Een eenvoudige microfluïdische chip voor groei op lange termijn en beeldvorming van Caenorhabditis elegans

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het dier vrij in het apparaat kan groeien en kan worden gevangen voor beeldvorming met hoge resolutie. Het apparaat kan meerdere keren worden hergebruikt. Tijdens het maken van het apparaat is netheid de belangrijkste factor om stofvrije apparaten te kunnen fabriceren om lekkage tijdens de werking van het apparaat te voorkomen.

Om te beginnen met het ontwerpen van patroon één voor de stroomlaag en patroon twee voor de besturingslaag met behulp van rechthoekige vormen in een tekstverwerkingssoftware en de fotomaskers afdrukken met behulp van een laserplotter met een minimale functiegrootte van acht micrometer op polyester gebaseerde film. Snijd siliciumwafers in vierkante stukken van 2,5 centimeter in hoogte en breedte. Reinig ze met 20% kaliumhydroxide gedurende één minuut en spoel de wafers af in gedeïoniseerd water.

Gebruik één wafer voor de flow en de andere voor de control layer. Droog de stukken met 14 P-S-I gecomprimeerd stikstofgas gevolgd door uitdroging op een hete plaat bij 120 graden Celsius gedurende vier uur. Neem na het afkoelen een stuk silicium, plaats het op de klauwplaat van een spincoder en zet het vacuüm aan om de wafer op zijn plaats te houden.

Plaats ongeveer 20 microliter hexamethyldisilaan op het siliciumstuk en bekleed het met behulp van de spincoder op 500 R-P-M gedurende vijf seconden, gevolgd door 3000 R-P-M gedurende 30 seconden. Om een uniforme fotoresistendikte van ongeveer 40 micrometer te krijgen die specifiek is voor de stromingslaag, bedekt u de siliciumwafer met ongeveer 1,5 milliliter negatieve fotoresist met behulp van een spincoder op 500 R-P-M gedurende vijf seconden, gevolgd door 2000 R-P-M gedurende 30 seconden. Herhaal de coating van het siliciumstuk met hexamethyldisilaan en negatieve fotoresist voor de tweede wafer om een uniforme fotoresistendikte van ongeveer 40 micrometer te verkrijgen die specifiek is voor de regellaag.

Als alternatief, om de dikte van de stroomlaag te verhogen tot ongeveer 80 micrometer voor oudere dieren, coaten siliciumwafers met ongeveer 1,5 milliliter negatieve fotoresist twee, met behulp van de spincoder op 500 R-P-M gedurende vijf seconden gevolgd door 2000 R-P-M gedurende 30 seconden. Bak beide voorheen fotoresist gecoate siliconenstukken op een hete plaat bij 65 graden Celsius gedurende één minuut gevolgd door 95 graden Celsius gedurende 10 minuten. Na afkoeling plaatst u zacht gebakken siliconenstukken op de belichtingsfase van de U-V-verlichting met het fotoresist gecoate oppervlak tegenover de U-V-lamp.

Stel de twee stukken afzonderlijk bloot aan U-V gedurende 15 seconden met behulp van een lamp van 200 watt door een fotomasker met patronen één en twee om respectievelijk stroom- en controlelagen te krijgen. Bak de twee blootgestelde siliconenstukken zoals eerder beschreven met gecoate lagen naar boven gericht. Na het afkoelen van stukken, ontwikkel de patronen door de siliconen stukken gedurende 20 minuten in de fotoresist developer-oplossing te weken.

Zodra het patroon zichtbaar is, spoelt u de stukken af met pure isopropylalcohol en blaast u voorzichtig droog met stikstofgas. Bewaar de siliconen stukjes in een exsiccator met het gecoate oppervlak naar boven gericht. Stel de stukken bloot aan silaandampen door 50 microliter pure T-C-P-F-O-S op een glazen glijbaan te gieten.

Plaats de glijbaan in een exsiccator en incubeer gedurende twee uur. Maak P-D-M-S in een plastic beker door de elastomeerbasis te mengen met het uithardingsmiddel en roer constant gedurende drie minuten. Ontgas de P-D-M-S mix in een exsiccator gedurende 30 minuten om alle luchtbellen te verwijderen.

Plaats de controlelaag siliciumwafers in een petrischaaltje en giet een vijf millimeter dikke P-D-M-S menglaag op de siliciumstukjes. Na het P-D-M-S gietproces, herhaal het ontgassen van de P-D-M-S mix. Plaats de siliciumwafer met stromingslaag naar de spinnertruck gericht en breng 200 tot 500 millitorr vacuümdruk aan.

Giet ongeveer een milliliter P-D-M-S op de siliciumwafer. Codeer het met behulp van een spin coater om een ongeveer 80 micrometer dikke laag te krijgen. Bak de twee siliciumwafers met de met spin beklede P-D-M-S en giet de P-D-M-S-lagen op 50 graden Celsius zes uur lang in een heteluchtconvectieoven.

Na het afkoelen snijden de stukken de vijf millimeter dikke P-D-M-S laag uit het silicium stuk rond de controlelaag met behulp van een scherp mes en schil het van het silicium substraat. Pons twee gaten met een diameter van ongeveer een millimeter met behulp van een Harris-puncher in het reservoir van het P-D-M-S-blok om het immobilisatiekanaal en de isolatiekanaalinlaten aan te sluiten op de gasleidingen voor P-D-M-S-membraanafbuigingen. Plaats het siliconen stuk met de met spin gecoate P-D-M-S laag op patroon één met het P-D-M-S gecoate oppervlak naar boven gericht op een plastic bakje.

Houd het geponste P-D-M-S blok met patroon twee op de lade met gegoten kant naar boven gericht. Bewaar de plastic bak in een plasmareiniger en stel de twee P-D-M-S-oppervlakken gedurende twee minuten bloot aan 18 watt luchtplasma door laagvacuüm toe te passen. Verwijder de twee met plasma behandelde blokken en bind de blokken voorzichtig door de met plasma behandelde oppervlakken van patronen één en twee tegen elkaar te drukken.

Bak de gebonden patronen op 50 graden Celsius gedurende twee uur in een heteluchtconvectoren. Nadat u het gebonden apparaat uit de oven hebt gehaald, snijdt u het uit een siliciumwafer met patroon één en patroon twee en ponst u gaten in de inlaat- en uitlaatreservoirs van de stroomlaag met behulp van de Harris-puncher. Plaats het verlijmde P-D-M-S-blok met de stroomlaag naar boven gericht op een plastic bak en bewaar een schoon afdekglas op dezelfde lade.

Stel de blokken in het afdekglas gedurende twee minuten bloot aan 18 watt luchtplasma. Pas de vacuümdruk aan om een violette kamer te zien. Plaats het plasma blootgestelde P-D-M-S blok op het afdekglas en bak de gebonden structuur in een oven op 50 graden Celsius gedurende twee uur.

Bewaar het apparaat in een schone kamer voor toekomstig experiment. Neem het apparaat, leg het op een stereomicroscoop en bevestig de slangen. Sluit een microflexbuis aan op een gecomprimeerde stikstofgasleiding en een driewegconnector aan het andere uiteinde.

Verbind buizen een en twee van de drieweg connectoren op de val in isolerende membranen respectievelijk. Sluit twee microflexbuizen aan op de twee uitlaatpoorten van de driewegstopkraan. Verbind het andere uiteinde van de twee buizen met een acht millimeter lange naald van 18 gauge.

Vul de stroomlaag met M-9 buffer met behulp van een micropipet door de inlaatpoort. Vul beide buizen met gedeïoniseerd water door het uiteinde dat op de naald is aangesloten. Steek de twee naalden in de geponste gaten die het isolerende en vangmembraan verbinden.

Open de stikstofgasregelaar op 14 P-S-I en draai de driewegklep van buis één om het water in het apparaat te duwen via de microfluïdische kanalen in de regellagen, namelijk de val- en isolatiemembranen. Laat de druk los met behulp van de driewegstopkraan, zodra de kanalen zijn gevuld met water en geprimed. Verwijder de bellen door extra media door het stroomkanaal te laten stromen.

De figuur toont beelden van P-S-3-2-3-9, dier dat in de microfluïdische chip groeit en elke acht tot 10 uur wordt geïmmobiliseerd om fluorescentiebeelden vast te leggen. Variatie in expressiepatroon is een voorbeeld van temporele genregulatie waarbij hetzelfde gen tot expressie komt in verschillende cellen in verschillende stadia van ontwikkeling. Beeldvorming van het individuele W-D-I-S-5-1 genotype van caenorhabditis elegans toont menora-achtige vertakte dendritische architectuur in elk P-V-D neuron bestaande uit primaire, secundaire tertiaire en quaternaire processen in respectievelijk L-2, Late L-2, L-3 en L-4 ontwikkelingsstadia.

De figuur hierin vergelijkt P-V-D-ontwikkeling en apparaatgekweekte dieren, en die gekweekt op N-G-M-platen. De aantallen S-P en Q-P in verschillende stadia van de wormontwikkeling namen toe met de leeftijd. Caenorhabditis elegans werd behandeld met een druppel van drie millimolaire levamisol om voldoende verlamming te veroorzaken die nodig is voor beeldvorming met hoge resolutie.

De S-P-waarden verschilden niet significant wanneer ze werden gemeten van vergelijkbare geënsceneerde dieren die op N-G-M-platen werden gekweekt en in beeld werden gebracht met behulp van drie millimolar levamisol op een Agar-dia. Verder neemt de afstand tussen de twee P-V-C-cellichamen, één aanwezig in de staart en de tweede aanwezig in de buurt van de vulva, toe naarmate ze uit elkaar bewegen bij zowel dieren die in het apparaat worden gekweekt als die op N-G-M-platen. De figuur vertegenwoordigt het hoge resolutie beeld van aanraakreceptorneuronen van dieren die in het microfluïdische apparaat groeien.

De montage vertegenwoordigt het hele P-L-M-R neuronale proces op opeenvolgende tijdstippen die mitochondriën en het neuronale proces benadrukken. De grafiek geeft de totale neuronale proceslengte weer die werd waargenomen om toe te nemen met een helling van 10,4 micrometer per uur. Het microfabricagefabriceerde apparaat maakt gebruik van een dun P-D-M-S-membraan dat wordt afgebogen in aanwezigheid van hogedrukstikstofgas om C-elegans te immobiliseren en op hun plaats te houden voor beeldvorming met hoge resolutie.

Deze procedure kan longitudinale studies van cellulaire en subcellulaire processen in C-elegans mogelijk maken die intermitterende waarnemingen over een lange periode nodig hebben.