Kwantificering van vasculaire parameters in whole mount retinas van muizen met niet-proliferatieve en proliferatieve retinopathieën

Bij retinopathieën zijn vasculaire veranderingen het eerste teken dat door clinici wordt gedetecteerd. Ze volgen de progressie van de ziekte en ze kiezen een behandeling op basis van deze veranderingen. Verschillende diermodellen zijn ontwikkeld om verschillende stadia van de pathologie te bestuderen.

In dit werk gaan we laten zien hoe we verschillende vasculaire veranderingen kunnen meten. Daarvoor gaan we twee diermodellen inzetten. Een daarvan is het zuurstof-geïnduceerde retinopathie muismodel, dat de retinopathie van prematuriteit en sommige aspecten van de proliferatieve diabetische retinopathie reproduceert.

Hier gaan we avasculaire gebieden, neovasculaire gebieden en de dilatatie en tortuositeit van de arteriolen meten. In ons laboratorium werd een muismodel met het metabool syndroom ontwikkeld, dat een niet-proliferatieve retinopathie induceert. Vasculaire dichtheid en vertakking werden in dit werk geëvalueerd.

Bij muizenoffer, enucleatize met een schaar. Fixeer geëucleeerde ogen met vers bereid paraformaldehyde gedurende één uur bij kamertemperatuur. Verwijder onder de ontleedmicroscoop de hoornvliezen met een schaar door langs de limbus te snijden en ontleed het hele netvlies.

Gooi het voorste segment van het oog weg en scheid vervolgens het netvlies van het RPE-vaatvlies. Plaats het netvlies in 200 microliter buisjes. Blokkeer en permeabiliseer vervolgens de netvliezen in 100 microliter TBS met 5% runderserumalbumine Triton gedurende zes uur bij vier graden met zachte agitatie in shaker.

Keer vervolgens de buis om om het netvlies in de beker te plaatsen en verwijder de blokkerende oplossing met pipet. Voeg 100 microliter oplossing toe die isolectine bevat. Wikkel de buizen met aluminiumfolie om monsters tegen licht te beschermen.

Incubeer het netvlies met lectine-oplossing 's nachts bij vier graden met zachte agitatie in shaker. Was de netvliezen met 100 microliter TBS-Triton gedurende 20 minuten met zachte agitatie in shaker. Herhaal deze stap drie keer.

Plaats het netvlies in een dia en voeg een druppel PBS toe. Voer onder de ontleedmicroscoop vier even verre sneden uit van de randen van het netvlies naar de oogzenuw. Om de bloemblaadjes van het netvlies uit te vouwen, gebruikt u een tang of kleine stukjes filterpapier.

Zorg ervoor dat de fotoreceptorzijde naar beneden is gericht. Verwijder de resterende PBS van de dia met filterpapier. Voeg vervolgens een bevestigingsmediaan en coverslip toe.

Laat het een uur drogen bij kamertemperatuur. Bewaar dia's op vier graden beschermd tegen licht. Plaats bij de confocale microscoop de dia in de plaat met de voorkant naar beneden.

Focus de superieure plexus van de retinale vasculatuur en selecteer een gebied om de beeldverwerving te starten. Stel algemene laserparameters in de software in. Stel de coördinaten in op X-, Y- en Z-assen.

Initialiseer het scannen. Zodra het scanproces is voltooid, opent u de afbeelding en slaat u deze op met een voorkeursextensie. Ga in de ImageJ FIJI-software naar de menubalk en klik op Bestand, openen.

Selecteer de afbeelding die u wilt verwerken. Selecteer in het venster Optie voor importeren van bio-indelingen de optie OME-XML-metagegevens weergeven en klik OK.In het venster OME-metagegevens naar informatie over de pixelgrootte. Kopieer deze gegevens.

Ga voor beeldkalibratie naar de menubalk en selecteer Afbeeldingseigenschappen. Kopieer de informatie en klik op OK. Wijs een voorkeursluit toe aan de afbeelding. Als u alle stapels in één afbeelding wilt visualiseren, gaat u naar de menubalk en selecteert u Afbeelding, Stapels, Z-project.

Selecteer in het weergegeven projectievenster alle stapels waar schepen worden gevisualiseerd. Kies in Projectietype de optie Gemiddelde intensiteit en klik op OK. Ga naar de menubalk, afbeelding, aanpassen, helderheid / contrast. Klik op Wijzigingen toepassen en opslaan.

Kopieer de parameters die zijn geselecteerd voor helderheid en contrast. Deze moeten voor alle afbeeldingen identiek zijn. Kies in de menubalk het gereedschap Toverstaf.

Selecteer het retinale gebied dat geen gevormde vaten heeft. Druk op T op het toetsenbord om de geselecteerde gebieden in de ROI Manager vast te leggen. Klik op Meten in de ROI Manager om de avasculaire gebiedsinformatie te verkrijgen.

Herhaal deze stappen om het totale gebied van het netvlies te meten. Kies in de menubalk het gereedschap Toverstaf. Zoom in op de afbeelding om neovessels beter te visualiseren.

Selecteer de neovessels één voor één met het gereedschap Toverstok. Druk op de T-letter op het toetsenbord om het geselecteerde gebied in de ROI Manager vast te leggen. Klik op Meten in de ROI Manager om de gebiedsgegevens op te halen.

Selecteer in de menubalk het gereedschap Rechte lijn. Zoom in op de afbeelding om de vaatwand beter te visualiseren. Voer drie transversale lijnen uit naar het hoofdvat vóór de eerste tak.

Druk op T op het toetsenbord om de geselecteerde gebieden in de ROI Manager vast te leggen. Klik op Meten in de ROI Manager om de afstandsgegevens op te halen. Klik in de menubalk met de rechtermuisknop op het pictogram van het gereedschap Rechte lijn en selecteer Gesegmenteerde lijn.

Trek een lijn in het vat van de oogzenuw tot de eerste vaatvertakking, volgens de vasculaire vorm. Druk op de T-letter op het toetsenbord om het geselecteerde gebied in de ROI Manager vast te leggen. Selecteer in de menubalk het gereedschap Rechte lijn.

Trek een lijn van de oogzenuw tot de eerste vaatvertakking. Druk op de T-letter op het toetsenbord om het geselecteerde gebied in de ROI Manager vast te leggen. Klik op Meten in de ROI Manager om de afstandsgegevens te verkrijgen.

Definieer met het gereedschap Ovaal van de menubalk een gebied dat op gelijke wijze wordt toegepast op alle experimentele omstandigheden. Het geselecteerde gebied moet een concentrische cirkel zijn die rond de oogzenuw is getekend. Druk op de T-letter op het toetsenbord om het geselecteerde gebied in de ROI Manager vast te leggen.

Tel handmatig het aantal primaire vertakkingen dat voortvloeit uit hoofdvaten binnen het selectiegebied. Transformeer de afbeelding naar de 8-bits modus. Ga naar Plug-ins in de menubalk, selecteer Vessel Analysis, Vascular Density.

Definieer een gebied met het gereedschap Vierkant van de menubalk waar u de vatdichtheid wilt meten. Klik op OK. Het programma geeft een nieuw venster weer met de vereiste informatie. In het eerste experimentele voorbeeld werd het oxygen-induced retinopathy mouse model gebruikt.

Intravitreale injecties werden uitgevoerd op postnatale dag 12 om de effectiviteit van een geneesmiddel als antiangiogeen te bepalen. Muizen geïnjecteerd met voertuig werden gebruikt als controle. De avasculaire gebieden worden gedefinieerd als de zones zonder retinale bloedvaten.

Uit de verkregen beelden kunnen avasculaire gebieden worden gekwantificeerd als de som van de regio's zonder vaten het totale gebied van het netvlies deelt. Gebieden met mechanische schade vertonen ook afwezigheid van schepen. Om beschadigde gebieden te identificeren, analyseert u de integriteit van neuronale lagen met Hoechst-vlek.

Neovessels zijn kleine kaliber vaten die afkomstig zijn van reeds bestaande vaten van de superieure vasculaire plexus. We berekenden het gebied dat wordt ingenomen door de plukjes van neovessels door het neovasculaire gebied van het netvlies te kwantificeren dat wordt ingenomen door het totale gebied van het netvlies. Omdat de vorm en grootte van neovessels variabel is, kunnen ze af en toe lijken op puin en artefacten.

Om neovessels te onderscheiden, controleert u of het plukje uit een volwassen vat groeit. Voor de analyse van de dilatatie hebben we de diameter van het hoofdvat gemeten op drie hoogten vóór de eerste tak. Onderzoekers moeten een vooraf bepaalde afstand definiëren om de diameter van het vat te meten om de variabiliteit tussen de resultaten te verminderen.

Idealiter zou het verste punt van de oogzenuw ongeveer 300 micrometer moeten zijn. We raden aan om de analyse uit te voeren, en later, gemiddeld van ten minste zes dieren per aandoening. Met betrekking tot tortuositeit meten we de afstand die het hoofdvat aflegt volgens zijn vorm, ten opzichte van de rechte lijnafstand tussen de oogzenuw en het eerste vertakkingspunt.

Zoals we in de afbeelding kunnen zien, is er heterogeniteit in de sinuositeit van de belangrijkste vaten. Om een representatief resultaat te verkrijgen, moeten niet minder dan zes muizen per aandoening worden gekwantificeerd. De nieuwste parameters, vasculaire vertakking en dichtheid, werden geanalyseerd in een metabool syndroommodel dat niet-proliferatieve retinopathie vertoont.

Voor het meten van vasculaire vertakking definieerden we het kwantificeringsgebied door een concentrische cirkel te tekenen en vervolgens telden we één voor één de primaire takken die voortkwamen uit een centraal hoofdvat. Uit de verkregen beelden werd de vasculaire dichtheid gekwantificeerd als het gebied dat werd ingenomen door vaten gedeeld door het gebied van de ROI, dat op verschillende plaatsen in elke microfotofoto werd geplaatst. Vermijd het kwantificeren van gebieden met mechanische schade.

Als er meer dan twee gebieden met puncties zijn, moet het netvlies worden weggegooid. Samenvattend hebben we in dit artikel klassieke, gevestigde en reproduceerbare technieken getoond om enkele van de meest relevante parameters te kwantificeren, rekening houdend met de klinische praktijk.