een bodemfilter dat eerder is gedrenkt met ammoniumacetaatbuffer in de filterhouder. Plaats de filterhouder in de glazen kolom en schroef de kolomdop om de positie van de houder vast te zetten. Plaats de kolom verticaal in een vingerklem en zet hem vast in de labstandaard. Plaats een bekerglas onder de kolom.</li>
	<li>Breng met behulp van een eenkanaals pipettor een klein volume van de in stap 6.4 verkregen slurry over in de glazen kolom. Giet het materiaal langzaam en houd de pipetpunt tegen de glazen kolomwand. Laat het verpakkingsmateriaal bezinken voordat u nog een volume drijfmest giet.</li>
	<li>Om het verpakkingsproces te versnellen, verwijdert u de buffer van boven het stationaire bed met behulp van een micropipette tussen elke stap. Herhaal deze stappen totdat 1 ml van de drijfmest is verpakt.</li>
	<li>Plaats een bovenfilter en schroef de adaptereenheid zo dat er geen buffer boven de stationaire fase overblijft, zoals weergegeven in figuur 1. Bevestig de positie van de adaptereenheid met de adaptervergrendeling.</li>
	<li>Sluit de kolom aan op een HPLC-pomp (High Performance Liquid Chromatography), stel het debiet in op 0,2 ml/min en was de kolom 's nachts met ammoniumacetaatbuffer. De kolom is nu klaar voor de karakteriseringsstap. Bewaar de kolom bij 4 °C tot gebruik. OPMERKING: Voor langere opslag (kolom niet langer dan een week gebruikt) voert u de kolom met 0,05% natriumazideoplossing uit in ammoniumacetaatbuffer en bewaart u deze bij 4 °C. LET OP: Natriumazide is zeer giftig wanneer het oraal wordt ingenomen of door de huid wordt geabsorbeerd; het mag alleen onder de zuurkast worden gehanteerd. Zorg ervoor dat u een laboratoriumjas, veiligheidsbril en handschoenen (nitril bij voorkeur) draagt bij het werken met natriumazide.</li>
</ol>7. CMAC-kolomkarakterisering
<ol><li>Confocale microscopie en BDNF-binding<ol>
<li>Bereid IAM voor. Pcc. DD2 stationaire fasedeeltjes met geïmmobiliseerde celmembraanfragmenten die afzonderlijk zijn verkregen uit SH-SY5Y neuroblastoomcellen die TrkB- en SH-SY5Y TrkB-NULL-cellen overexpresseren door de instructies van stap 1 tot stap 6.4 te volgen.</li>
		<li>Voor monsters die voorafgaand aan antilichaamkleuring met BDNF worden geïncubeerd, bereidt u BDNF-stamoplossing door 10 μg BDNF op te lossen in 100 μL ultrapuur gedeïoniseerd water. Bewaar de oplossing bij -20 °C.<ol>
<li>Breng over in afzonderlijke microcentrifugebuizen van 1,5 ml, 100 μL aliquot IAM. PC. DD2-kolomverpakkingsmateriaal met geïmmobiliseerde SH-SY5Y Neuroblastoomcellen die TrkB en 100 μL aliquot IAM overexpressie geven. PC. Verpakkingsmateriaal van DD2-kolommen met geïmmobiliseerde SH-SY5Y TrkB-NULL-cellen gesuspendeerd in ammoniumacetaatbuffer.</li>
			<li>Voeg 390 μL ammoniumacetaatbuffer, 10 μL BDNF-stamoplossing en 0,5 μL ATP-stamoplossing (bereid in stap 3.2) toe aan elke buis en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met schommelen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Voor monsters die niet zullen worden geïncubeerd met BDNF voorafgaand aan antilichaamkleuring, draagt u 100 μL aliquot IAM over. PC. Verpakkingsmateriaal van de DD2-kolom met geïmmobiliseerde SH-SY5Y Neuroblastoomcellen die TrkB overexpressie geven, gesuspendeerd in ammoniumacetaat in microcentrifugebuizen van 1,5 ml.</li>
		<li>Voeg 400 μL ammoniumacetaatbuffer en 0,5 μL ATP-stamoplossing (bereid in stap 3.2) toe aan elke buis en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met schommelen.</li>
		<li>Draai de in de stappen 7.1.2 en 7.1.4 bereide monsters gedurende 1 min bij 10.000 x g bij 4 °C en gooi het supernatant weg.</li>
		<li>Was de resulterende pellets gedurende 10 minuten met 500 μL ammoniumacetaatbuffer en draai opnieuw bij 4 °C gedurende 1 min bij 10.000 x g en gooi het supernatant weg.</li>
		<li>Voeg aan elk van de pellets 220 μL ammoniumacetaatbuffer, 25 μL 10% normaal geitenserum en 5 μL primair anti-BDNF-antilichaam toe. Incubeer in een koude kamer (4 °C) een nacht met schommelen.</li>
		<li>Na voltooiing van de incubatiestap draait u het mengsel gedurende 1 minuut bij 10.000 x g bij 4 °C en gooit u het supernatant weg.</li>
		<li>Was de resulterende pellet 3 keer met ammoniumacetaatbuffer met 1% mild reinigingsmiddel (bijv. natrium cholaat) gedurende 10 minuten en draai de mengsels gedurende 1 min op 10.000 x g bij 4 °C en gooi het supernatant weg.</li>
		<li>Bereid secundaire antilichaamoplossing door 900 μL ammoniumacetaatbuffer, 100 μL 10% normaal geitenserum en 1 μL fluorofoor-geconjugeerd secundair antilichaam (1:1.000 verdunning) te mengen. Voeg 300 μL secundaire antilichaamoplossing toe aan elk van de in stap 7.1.9 verkregen pellets. en incubeer 's nachts bij 4 °C met schommelen.</li>
		<li>Spin het mengsel gedurende 1 min bij 4 °C op 10.000 x g en gooi het supernatant weg.</li>
		<li>Was de resulterende pellet 3 keer met ammoniumacetaatbuffer met 1% mild reinigingsmiddel (bijv. natrium cholaat) gedurende 10 minuten en draai het mengsel gedurende 1 min op 10.000 x g bij 4 °C en gooi het supernatant weg.</li>
		<li>Resuspend de resulterende pellets in 50 μL ammoniumacetaatbuffer. Plaats 20 μL van elk van de mengsels op een dia en dek af met een coverslip.</li>
		<li>Stel je de IAM voor. PC. DD2-deeltjes met de geïmmobiliseerde celmembraanfragmenten met behulp van een confocale laserscanmicroscoop met excitatie bij 488 nm en emissie bij 520 nm gegenereerd met behulp van een solid state lasersysteem. Gebruik een 20x objectief met een NA van 0,75 en WD van 0,35mm.</li>
	</ol></li>
	<li>Frontale affiniteitschromatografie met 7,8-DHF als markerligand<ol>
<li>Sluit een CMAC-kolom aan op een HPLC-systeem met een diode-array detector en/of massaspectrometer.</li>
		<li>Bereid 500 ml 1 mM-oplossing van 7,8-DHF in ammoniumacetaatbuffer met 5% methanol.</li>
		<li>Pomp de constante concentratie van het markerligand (1 mM) door de CMAC-kolom bij een debiet van 0,4 ml/min bij kamertemperatuur. Bewaak het elutieprofiel met behulp van een DIODE ARRAY DETECTION (DAD) (golflengte 254 nm) detector of massaspectrometer (gebruik single ion monitoring mode; m/z 253 in negatieve ionisatie modus).</li>
		<li>Na voltooiing van de run voert u 's nachts wassen uit door ammoniumacetaatbuffer door de kolom te laten lopen.</li>
		<li>Herhaal stap 7.2.2. - 7.2.4. met behulp van verschillende concentraties van het markerligand (750 nM, 500 nM, 300 nM), waarbij de kolommen na elke run een nacht worden gewassen. Gebruik frontale affiniteitschromatografie om ligand Kd te berekenen, zoals elders in detail besproken. 24,51
</li>
	</ol></li>
	<li>Verplaatsingsstudies met Centella asiatica (L.) Urb. (gotu kola) extract<ol>
<li>Bereid 500 ml 500 nM-oplossing van 7,8-DHF in ammoniumacetaatbuffer met 5% methanol en 0,2% waterig gotu kola-extract (10 mg/ml).</li>
		<li>Pomp constante concentratie van het markerligand (500 nM) met het extract door de kolom bij 0,4 ml/min debiet bij kamertemperatuur. Bewaak het elutieprofiel met behulp van een DAD-detector (golflengte 254 nm) of een massaspectrometer (gebruik de bewakingsmodus met één ion; m/z 253 in negatieve ionisatiemodus).</li>
		<li>Na voltooiing van de run voert u 's nachts wassen uit door ammoniumacetaatbuffer door de kolom te laten lopen.</li>
		<li>Plot de elutieprofielen voor 500 nM 7,8-DHF en de profielen die worden verkregen na het uitvoeren van de oplossing met gotu kola-extract om te inspecteren op markerligandverplaatsing.</li>
	</ol></li>
</ol>8. Ontbrekende piekchromatografiebenadering om potentiële TrkB-bindmiddelen van gotu kola-extract te identificeren
<ol><li>Fractionering van gotu kola extract op CMAC kolommen<ol>
<li>Sluit de CMAC TrkB- en TrkB-NULL-kolommen afzonderlijk aan op een HPLC-systeem en injecteer 50 μL van het waterige gotu kola-extract (10 mg/ml) op elk van de kolommen. Pomp ammoniumacetaatbuffer (10 mM, pH 7,4) met 5% methanol door de kolom bij 0,4 ml/min debiet bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Verzamel fracties afzonderlijk van CMAC TrkB en TrkB-NULL kolommen als volgt: 0-5 min, 5-10 min, 10-15 min, 15-20 min, 20-25 min, 25-30 min, 30-35 min, 35-40 min, 40-45 min, 45-50 min, 50-55 min, 55-60 min.</li>
		<li>Vries en lyofiliseer de verkregen fracties. Resuspend gelyofiliseerde fracties in 50 μL methanol voordat u overgaat tot ultra-performance vloeistofchromatografie en massaspectrometrie-analyse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ultra-performance vloeistofchromatografie quadruole time-of-flight massaspectrometrie (UPLC-QTOF-MS) analyse van gotu kola CMAC fracties<ol>
<li>Analyseer alle in punt 8.1.3 verkregen fracties. met behulp van een massaspectrometer in combinatie met een UPLC-systeem (UPLC-MS E-analysemodus). Analyseer de fracties met behulp van een C18-kolom (2,1 x 50 mm, 1,7 μm) met een C18 VanGuard-voorkolom (2,1 mm x 5 mm, 1,7 μm).</li>
		<li>Eluteer de kolom met behulp van de volgende gradiëntoplossingen met een debiet van 0,3 ml/min met mobiele fase A (water met 0,1% mierenzuur) en B (acetonitril met 0,1% mierenzuur): 0,0 min 99% A 1% B, 1,5 min 84% A 16% B, 5,0 min 80% A 20% B, 7,0 min 75% A 25% B, 10,0 min 65% A 35% B, 20,0-24,0 min 1% A 99% B, 25,0-29,0 min 99% A 1% B.</li>
		<li>Stel het injectievolume voor elk monster in op 3 μL. Voer MSE uit in resolutiepositieve en negatieve ionenmodi, met botsingsenergie bij 4V voor lage energie en 20-35 V voor hoge energie.</li>
		<li>Gebruik de volgende ESI-broncondities in positieve ionisatiemodus: capillaire spanning 1,5 kV, bemonsteringskegel 40 V, bronverschuiving 80, brontemperatuur 100 °C, desolvatietemperatuur. 350 °C, kegelgasstroom 38,0 l/h, desolvatiegas 400 l/h.</li>
		<li>Gebruik de volgende ESI-broncondities in negatieve ionisatiemodus: capillaire spanning 1,45 kV, bemonsteringskegel 40 V, bronverschuiving 80, brontemperatuur 110 °C, desolvatietemperatuur. 300 °C, kegelgasstroom 50,0 l/h, desolvatiegasstroom 652 l/h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Lukasz Ciesla werkt samen met Regis Technologies, de leverancier van de IAM. PC. DD2 deeltjes.

Identificatie van actieve verbindingen die aanwezig zijn in complexe mengsels van gespecialiseerde metabolieten is een zeer uitdagende taak23. Traditioneel worden individuele verbindingen geïsoleerd en wordt hun activiteit getest in verschillende testen. Deze aanpak is tijdrovend en kostbaar en leidt vaak tot isolatie en identificatie van de meest voorkomende en goed gekarakteriseerde verbindingen23. De momenteel gebruikte high-throughput screeningstests zijn sterk afhankel...

Botanische mengsels zijn rijk aan farmacologisch actieve verbindingen1, die dienen als een goede bron voor de identificatie van nieuwe medicijnhits en leads 2,3,4,5. De ontdekking van nieuwe geneesmiddelen uit natuurlijke producten is een vruchtbare aanpak geweest en veel momenteel goedgekeurde geneesmiddelen zijn afkomstig van verbindingen die voor het eerst in de natuur zijn geïdentificeerd. De chemische diversiteit van natuurlijke verbindingen is moeilijk te evenaren door door de mens gemaakte bibliotheken van chemisch gesynthetiseerde moleculen. Veel natuurlijke verbindingen interageren met en moduleren menselijke eiwitdoelen en kunnen worden beschouwd als evolutionair geoptimaliseerde medicijnachtige moleculen6. Deze natuurlijke verbindingen zijn bijzonder geschikt voor de identificatie van geneesmiddellood voor gebruik bij neurologische aandoeningen6. Twee van de momenteel door de FDA goedgekeurde geneesmiddelen voor de behandeling van de ziekte van Alzheimer (AD) zijn afgeleid van natuurlijke alkaloïden, namelijk: galantamine en rivastigmine (een derivaat van fysostigmine)6. Levodopa, momenteel het meest voorgeschreven medicijn voor de ziekte van Parkinson, werd voor het eerst geïdentificeerd uit de brede boon (Vicia faba L.) 7. Pergolide en lisuride, dopaminerge receptoragonisten zijn de derivaten van natuurlijke moederkorenalkaloïden uit de parasitaire schimmel Claviceps purpurea8. Reserpine, een alkaloïde geïsoleerd uit Indiase slangenwortel (Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz) was een van de eerste antipsychotica9. Onlangs zijn ontregelde immuunrespons en systemische ontsteking in verband gebracht met de ontwikkeling van tal van neurologische aandoeningen, zoals depressieve stoornissen of neurodegeneratieve ziekten10. Een plantaardig dieet samen met andere leefstijlinterventies blijkt de cognitieve en functionele vaardigheden bij ouderen te verbeteren 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Bepaalde elektrofiele moleculen die behoren tot triterpenen en polyfenolen blijken ontstekingsreacties te moduleren in zowel in vitro als in vivo modellen12. Natuurlijke verbindingen die α,β-onverzadigde carbonyl (bijv. Curcumine, cinnamaldehyde) of isothiocyanaatgroep (bijv. Sulforafaan) bevatten, interfereren bijvoorbeeld met Toll-like receptor-4 (TLR4) dimerisatie en remmen de stroomafwaartse synthese van pro-inflammatoire cytokines in een muriene interleukine-3-afhankelijke pro-B-cellijn12,22 . Epidemiologisch bewijs wijst er sterk op dat fytochemicaliën in de voeding, aanwezig in complexe voedselmatrices, ook een levensvatbare bron van nieuwe geneesmiddelen kunnen vormen6.
Een van de belangrijkste obstakels bij de identificatie van biologisch actieve moleculen die aanwezig zijn in plantenextracten, waaronder plantaardig voedsel, is de complexiteit van de onderzochte monsters. Traditioneel worden de individuele verbindingen geïsoleerd, gezuiverd en vervolgens getest op biologische activiteit. Deze aanpak leidt meestal tot de identificatie van de meest voorkomende en goed gekarakteriseerde verbindingen. Fenotypische geneesmiddelontdekkingsbenaderingen zonder een gedefinieerd moleculair doelwit zijn afhankelijk van de biogeleide fractionering van complexe mengsels23. In deze benadering wordt een extract gefractioneerd in minder complexe subfracties die vervolgens worden getest in fenotypische assays. De isolatie en zuivering van actieve verbindingen worden geleid door biologische activiteit die in de test wordt geverifieerd. De kennis van de identiteit van een bepaald geneesmiddeldoel kan de identificatie van farmacologisch actieve verbindingen in complexe mengsels aanzienlijk versnellen. Die benaderingen zijn meestal gebaseerd op de immobilisatie van het moleculaire doelwit, bijvoorbeeld een enzym, op een vast oppervlak, zoals magnetische kralen23. De geïmmobiliseerde doelen worden vervolgens gebruikt in de screeningsexperimenten die resulteren in de isolatie van verbindingen die interageren met het doelwit. Hoewel deze benadering op grote schaal is gebruikt bij de identificatie van verbindingen die gericht zijn op cytosolische eiwitten, is deze minder vaak toegepast bij de identificatie van chemicaliën die interageren met transmembraaneiwitten (TMP's)23. Een extra uitdaging bij de immobilisatie van TMP's komt voort uit het feit dat de activiteit van het eiwit afhankelijk is van de interactie met celmembraanfosfolipiden en andere moleculen in de dubbellaag zoals cholesterol 23,24. Het is belangrijk om deze subtiele interacties tussen eiwitten en hun inheemse fosfolipide dubbellaagse omgeving te behouden bij het immobiliseren van het transmembraandoel.
Bij cellulaire membraanaffiniteit chromatografie (CMAC) worden celmembraanfragmenten, en niet gezuiverde eiwitten, geïmmobiliseerd op de stationaire fasedeeltjes van het kunstmatige membraan (IAM) 23. IAM stationaire fasen worden bereid door fosfatidylcholine analogen covalent te binden aan silica. Onlangs zijn nieuwe klassen van IAM stationaire fasen ontwikkeld waarin vrije amine- en silanolgroepen end-capped (IAM. PC. DD2 deeltjes). Tijdens cmac-kolommenvoorbereiding worden celmembraanfragmenten geïmmobiliseerd op het oppervlak van IAM-deeltjes door adsorptie.
CMAC-kolommen zijn tot nu toe gebruikt om verschillende klassen TMP's te immobiliseren, waaronder ionkanalen (bijv. Nicotinereceptoren), GPCR's (bijv. Opioïde receptoren), eiwittransporters (bijv. P-glycoproteïne), enz.24. De geïmmobiliseerde eiwitdoelen zijn gebruikt bij de karakterisering van de farmacodynamiek (bijv. Dissociatieconstante, Kd) of bij het bepalen van bindingskinetiek (kaan en kuit) van liganden met kleine moleculen die interageren met het doelwit, evenals bij het proces van identificatie van potentiële nieuwe geneesmiddelkabels die aanwezig zijn in complexe matrices24 . Hier presenteren we de voorbereiding van CMAC-kolommen met de geïmmobiliseerde tropomyosinekinasereceptor B (TrkB), die naar voren is gekomen als een levensvatbaar doelwit voor medicijnontdekking voor tal van aandoeningen van het zenuwstelsel.
Eerdere studies toonden aan dat de activering van de van de hersenen afgeleide neurotrofe factor (BDNF) / TrkB-route geassocieerd is met de verbetering van bepaalde neurologische aandoeningen, zoals AD of depressievestoornis 25,26,27,28. Er werd gemeld dat BDNF-niveaus en de receptor TrkB-expressie afnemen in AD, en vergelijkbare reducties verminderen de hippocampusfunctie in diermodellen van AD29. Verlaagde niveaus van BDNF werden gemeld in serum en hersenen van AD-patiënten 30,31,32. Tau-overexpressie of hyperfosforylering bleken de BDNF-expressie in primaire neuronen en AD-diermodellen te downreguleren 33,34,35. Bovendien werd gemeld dat BDNF beschermende effecten had op β-amyloïde geïnduceerde neurotoxiciteit in vitro en in vivo36. Directe toediening van BDNF in de hersenen van ratten bleek het leren en geheugen te verhogen bij cognitief gehandicapte dieren37. BDNF /TrkB kwam naar voren als een geldig doelwit voor het verbeteren van neurologische en psychiatrische stoornissen, waaronder AD28,38. Het richten op de BDNF/TrkB-signaleringsroute voor de ontwikkeling van therapieën in AD zal ons begrip van de ziekte mogelijk verbeteren39. Helaas kan BDNF zelf niet als behandeling worden gebruikt vanwege de slechte farmacokinetische eigenschappen en nadelige bijwerkingen40. Kleine molecuulactivatoren van TrkB/BDNF-routes zijn onderzocht als potentiële TrkB-liganden 41,42,43. Van de geteste agonisten met kleine moleculen is aangetoond dat 7,8-dihydroxyflavone (7,8-DHF) de BDNF / TrkB-route 41,44,45,46 activeert. Een derivaat van 7,8-DHF (R13; 4-Oxo-2-phenyl-4H-chromene-7,8-diyl bis(methylcarbamaat)) wordt momenteel overwogen als een mogelijk medicijn voor AD47. Onlangs werd aangetoond dat verschillende antidepressiva werken door direct te binden aan TrkB en BDNF-signalering te bevorderen, waardoor het belang van het nastreven van TrkB als een geldig doelwit voor de behandeling van verschillende neurologische aandoeningen verder wordt benadrukt48.
Het protocol beschrijft het proces van het samenstellen van de functionele TrkB-kolom en de TrkB-NULL-negatieve besturingskolom. De kolommen worden gekarakteriseerd met behulp van een bekend natuurproduct kleinmoleculair ligand: 7,8-DHF. Daarnaast beschrijven we het proces van het screenen van complexe matrices, met behulp van plantenextract als voorbeeld, voor de identificatie van verbindingen die interageren met TrkB.

<table><tbody><tr><td>7-8 Dihydroxyflavone hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5446-10 mg</td><td>&ge;98% (HPLC)</td></tr><tr><td>Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383-1 g</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium acetate</td><td>VWR Chemicals BDH</td><td>BDH9204-500 g</td><td></td></tr><tr><td>BDNF antibody</td><td>Invitrogen</td><td>PA5-15198-400 &mu;L</td><td>Primary antibody; 2 mg/mL of concentration</td></tr><tr><td>Benzamidine hydrochloride hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6506-25 g</td><td></td></tr><tr><td>Brain derived neurotrophic factor (BDNF) human</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3795-10 &mu;g</td><td>Recombinant, expressed in E. coli, lyophilized powder, suitable for cell culture</td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>VWR Analytical</td><td>BDH9224-1 kg</td><td></td></tr><tr><td>Cholic acid sodium salt</td><td>Alfa Aesar</td><td>J62050-100 g</td><td></td></tr><tr><td>Dounce homogenizer</td><td>VWR</td><td>71000-516</td><td>40 mL, 285 mm (overall lenght), 32 x 140 mm (O.D. x H)</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>493511</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>VWR Analytical</td><td>BDH-9232-500 g</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442-500 mL</td><td>sterile-filtered, suitable for cell culture</td></tr><tr><td>G418 disulfate salt solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8168-100 mL</td><td>50 mg/mL in H2O, 0.1 &mu;m filtered, suitable for cell culture</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>VWR Life Science</td><td>E520-100 mL</td><td></td></tr><tr><td>Immobilized artificial membrane (IAM.PC.DD2)</td><td>Regis Technologies, Inc.</td><td>1-771050-500</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate</td><td>VWR Analytical</td><td>BDH9244-500 mL</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>322425</td><td></td></tr><tr><td>Nikon C2 DUVb</td><td>Nikon</td><td></td><td>Confocal laser scanning microscope</td></tr><tr><td>Normal goat serum (10%)</td><td>Life Technologies</td><td>50197Z</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-100 mL</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td><td>Thermo Scientific</td><td>36978-5 g</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>VWR Life Science</td><td>K812-500 mL</td><td>1x</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>VWR Chemicals BDH</td><td>0395-1 kg</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>VWR Life Science Ambreso</td><td>M221-1 mL</td><td>Proteomics grade, containing 50 mM AEBSF, 30 &micro;M aprotonin, 1 mM bestatin, 1 mM E-64 and 1 mM leupeptin</td></tr><tr><td>RPMI-1640 medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758-500 mL</td><td>with L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td></tr><tr><td>Secondary antibody goat anti-rabbit IgG (H+L)</td><td>Invitrogen Alexa Flour Plus 488</td><td>A32731</td><td></td></tr><tr><td>SH-SY5Y Neuroblastoma cell lines expressing Trk-B</td><td>Kerafast</td><td>ECP007</td><td></td></tr><tr><td>SH-SY5Y Trk-NULL cell line</td><td>Kerafast</td><td>ECP005</td><td></td></tr><tr><td>Snake skin dialysis tubing</td><td>Thermo Scientific</td><td>88245</td><td>10K MWCO, 35 mm dry I.D.</td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>BDH VWR Analytical</td><td>BDH9286-2.5 kg</td><td></td></tr><tr><td>Tricorn 5/20 column</td><td>GE Healthcare</td><td>24-4064-08</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>VWR Life Science</td><td>0497-1 kg</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049-500 mL</td><td>0.25%, sterile-filtered, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2&nbsp;g EDTA</td></tr></tbody></table>

cellulaire membraanaffiniteitschromatografiekolommen om gespecialiseerde plantenmetabolieten te identificeren die interageren met geïmmobiliseerde tropomyosinekinasereceptor b

Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns to Identify Specialized Plant Metabolites Interacting with Immobilized Tropomyosin Kinase Receptor B

Chemicaliën gesynthetiseerd door planten, schimmels, bacteriën en ongewervelde zeedieren zijn een rijke bron van nieuwe medicijnhits en -leads. Geneesmiddelen zoals statines, penicilline, paclitaxel, rapamycine of artemisinine, vaak gebruikt in de medische praktijk, zijn voor het eerst geïdentificeerd en geïsoleerd uit natuurlijke producten. De identificatie en isolatie van biologisch actieve gespecialiseerde metabolieten uit natuurlijke bronnen is echter een uitdagend en tijdrovend proces. Traditioneel worden individuele metabolieten geïsoleerd en gezuiverd uit complexe mengsels, na de extractie van biomassa. Vervolgens worden de geïsoleerde moleculen getest in functionele assays om hun biologische activiteit te verifiëren. Hier presenteren we het gebruik van cellulaire membraanaffiniteitschromatografie (CMAC) -kolommen om biologisch actieve verbindingen rechtstreeks uit complexe mengsels te identificeren. CMAC-kolommen maken de identificatie mogelijk van verbindingen die interageren met geïmmobiliseerde functionele transmembraaneiwitten (TMP's) ingebed in hun inheemse fosfolipide dubbellaagse omgeving. Dit is een gerichte aanpak, die vereist dat men de TMP kent waarvan men de activiteit wil moduleren met het nieuw geïdentificeerde kandidaat-geneesmiddel met kleine moleculen. In dit protocol presenteren we een aanpak om CMAC-kolommen voor te bereiden met geïmmobiliseerde tropomyosinekinasereceptor B (TrkB), die naar voren is gekomen als een levensvatbaar doelwit voor het ontdekken van geneesmiddelen voor tal van aandoeningen van het zenuwstelsel. In dit artikel bieden we een gedetailleerd protocol om de CMAC-kolom samen te stellen met geïmmobiliseerde TrkB-receptoren met behulp van neuroblastoomcellijnen die TrkB-receptoren overexpressie geven. We presenteren verder de aanpak om de functionaliteit van de kolom en het gebruik ervan bij de identificatie van gespecialiseerde plantenmetabolieten die interageren met TrkB-receptoren te onderzoeken.

Volgens het protocol werden twee CMAC-chromatografische kolommen samengesteld: één met de geïmmobiliseerde SH-SY5Y neuroblastoomcelmembraanfragmenten met overexpressie TrkB en één met SH-SY5Y TrkB-NULL celmembraanfragmenten. De correct geassembleerde CMAC-kolom is weergegeven in figuur 1 en de stappen die betrokken zijn bij immobilisatie van celmembraanfragmenten zijn weergegeven in figuur 2.
Sinds de immobilisatie van TrkB receptoren...

Het protocol beschrijft de bereiding van celmembraanaffiniteitschromatografie (CMAC) kolommen met geïmmobiliseerde celmembraanfragmenten die functionele transmembraantropomyosinekinasereceptor B-eiwitten bevatten. Het gebruik van CMAC-kolommen bij de identificatie van gespecialiseerde plantenmetabolieten die interageren met deze receptoren en aanwezig zijn in complexe natuurlijke mengsels wordt ook uitgelegd.

Cellulaire membraanaffiniteitschromatografiekolommen om gespecialiseerde plantenmetabolieten te identificeren die interageren met geïmmobiliseerde tropomyosinekinasereceptor B

Chemicals synthesized by plants, fungi, bacteria, and marine invertebrates have been a rich source of new drug hits and leads. Medicines such as statins, ...

Deze verticale presenteert belangrijke stappen in het samenstellen van celmembraanaffiniteitschromatografiekolommen met functionele transmembraanreceptoren. Deze kolommen kunnen worden gebruikt voor de identificatie van kleine moleculen die aanwezig zijn in complexe extracten en interageren met geïmmobiliseerde transmembraanreceptoren. Cellulaire membraanaffiniteitschromatografiekolommen versnellen de identificatie van biologisch actieve verbindingen die aanwezig zijn in complexe mengsels.Het gebruik van cellulaire membraanaffiniteitschromatografiekolommen kan van bijzonder belang zijn voor diegenen die geïnteresseerd zijn in de identificatie van farmacologisch actieve verbindingen die aanwezig zijn in complexe natuurlijke matrices, zoals planten-, schimmel- of bacteriële extracten. Bereid om te beginnen 200 millimolar benzamidine stockoplossing door 120 benzamidine op te lossen in vijf milliliter ultrapuur gedeïoniseerd water. Bereid een 10 millimolaire PMSF-stamoplossing door 0,017 gram PMSF op te lossen in 10 milliliter ethanol in een zuurkast.Bereid 100X proteasenremmer cocktail door het oplossen van commercieel verkrijgbare proteaseremmer mengsel in een milliliter ultrapure gedeïoniseerd water. Meng grondig en aliquot 200 tot 300 microliter van de cocktail. Bereid 100 millimolaire ATP-stamoplossing door 55,114 milligram ATP-dinatriumzouthydraat op te lossen in één milliliter van het geïoniseerde ultrapuur water.Meng grondig en aliquot 100 microliter van het mengsel. Bereid buffer voor door 3,03 gram Tris-HCL, 2,9 gram natriumchloride, 0,22 gram calciumchloride watervrij, 0,2 gram magnesiumchloridehexahydraat en 0,19 gram kaliumchloride op te lossen in 500 milliliter ultrapuur gedeïoniseerd water. Bereid homogenisatiebuffer door 17,3 milliliter van de Tris-buffer te mengen met 0,3 milliliter benzamidine-stamoplossing, 0,2 milliliter PMSF-stamoplossing, 0,2 milliliter proteasenremmercocktail, 20 microliter ATP-stamoplossing, twee milliliter glycerol en 0,029 gram EDTA.Stel de pH in op 7,4 met behulp van zoutzuuroplossing. Draai de cellen geoogst bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten op 400 x g en verwijder het supernatant en was de resterende celkorrel met 10 milliliter 1X pH 7,4 ijskoude PBS. Gooi het supernatant weg en voeg 20 milliliter homogenisatiebuffer toe.Plaats de conische buis op ijs. Breng de celsuspensie over in een 40 milliliter Dounce homogenisator weefselslijper, homogeniseer de suspensie handmatig op ijs met behulp van 40 op en neer stamperslagen. Breng gehomogeniseerde celsuspensie over in een conische buis van 50 milliliter, gooi de pellet weg en breng het supernatant over naar een nieuwe conische buis.Bewaar de celmembraankorrel en gooi het supernatant weg. Bereid oplosbuffer door 8,7 milliliter van de bufferoplossing te mengen met 0,1 milliliter PMSF-stamoplossing, 0,15 milliliter benzamidine-stamoplossing, 0,1 milliliter proteasenremmercocktail, 10 microliter ATP-stamoplossing, één milliliter glycerol en 0,2 gram natriumkorf. Breng de oplosbuffer over in de conische buis met celmembraanfragmenten.En resuspend de pellet. Draai het resulterende mengsel bij 150 RPM bij vier graden Celsius gedurende 18 uur. Centrifugeer na 18 uur het oplosbaarheidsmengsel bij vier graden Celsius gedurende 30 minuten bij 47, 900 x g.Voeg 100 milligram IAM toe. PC. DD2-deeltjes naar het supernatant en roteer het resulterende suspensiemengsel bij 150 RPM bij vier graden Celsius gedurende één uur. Bereid dialysebuffer voor in vier liter ultrapuur gedeïoniseerd water door 24 gram Tris-HCl, 23,4 gram natriumchloride, 0,06 gram calciumchloride, 5,85 gram EDTA en 0,07 gram PMSF toe te voegen.Los PMSF eerst op in een klein volume ethanol en voeg vervolgens langzaam toe aan het bekerglas met de buffer. Snijd 10 centimeter cellulosemembraandialysebuis om de dialysebuis voor te bereiden en breng de suspensie met IAM over. PC. DD2-deeltjes en celmembraanfragmenten in de dialysebuis.Sluit beide uiteinden van de dialysebuis met dialysebuisclips. Plaats de dialysebuis in de dialysebuffer. Plaats na 24 uur de dialyseslang in de vers voorbereide dialysebuffer en ga nog 24 uur door met dialyse.Bereid 10 millimolaire pH 7,4 ammoniumacetaatbuffer voor die zal worden gebruikt om de IAM te wassen. PC. DD2-deeltjes en in kolomkarakteriseringsexperimenten door 0,778 gram ammoniumacetaat op te lossen in één liter ultrapuur gedeïoniseerd water. Verwijder na 48 uur dialyse de dialysebuis uit de dialysebuffer en breng de inhoud van de dialysebuis over in een conische buis van 15 milliliter.Gooi het supernatant weg en was de resterende pellet drie keer met 10 milliliter ammoniumacetaatbuffer. Na de derde wasbeurt, resuspend de resterende pellet in een milliliter ammoniumacetaatbuffer. Meng het grondig en gebruik de resulterende slurry om de 5 x 20 glazen kolom te verpakken om de CMAC-chromatografiekolom te verkrijgen.Om de kolom in te pakken, plaatst u een bodemfilter dat eerder is gedrenkt met ammoniumacetaatbuffer in de filterhouder. Plaats de filterhouder in de glazen kolom en schroef de kolomdop om de positie van de houder vast te zetten. Plaats de kolom verticaal in een vingerklem en zet hem vast in de labstandaard.Plaats een bekerglas onder de kolom, breng een klein volume van de slurry langzaam over in de glazen kolom met een pipetter met één kanaal die de pipetpunt tegen de glazen kolomwand houdt. Om het verpakkingsproces te versnellen, verwijdert u de buffer van boven het stationaire bed met een micropipette tussen elke stap. Plaats een bovenfilter en schroef de adaptereenheid zo dat er geen buffer boven de stationaire fase overblijft.Bevestig de positie van de adaptereenheid met de adaptervergrendeling. Sluit de kolom aan op een hoogwaardige vloeistofchromatografiepomp en stel het debiet in op 0,2 milliliter per minuut om de kolom 's nachts te wassen met een ammoniumacetaatbuffer. Voor langere opslag, voer de kolom uit met 0,05% natriumazide-oplossing in ammoniumacetaatbuffer, draag een laboratoriumjas, veiligheidsbril en handschoenen bij het werken met natriumazide en bewaar bij vier graden Celsius.IAM.PC. DD2-deeltjes met geïmmobiliseerde neuroblastoom TrkB-celmembraanfragmenten en in aanwezigheid van BDNF resulteerden in fluorescerende deeltjes. Er werd geen fluorescentie waargenomen in TrkB nulcelmembraan ingekapselde IAM-deeltjes of wanneer geen BDNF werd gebruikt zoals in TrkB-celmembraan ingekapselde IAM-deeltjes. Een functionele CMAC-kolom wordt een typisch frontaal affiniteitschromatogram getoond van toenemende 7, 8-DHF-concentraties van één millimolar, 750 nanomolair, 500 nanomolair en 300 nanomolair voor de geïmmobiliseerde TrkB-receptoren, die een concentratieafhankelijke verandering in retentietijd vertoonden.Een niet-functionele CMAC-kolom toonde het gebrek aan concentratieafhankelijke veranderingen in het vasthouden van het markerligand. Een CMAC-negatieve controlekolom werd voorbereid door celmembraanfragmenten te immobiliseren, waarbij het beoogde eiwit niet tot expressie werd gebracht om niet-specifieke interacties uit te sluiten. De toevoeging van 0,2% waterig Gotu kola-extract resulteerde in een significante vermindering van 7, 8-DHF-retentie, wat wijst op de aanwezigheid van concurrerende liganden voor de agonistbindingsplaats.Het ontbreken van reductie van 7, 8-DHF retentie op de CMAC negatieve TrkB nulkolom bevestigde verder het gebrek aan functionele TrkB receptoren op deze kolom. De ontbrekende piekchromatografiebenadering identificeerde een verbinding die sterk werd vastgehouden op de TrkB-kolom, terwijl de TrkB-nulkolom vroeg werd geëluuteerd, wat duidt op specifieke interactie. Het is cruciaal om uw bron van receptoren voor snelle cellulaire membraanaffiniteit chromatografie kolom te kennen.Zorg ervoor dat u de literatuur controleert om homogenisatie- en oplosbuffers goed te ontwerpen. Cellulaire membraanaffiniteit chromatografie kolom voorbereid in dit protocol werd gebruikt om nieuwe potentiële drug hits te identificeren en om de aard van de interactie tussen geïmmobiliseerde receptor en zijn natuurlijke liganden te karakteriseren.

cellular-membrane-affinity-chromatography-columns-to-identify

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Het testen van eiwit-eiwit interacties is onmisbaar voor dissectie van eiwitten functionaliteit. Hier introduceren we...

Eiwit Membraan Overlay Test: een protocol om interactie tussen oplosbare en onoplosbare eiwitten Test In vitro</em

Hier beschrijven we een robuuste werkwijze voor de fractionering van plantaardige plasmamembranen in reinigingsmiddelenbestendige en detergent oplosbare membranen gebaseerd op een mengsel van gelabelde en in vivo volledig 15N gemerkt Arabidopsis thaliana celculturen. De procedure wordt toegepast voor vergelijkende proteomics studies om signalering processen te begrijpen.

Metabole Labeling en Membrane Fractionation for Comparative Proteomic analyse van<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Schorsing Celkweken

Methoden worden beschreven voor dunne-laag chromatografie (TLC) scheiding van plantenextracten en contact bioautografie antibacteriële metabolieten te identificeren. De methoden worden toegepast op de screening van rode klaver fenolen remmen hyper-ammoniak-producerende bacteriën (HAB) thuishoren in de runder pens.

Thin-layer Chromatographic (TLC) Scheidingen en Bioassays van plantenextracten te identificeren antimicrobiële verbindingen

Eiwit-eiwit en eiwit-metaboliet interacties zijn cruciaal voor alle cellulaire functies. Hierin beschrijven we een protocol waarmee parallelle analyse van deze interacties met een eiwit van keuze. Ons protocol is geoptimaliseerd voor de plant celculturen en affiniteit zuivering combineert met massa spectrometrie gebaseerde eiwitten en metaboliet detectie.

2 in 1: stap zuivering van de affiniteit voor de parallelle analyse van eiwit-eiwit en eiwit-metaboliet complexen

Hier presenteren we een bewezen en geteste protocol voor de zuivering van chloroplast importeren eiwitcomplexen (TOC-TIC complex) met behulp van de TAP-tag. Het protocol van de verwantschap-isolatie one-step potentieel kan worden toegepast op elke proteïne en worden gebruikt om nieuwe interactie partners door massaspectrometrie.

Affiniteit zuivering van Chloroplast Translocon eiwitcomplexen met behulp van de Tag van de TAP

In deze procedure, een dsred gebaseerde epitoop ligand is geïmmobiliseerd om een zeer selectieve affiniteit hars voor de inname van monoklonale antilichamen van ruwe plantenextracten of celkweek supernatants produceren, als een alternatief voor eiwit a.

Geactiveerde kruisgebonden agarose voor de snelle ontwikkeling van Affiniteits chromatografie harsen-antilichamen vangen als een casestudy

Hier beschreven is een nabijheid etikettering methode voor de identificatie van interactie partners van de TIR domein van de NLR immuunreceptor in Nicotiana benthamiana bladweefsel. Ook is een gedetailleerd protocol voor de identificatie van interacties tussen andere eiwitten van belang met behulp van deze techniek in Nicotiana en andere plantensoorten.

TurboID-Based Proximity Labeling voor in Planta Identificatie van Protein-Protein Interaction Networks

Verschillende veelgebruikte methoden worden hier geïntroduceerd om de membraanhandelgebeurtenissen van een plasmamembraanreceptorkinase te bestuderen. Dit manuscript beschrijft gedetailleerde protocollen, waaronder de bereiding van het plantmateriaal, de farmacologische behandeling en de confocale beeldvorming.

Op afbeeldingen gebaseerde methoden om membraanhandelgebeurtenissen in somatale afstammingscellen te bestuderen

We presenteren een methode voor snelle massaspectrometrie (MS)/massaspectrometrie (MS)-gebaseerde annotatie en classificatie van tropaanalkaloïden, nuttig voor zowel voorlopige dereplicatie van tropane-bevattende monsters als de ontdekking van nieuwe alkaloïden voor isolatie.

Toepassingen van vloeistofchromatografie tandem massaspectrometrie in onderzoek naar natuurlijke producten: tropaanalkaloïden als casestudy

Hier beschrijven we protocollen bij zoogdiercellen door solid-state frezen verstoren bij een cryogene temperatuur, produceren een cel uittreksel uit de resulterende cel poeder, en te isoleren eiwitcomplexen van rente door affiniteitsinvangmiddel upon-antilichaam gekoppeld micron-schaal paramagnetische kralen.

Eiwitcomplex Affiniteit Capture uit Cryomilled zoogdiercellen

Leer cellulaire membraanaffiniteitschromatografie om gespecialiseerde plantenmetabolieten te identificeren die interageren met geïmmobiliseerde tropomyosinekinasereceptor B. Deze methode versnelt de ontdekking van biologisch actieve verbindingen.

Cellulaire membraanaffiniteitschromatografiekolommen om gespecialiseerde plantenmetabolieten te identificeren die interageren met geïmmobiliseerde tropomyosinekinasereceptor B (Video) | JoVE Journal

Cellulaire membraanaffiniteitschromatografiekolommen om gespecialiseerde plantenmetabolieten te identificeren die interageren met geïmmobiliseerde tropomyosinekinasereceptor B

Meer video's verkennen