Voorbereiding van door kralen ondersteunde lipide bilayers om de deeltjesoutput van T-cel immuunsynapsen te bestuderen

De studie van de output van de immuunsynaps is meestal beperkt gebleven tot microscopische methoden. BSLBs hebben ons repertoire van hulpmiddelen uitgebreid die kunnen worden gebruikt om de output van T-cel immuun synapsen te bestuderen, waaronder flowcytometrie, microscopie, proteomics en RNA-sequencingtechnologieën. Als zodanig kunnen BSLBs worden gebruikt in een breed scala aan immunologische vragen en bij het identificeren van de samenstelling en biochemische regulatie van de T-celoutput.

Dit omvat bijvoorbeeld de studie van chimere antigeenreceptoren, geneesmiddelen die specifieke signaalroutes remmen of de genetische ablatie van genen van belang. Een van de meest kritieke aspecten van dit protocol is het optimaliseren van de eiwitkalibraties en het meerkleurige flowcytometriepaneel dat nodig is voor het volgen van het transsyptische deeltje van belang. Dit vereist de systematische iteratie van eiwitconcentraties, antilichaamconcentraties en instrumentinstellingen.

Begin met het verdunnen van één microliter kraaloplossing met 1.000 microliter PBS. Tel de kralen met behulp van een hemocytometerkamer en bereken hun concentratie per milliliter. Bereken vervolgens het volume silicaparels dat nodig is voor 500.000 uiteindelijke BSLBs per titratiepunt.

Breng het vereiste volume silicaparels over in een steriele microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Was de silicakorrels drie keer met één milliliter steriel PBS en centrifugeer de kralen. Bereid drie volumes liposoommastermix met een laatste 12,5 mol procent nikkelbevattende fosfolipiden.

Gebruik de liposoommastermix om de gewassen silicaparels opnieuw te suspenderen. Meng het vervolgens voorzichtig door de helft van het totale volume op en neer te pipetteren. Voeg met behulp van een steriele techniek argon- of stikstofgas toe aan de buis om lucht te verplaatsen en de lipiden te beschermen tegen oxidatie tijdens het mengen.

Voeg argon toe aan de 0,4-millimolaire lipidevoorraden. Bewaar de voorraad en manipuleer met behulp van een steriele techniek. Verplaats de BSLBs naar de verticale mixer en meng gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met behulp van orbitaal mengen bij 10 RPM.

Draai vervolgens de kralen naar beneden door 15 seconden bij kamertemperatuur te centrifugeren op een minicentrifuge op de bank. Blokkeer de gevormde BSLBs door één milliliter 5% BSA met 100 micromolair nikkelsulfaat toe te voegen om NTA-locaties op de BSLBs te verzadigen. Was drie keer met HBS-HSA-buffer om de overtollige blokkerende oplossing te verwijderen.

Neem een nieuwe U-bottom of V-bottom 96-well plaat en bereid tweevoudige seriële verdunningen van de eiwitten voor. Resuspend de bereide BSLBs in een zodanig volume dat 100 microliter HBS-HSA-buffer 500.000 BSLBs bevat. Neem vervolgens nog een U-bodem of V-bodem 96-putplaat en breng 100 microliter van de BSLB-suspensie over naar de putten op zo'n manier dat elke put 500.000 BSBL's ontvangt.

Draai de tweede plaat bij kamertemperatuur gedurende twee minuten af op 300x G.Gooi het supernatant weg en breng 100 microliter volumes over van de eiwittitratieplaat naar de plaat met de gesedimenteerde BSLBs. Meng voorzichtig, vermijd overmatige bubbelgeneratie tijdens het pipetteren. Gebruik aluminiumfolie om het te beschermen tegen licht en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten bij 1.000 RPM.

Was de plaat vervolgens drie keer door HBS-HSA-buffer aan de plaat toe te voegen en draai deze twee minuten op kamertemperatuur bij 300x G.Tel de cellen na het wassen. Verdun ze vervolgens tot een eindconcentratie van 2,5 miljoen per milliliter met behulp van synaptisch transfertestmedium. Zodra de BSLBs zijn geladen met het eiwitmengsel, wast u de BSLBs tweemaal met HBS-HSA-buffer om de overtollige ongebonden eiwitten te verwijderen.

Resuspend 500, 000 BSLBs per put in 200 microliter HBS-HSA buffer. Breng 100 microliter BSLBs per put over naar een nieuwe U-bottom 96-well plaat om een duplicaat te maken, zodat de uiteindelijke hoeveelheid BSLB per put 250.000 is. Draai de BSLBs gedurende twee minuten bij kamertemperatuur op 300x G.

Gooi het supernatant weg en resuspend de BSLBs met behulp van 100 microliter T-celsuspensie. Meng voorzichtig om de vorming van bubbels te voorkomen. Incubeer de co-culturen gedurende 90 minuten bij 37 graden Celsius.

Bescherm de cellen tegen licht en koel de coculturen af door ze eerst minimaal 15 minuten bij kamertemperatuur te incuberen. Centrifugeer de coculturen bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten bij 500x G.Gooi het supernatant weg en resuspend de co-culturen in calcium- en magnesiumionenvrij 2% BSA PBS bij kamertemperatuur voor blokkering. Plaats de cellen gedurende 45 minuten op ijs en bescherm ze tegen licht.

Bereid de antilichaammastermix met ijskoude 0,22-micrometer-gefilterde 2% BSA en PBS als kleurbuffer. Deze mastermix zorgt voor extra blokkering. Draai de co-culturen op 500x G gedurende vijf minuten en vier graden Celsius.

Gooi de supernatanten weg en gebruik vervolgens een meerkanaalspion om de cellen in de kleuringsmastermix met geoptimaliseerde antilichaamconcentraties opnieuw op te suspenderen. Inclusief isotype-gelabelde cellen en BSLBs, fluorescerende en niet-fluorescerende BSLBs, en cellen en BSLBs alleen gekleurd. Meng zachtjes door de helft van het volume op en neer te pipetteren.

Incubeer gedurende 30 minuten op ijs en bescherm ze tegen licht. Was de cellen en BSLBs tweemaal met ijskoude 2% BSA PBS. Draai ze vijf minuten op 500x G bij vier graden Celsius.

Controleer na het centrifugeren de co-culture sedimented op de bodem van de putten. Resuspend de gewassen co-culturen vervolgens in 100 microliter PBS en verkrijg onmiddellijk. Activeer de logschaal voor zijwaarts verstrooid licht en de parameter time-of-flight voor zij- en voorwaarts verstrooide lichten.

Verkrijg MESF-standaarden, zodat zowel de zwak ingestelde als de helderste populaties in het lineaire bereik van het instrument vallen. Verkrijg vervolgens compensatiemonsters, bereken compensatie en pas de compensatiematrix toe op het experiment. Verwerf en bewaar minimaal 20.000 totale MESF-standaarden voor elk kwantificeringskanaal.

Vermijd het gebruik van FACS-schedevloeistof of vergelijkbaar met geresuspend MESF-kralen, omdat deze zouten en alcoholen bevatten die de fluorchromen vernietigen, wat leidt tot bredere fluorescentiepieken en hoge fouten. Voor acquisitie met behulp van high-throughput samplers stelt u de instrumentacquisitie in op Standard, stelt u de monsteracquisitie in op 80 microliter. Sample Flow Rate tussen twee en drie microliter per seconde, sample Mixing Volume bij 50 microliter, sample Mixing van 150 microliter per seconde, en mengen per put tussen drie en vijf.

Verkrijg minimaal 10.000 afzonderlijke BSLBs per monster. Exporteer ten slotte de FCS-bestanden. Een voorbeeld van kwantitatieve flowcytometriemetingen van ICAM-1 op het oppervlak van tonsillaire B-cellen en helper-T-cellen wordt hier getoond.

De representatieve afbeeldingen beschrijven de gating-strategie voor het analyseren van enkele CXCR5 B-cellen en folliculaire-helper T-cellen geïsoleerd uit menselijke palatinale amandelen. Deze sequentiële gating-strategie identificeert afzonderlijke live-gebeurtenissen binnen het continue acquisitievenster. De doubletten, de celoppervlakexpressie van ICAM-1 in vergelijking met FMO-controles en FMO-controles gelabeld met relevante isotypen van de populaties, worden hier weergegeven.

Gating en meting van MFI's van verschillende standaard MESF-populaties in de overlayd histogrammen van de MESF-populaties worden hier getoond. De waarden vertegenwoordigen de MFI's voor elk van de vijf MESF-populaties. Lineaire regressie van MESF ten opzichte van cMFI voor de MESF-populaties worden hier gepresenteerd.

De helling extraheert MESF gebonden aan cellen uit de FCM-gegevens van ICAM-1 op het oppervlak van tonsillaire B-cellen in TFH. De omzetting naar absolute moleculaire dichtheden volgt deze eenvoudige wiskundige bewerkingen. De representatieve beelden tonen de flowcytometrie-analyse van BSLBs gereconstitueerd met verhoogde dichtheden van recombinant monomere ICAM-1 12 histidines.

Regressieanalyses van ICAM-1 referentieconcentratie over gemeten dichtheid worden hier getoond. De helling wordt gebruikt om doelconcentraties van eiwitten te berekenen om de dichtheid van cellen te bereiken. De stroomdiagrammen tonen de kritieke stappen voor het co-kweken van T-cellen met BSLBs, het reconstitueren van modelmembranen in de daaropvolgende meting van deeltjesoverdracht met flowcytometrie.

De gating-strategie om afzonderlijke BSLBs en cellen binnen het continue acquisitievenster te identificeren, wordt hier weergegeven. Een van de belangrijkste aspecten van dit protocol is dat, om de reproduceerbaarheid van de resultaten te behouden, elke keer dat u eiwit- of lipidenvoorraden verandert, u een nieuwe kalibratieanalyse moet uitvoeren. Om nieuwe effectieve moleculen te ontdekken die door verschillende T-celsubsets worden uitgescheiden, kunnen BSLBs verder worden geïsoleerd door fluorescentie-geactiveerde celsortering als onderworpen aan transcriptomische en proteomische analyse.

Onze collega's binnen de Universiteit van Oxford hebben deze technologie gebruikt om nieuwe receptor-ligandinteracties te bestuderen en te demonstreren, en ook om de effecten van genetische ablaties op de output van de T-cel immuun synaps te bestuderen.