Isolatie van primaire patiëntspecifieke gladde spiercellen van aorta en semikwantitatieve real-time contractiemetingen in vitro

Met deze methode kunnen onderzoekers de celcontractie van meerdere patiëntencellijnen tegelijkertijd bestuderen. Het stelt ons in staat om ziekten sneller en efficiënter te bestuderen. Deze techniek stelt ons in staat om celcontractie in realtime te kwantificeren.

Binnen een uur kunnen we de contractiewaarden van tientallen cellen verkrijgen. We toonden voor het eerst aan dat spiercelcontractie afneemt bij een groep patiënten met aorta-aneurysma's. Dit kan een nieuwe biomarker zijn of een doelwit voor medische therapie.

Begin met het steriliseren van twee paar chirurgische tangen en een scalpel door ze onder te dompelen in 70% ethanol en ze vervolgens droog te vegen. Pipetteer vervolgens twee milliliter SMC-medium in een petrischaal waarin de weefseldissectie zal worden uitgevoerd. Pipetteer vervolgens 2,5 milliliter SMC medium in twee T-25 kolven.

Draai de kolven rond zodat het kleine volume medium het hele oppervlak bedekt. Inspecteer de biopsie visueel en identificeer de drie aortalagen door de aanwezigheid van atherosclerotische plaques aan de intima-kant en slijmerig bindweefsel aan de avonitiale kant om de lagen te onderscheiden. Om SMC's van de media te isoleren, verwijdert u de andere twee lagen door het weefsel met intima-plaque eerst met de zijkant naar boven te plaatsen en vervolgens de vaste plaque te verwijderen door deze met een tang van het weefsel weg te trekken terwijl u het weefsel met de tweede tang naar beneden duwt totdat de roze uniforme mediale laag zichtbaar is.

Draai nu het weefsel om en herhaal dezelfde procedure door de adventitiële laag af te trekken, waarbij u ervoor zorgt dat alle zichtbare delen in zoveel pogingen worden verwijderd als nodig is, omdat deze laag niet gemakkelijk van de media zal loskomen. Zodra de medialaag is geïsoleerd, snijdt u het weefsel in blokjes door de media met een tang naar beneden te drukken en het weefsel in één richting te snijden met behulp van het scalpel en schone unidirectionele sneden te maken om schade te minimaliseren. Plaats 10 tot 20 van deze weefselstukken in het bovenste kwart van de T-25 flak met behulp van een tang.

Na het steriliseren van twee paar chirurgische tangen en een scalpel zoals eerder beschreven, pipetteer twee milliliter fibroblastmedium in een petrischaal waarin de weefseldissectie zal worden uitgevoerd. Pipetteer vervolgens 2,5 milliliter fibroblastmedium in twee T-25-kolven en draai de kolven rond zodat het kleine volume medium het hele oppervlak bedekt. Inspecteer de biopsie visueel voor het identificeren van de opperhuid met een herkenbaar huidoppervlak, soms met zichtbaar haar, en zoek dan naar geel en slijmerig onderhuids vet aan de andere kant.

De laag tussen de epidermis en het onderhuidse vet is de dermis, de bron van levensvatbare fibroblasten. Om fibroblasten van de dermis te isoleren, verwijdert u de andere twee lagen door het weefsel aan de dermiszijde te plaatsen om alle drie de lagen zichtbaar te maken. Houd vervolgens het weefsel met een tang naar beneden en snijd de hele opperhuid in één strakke lijn weg zonder het weefsel te beschadigen.

Draai nu het weefsel om en herhaal dezelfde procedure door in de dermis parallel aan de grens met het onderhuidse vet te snijden. Zodra de dermis is geïsoleerd, snijdt u het weefsel in blokjes die het weefsel met een tang naar beneden drukken en het weefsel in één richting snijden met behulp van het scalpel. Plaats vervolgens 10 tot 20 van deze weefselstukken in het bovenste kwart van de T-25 kolf met behulp van de tang.

Tel de cellen met behulp van een geautomatiseerde celteller en zaai de SMC's in drievoud met een zaaidichtheid van 30.000 cellen per put in 200 microliter SMC-medium in de met gelatine bedekte ECIS-plaat. Plaats de plaat met de SMC's in de 96-puthouder van de ECIS in de celkweekincubator. Dubbelklik op de ECIS Applied BioPhysics-software om het programma te openen en druk op de knop Setup ( Setup ).

Controleer of alle elektroden contact hebben met de houder in het linker onderste paneel met het label Well Configuration. Als de elektroden niet goed zijn aangesloten, past u de plaat in de houder aan voordat u met de meting begint. Selecteer nu het plaattype in hetzelfde deelvenster door op Arraytype te klikken.

Bereid vervolgens twee pipetten voor op twee microliter en 150 microliter volume. Voordat u de stimulatie start, drukt u op Markeren in de software en plaatst u een opmerking. Om de cellen te stimuleren, verwijdert u het deksel en plaatst u het op een steriel oppervlak in de incubator.

Induceer vervolgens SMC-contractie door zo snel mogelijk twee microliter van de ionomycine-werkoplossing in elke put te pipetteren. Zodra alle cellen zijn gestimuleerd, mengt u het medium in de putjes met behulp van de tweede pipet. Om de reproduceerbaarheid van interexperimentele metingen te bepalen, werden twee onafhankelijke metingen van alle opgenomen controle- en patiëntcellijnen uitgezet als een Bland-Altman-plot, waaruit bleek dat deze methode geen variabiliteit vertoonde buiten het betrouwbaarheidsinterval, behalve één uitschieter cellijn.

Twee putten die met hetzelfde experiment waren bezaaid en tegelijkertijd werden gestimuleerd, vertoonden praktisch dezelfde contractuele responscurve. Om te valideren of de getoonde respons een samentrekking was en geen osmotische stress vanwege ionomycinestimulatie, werd het medium na stimulatie vervangen en werd het gedrag van de cellen geregistreerd, waaruit bleek dat de gestimuleerde cellen zich weer over de elektrode begonnen te verspreiden. De contractiele respons bij SMC's afgeleid van gezonde, niet-verwijde aorta's vertoonde een mediane respons van 61% vergeleken met de mediane respons van 52% van abdominale aorta-aneurysmapatiënten.

De gemiddelde contractiele respons van de controlegroep werd gebruikt om vier patiënten te identificeren die lagere contractiewaarden hadden dan de normale waarden. De Western blot-analyse en daaropvolgende kwantificering bevestigden dat de cellen SMC-markers tot expressie brengen. Voor het bepalen van de proliferatieve capaciteit van de SMC werd qPCR uitgevoerd voor Ki67.

Ki67-expressie was detecteerbaar in alle cellen, maar correleerde niet met de contractiele output. Wanneer u de cellen stimuleert voor contractie, vergeet dan niet om niet te veel putten tegelijkertijd te pipetteren en probeer zo snel mogelijk te pipetteren. Deze procedure kan enige oefening vereisen.

Met behulp van deze methode hebben we de patiënten verdeeld op basis van hun contractie en om de normale contractering te verlagen, waardoor we deze patiënten en de verbanden met hun klinische kenmerken zoals roken konden onderzoeken.