Cellulaire membraanaffiniteitschromatografiekolommen om gespecialiseerde plantenmetabolieten te identificeren die interageren met geïmmobiliseerde tropomyosinekinasereceptor B

Deze verticale presenteert belangrijke stappen in het samenstellen van celmembraanaffiniteitschromatografiekolommen met functionele transmembraanreceptoren. Deze kolommen kunnen worden gebruikt voor de identificatie van kleine moleculen die aanwezig zijn in complexe extracten en interageren met geïmmobiliseerde transmembraanreceptoren. Cellulaire membraanaffiniteitschromatografiekolommen versnellen de identificatie van biologisch actieve verbindingen die aanwezig zijn in complexe mengsels.

Het gebruik van cellulaire membraanaffiniteitschromatografiekolommen kan van bijzonder belang zijn voor diegenen die geïnteresseerd zijn in de identificatie van farmacologisch actieve verbindingen die aanwezig zijn in complexe natuurlijke matrices, zoals planten-, schimmel- of bacteriële extracten. Bereid om te beginnen 200 millimolar benzamidine stockoplossing door 120 benzamidine op te lossen in vijf milliliter ultrapuur gedeïoniseerd water. Bereid een 10 millimolaire PMSF-stamoplossing door 0,017 gram PMSF op te lossen in 10 milliliter ethanol in een zuurkast.

Bereid 100X proteasenremmer cocktail door het oplossen van commercieel verkrijgbare proteaseremmer mengsel in een milliliter ultrapure gedeïoniseerd water. Meng grondig en aliquot 200 tot 300 microliter van de cocktail. Bereid 100 millimolaire ATP-stamoplossing door 55,114 milligram ATP-dinatriumzouthydraat op te lossen in één milliliter van het geïoniseerde ultrapuur water.

Meng grondig en aliquot 100 microliter van het mengsel. Bereid buffer voor door 3,03 gram Tris-HCL, 2,9 gram natriumchloride, 0,22 gram calciumchloride watervrij, 0,2 gram magnesiumchloridehexahydraat en 0,19 gram kaliumchloride op te lossen in 500 milliliter ultrapuur gedeïoniseerd water. Bereid homogenisatiebuffer door 17,3 milliliter van de Tris-buffer te mengen met 0,3 milliliter benzamidine-stamoplossing, 0,2 milliliter PMSF-stamoplossing, 0,2 milliliter proteasenremmercocktail, 20 microliter ATP-stamoplossing, twee milliliter glycerol en 0,029 gram EDTA.

Stel de pH in op 7,4 met behulp van zoutzuuroplossing. Draai de cellen geoogst bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten op 400 x g en verwijder het supernatant en was de resterende celkorrel met 10 milliliter 1X pH 7,4 ijskoude PBS. Gooi het supernatant weg en voeg 20 milliliter homogenisatiebuffer toe.

Plaats de conische buis op ijs. Breng de celsuspensie over in een 40 milliliter Dounce homogenisator weefselslijper, homogeniseer de suspensie handmatig op ijs met behulp van 40 op en neer stamperslagen. Breng gehomogeniseerde celsuspensie over in een conische buis van 50 milliliter, gooi de pellet weg en breng het supernatant over naar een nieuwe conische buis.

Bewaar de celmembraankorrel en gooi het supernatant weg. Bereid oplosbuffer door 8,7 milliliter van de bufferoplossing te mengen met 0,1 milliliter PMSF-stamoplossing, 0,15 milliliter benzamidine-stamoplossing, 0,1 milliliter proteasenremmercocktail, 10 microliter ATP-stamoplossing, één milliliter glycerol en 0,2 gram natriumkorf. Breng de oplosbuffer over in de conische buis met celmembraanfragmenten.

En resuspend de pellet. Draai het resulterende mengsel bij 150 RPM bij vier graden Celsius gedurende 18 uur. Centrifugeer na 18 uur het oplosbaarheidsmengsel bij vier graden Celsius gedurende 30 minuten bij 47, 900 x g.

Voeg 100 milligram IAM toe. PC. DD2-deeltjes naar het supernatant en roteer het resulterende suspensiemengsel bij 150 RPM bij vier graden Celsius gedurende één uur. Bereid dialysebuffer voor in vier liter ultrapuur gedeïoniseerd water door 24 gram Tris-HCl, 23,4 gram natriumchloride, 0,06 gram calciumchloride, 5,85 gram EDTA en 0,07 gram PMSF toe te voegen.

Los PMSF eerst op in een klein volume ethanol en voeg vervolgens langzaam toe aan het bekerglas met de buffer. Snijd 10 centimeter cellulosemembraandialysebuis om de dialysebuis voor te bereiden en breng de suspensie met IAM over. PC. DD2-deeltjes en celmembraanfragmenten in de dialysebuis.

Sluit beide uiteinden van de dialysebuis met dialysebuisclips. Plaats de dialysebuis in de dialysebuffer. Plaats na 24 uur de dialyseslang in de vers voorbereide dialysebuffer en ga nog 24 uur door met dialyse.

Bereid 10 millimolaire pH 7,4 ammoniumacetaatbuffer voor die zal worden gebruikt om de IAM te wassen. PC. DD2-deeltjes en in kolomkarakteriseringsexperimenten door 0,778 gram ammoniumacetaat op te lossen in één liter ultrapuur gedeïoniseerd water. Verwijder na 48 uur dialyse de dialysebuis uit de dialysebuffer en breng de inhoud van de dialysebuis over in een conische buis van 15 milliliter.

Gooi het supernatant weg en was de resterende pellet drie keer met 10 milliliter ammoniumacetaatbuffer. Na de derde wasbeurt, resuspend de resterende pellet in een milliliter ammoniumacetaatbuffer. Meng het grondig en gebruik de resulterende slurry om de 5 x 20 glazen kolom te verpakken om de CMAC-chromatografiekolom te verkrijgen.

Om de kolom in te pakken, plaatst u een bodemfilter dat eerder is gedrenkt met ammoniumacetaatbuffer in de filterhouder. Plaats de filterhouder in de glazen kolom en schroef de kolomdop om de positie van de houder vast te zetten. Plaats de kolom verticaal in een vingerklem en zet hem vast in de labstandaard.

Plaats een bekerglas onder de kolom, breng een klein volume van de slurry langzaam over in de glazen kolom met een pipetter met één kanaal die de pipetpunt tegen de glazen kolomwand houdt. Om het verpakkingsproces te versnellen, verwijdert u de buffer van boven het stationaire bed met een micropipette tussen elke stap. Plaats een bovenfilter en schroef de adaptereenheid zo dat er geen buffer boven de stationaire fase overblijft.

Bevestig de positie van de adaptereenheid met de adaptervergrendeling. Sluit de kolom aan op een hoogwaardige vloeistofchromatografiepomp en stel het debiet in op 0,2 milliliter per minuut om de kolom 's nachts te wassen met een ammoniumacetaatbuffer. Voor langere opslag, voer de kolom uit met 0,05% natriumazide-oplossing in ammoniumacetaatbuffer, draag een laboratoriumjas, veiligheidsbril en handschoenen bij het werken met natriumazide en bewaar bij vier graden Celsius.IAM.

PC. DD2-deeltjes met geïmmobiliseerde neuroblastoom TrkB-celmembraanfragmenten en in aanwezigheid van BDNF resulteerden in fluorescerende deeltjes. Er werd geen fluorescentie waargenomen in TrkB nulcelmembraan ingekapselde IAM-deeltjes of wanneer geen BDNF werd gebruikt zoals in TrkB-celmembraan ingekapselde IAM-deeltjes. Een functionele CMAC-kolom wordt een typisch frontaal affiniteitschromatogram getoond van toenemende 7, 8-DHF-concentraties van één millimolar, 750 nanomolair, 500 nanomolair en 300 nanomolair voor de geïmmobiliseerde TrkB-receptoren, die een concentratieafhankelijke verandering in retentietijd vertoonden.

Een niet-functionele CMAC-kolom toonde het gebrek aan concentratieafhankelijke veranderingen in het vasthouden van het markerligand. Een CMAC-negatieve controlekolom werd voorbereid door celmembraanfragmenten te immobiliseren, waarbij het beoogde eiwit niet tot expressie werd gebracht om niet-specifieke interacties uit te sluiten. De toevoeging van 0,2% waterig Gotu kola-extract resulteerde in een significante vermindering van 7, 8-DHF-retentie, wat wijst op de aanwezigheid van concurrerende liganden voor de agonistbindingsplaats.

Het ontbreken van reductie van 7, 8-DHF retentie op de CMAC negatieve TrkB nulkolom bevestigde verder het gebrek aan functionele TrkB receptoren op deze kolom. De ontbrekende piekchromatografiebenadering identificeerde een verbinding die sterk werd vastgehouden op de TrkB-kolom, terwijl de TrkB-nulkolom vroeg werd geëluuteerd, wat duidt op specifieke interactie. Het is cruciaal om uw bron van receptoren voor snelle cellulaire membraanaffiniteit chromatografie kolom te kennen.

Zorg ervoor dat u de literatuur controleert om homogenisatie- en oplosbuffers goed te ontwerpen. Cellulaire membraanaffiniteit chromatografie kolom voorbereid in dit protocol werd gebruikt om nieuwe potentiële drug hits te identificeren en om de aard van de interactie tussen geïmmobiliseerde receptor en zijn natuurlijke liganden te karakteriseren.