DetectSyn: een snelle, onbevooroordeelde fluorescerende methode om veranderingen in synapsdichtheid te detecteren

DetectSyn maakt gebruik van de proximity ligation assay-technologie om snel veranderingen in synapsen te identificeren. We bieden ook een protocol om de resultaten te analyseren. Het belangrijkste voordeel van DetectSyn is hoe snel de resultaten kunnen worden verkregen in de grote weefselgebieden die kunnen worden geanalyseerd.

Verwijder om te beginnen voorzichtig de blokkerende oplossing met een plastic Pasteur-pipet zonder de cellen te verstoren. Bekleed vervolgens een grote plastic petrischaal met Parafilm. En breng met een tang de afdekslipjes voorzichtig over naar de Parafilm.

Voeg 60 microliter van de primaire antilichaamoplossing toe aan de bovenkant van de afdekslip, zodat de antilichaamoplossing niet over de zijkanten van de afdekslip morst. Om vocht te bieden en te voorkomen dat monsters uitdrogen tijdens de incubatie, voegt u ultrapuur water toe aan een kleinere petrischaal en plaatst u de schaal voorzichtig rond de hoesjes. Bedek vervolgens de grotere petrischaal en incubeer de gekweekte cellen gedurende een uur bij kamertemperatuur.

Gebruik na incubatie met het primaire antilichaam een tang om de primaire antilichaamoplossing voorzichtig van de afdekplaatjes op een papieren handdoek af te tikken en de afdekslipjes over te brengen naar hun oorspronkelijke 24-putplaat gevuld met 500 microliter PBS. Was de monsters vervolgens driemaal met PBS gedurende 10 minuten, elk met zachte agitatie op een orbitale shaker. Breng na de laatste wasbeurt de afdekplaat terug naar de grote petrischaal en voeg 40 microliter van de secundaire antilichaamoplossing toe aan de bovenkant van de afdekslip.

Dek de petrischaal af en incubeer de monsters bij 37 graden Celsius gedurende een uur. Voor ligatie, terwijl u de ligase op een koud blok houdt, verdunt u de ligase 1 tot 40 met behulp van de ligatievoorraad en voegt u onmiddellijk 40 microliter van het ligasemengsel toe aan de afdekslips. Dek de petrischaal af en incubeer de monsters bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten.

Verdun voor versterking het polymerase 1280 op een koud blok met behulp van de versterkingsvoorraad. Voeg vervolgens 40 microliter van het versterkingsmengsel toe aan de afdekslips en incubeer de monsters gedurende 100 minuten bij 37 graden Celsius. Laat vervolgens voor de montage drie microliter montagemedia op een dia vallen.

Tik overtollige wasbuffer van de afdekslip af en plaats de afdekslip met cellen naar beneden gericht in de montagemedia. Sluit de zijkanten af met een kleine hoeveelheid doorzichtige nagellak om de hoesslip op zijn plaats te houden. Voor het monteren van gesneden weefsel, breng voorzichtig een weefselschijf over op de voorbereide dia en leg deze plat.

Laat vervolgens 5 tot 10 microliter montagemedia op de plak van het weefsel vallen. Plaats een glasslepper over de plak tissues en sluit de afdekslip af met heldere nagellak, zoals eerder aangetoond. Voor digitale beeldvorming met een confocale microscoop past u de versterking, offset en laservermogen voor elk fluorescerend kanaal aan om achtergrondruis te verminderen en het fluorescerende signaal te verbeteren.

Zorg ervoor dat het fluorescerende signaal niet oververzadigd is. Voor de kweekneuronen, klik onder het tabblad ND-acquisitie op Opslaan in bestand. Kies vervolgens onder Bladeren een bestand om de afbeelding op te slaan en voer de bestandsnaam in.

Selecteer vervolgens op het tabblad Z de optie Symmetrische modus gedefinieerd door bereik. Stel de focus in op de beste kaart met twee vlakken en klik op de knop Relatief om dit brandpuntsvlak in te stellen als het midden van de z-stack. Stel vervolgens het bereik in op vijf micrometer met stappen van één micrometer en controleer Actieve sluiter sluiten tijdens Z-beweging.

Selecteer op het tabblad Golflengte de naam van de optische knop met de eerder geconfigureerde acquisitie-instellingen onder Optische configuratie en klik op Nu uitvoeren. Voor gesneden weefsel kiest u in het acquire-menu Grote afbeelding scannen en selecteert u vervolgens onder het opnamepaneel de optische knop met de eerder geconfigureerde acquisitie-instellingen. Selecteer ook de juiste doelstelling in dit deelvenster.

Gebruik vervolgens onder het gebiedspaneel en het oogstuk de pijltoetsen om de grenzen van het interessegebied of de ROI in te stellen. Klik vervolgens op Grote afbeelding opslaan in bestand en maak een bestandsnaam voor het opslaan van het pad voor de afbeelding. Zorg er ten slotte onder het installatiepaneel voor dat Multichannel Capture is gecontroleerd.

Kies vervolgens de naam van de optische knop met de eerder geconfigureerde acquisitie-instellingen onder optische configuratie. Open in ImageJ de drempeloptie door naar het afbeeldingsmenu te gaan, op Aanpassen en vervolgens op Drempel te klikken. Kies de optie Donkere achtergrond als de afbeelding een donkere achtergrond heeft.

Pas vervolgens de boven- en ondergrenzen van de drempel aan per vooraf bepaalde geoptimaliseerde drempelinstellingen en klik op Toepassen. Gebruik voor gekweekte cellen het MAP2-kanaal en een ROI-tool uit de vrije hand om een ROI te tekenen voor elk neuron, inclusief dendrieten en soma. Voor gesneden weefsel tekent u een ROI uit de vrije hand in de segmentafbeelding die het interessegebied inkapselt.

Verkrijg vervolgens het gebied van de ROI door het menu Analyseren te openen en op Meten te klikken. Om het aantal punta binnen elke ROI te detecteren, gebruikt u een automatische detectietool zoals deeltjesanalyse. Selecteer in het menu Geanalyseerd de optie Geanalyseerde deeltjes en definieer de puncta-diameter.

Kies vervolgens in het vervolgkeuzemenu show de optie Overlaymaskers, vink vervolgens de optie Resultaten weergeven aan en klik op OK. Om het aantal punta te delen door het gebied van de individuele ROI, kopieert en plakt u de resultaten voor elke afbeelding uit de resultaten die in een spreadsheet verschijnen. Identificeer uit welk bestand en monster de gegevens waaruit we zijn verkregen en deel het gebied van de ROI door het aantal punta.

Ten slotte, om de resultaten voor controlemonsters te normaliseren, de resultaten voor de controlemonsters gemiddeld en de verkregen resultaten van alle monsters te delen door het gemiddelde van de controle. De GABAB-agonist, baclofen, is vereist voor de in vitro werkzaamheid van het snelle antidepressivum Ro-256981. Een toename van synapsvorming wordt aangetoond door een toename van witte punta.

Zonder baclofen wordt geen toename van synapsvorming gezien. In vivo resulteert intraperitoneale injectie van het snelle antidepressivum in een toename van de synapsvorming in vergelijking met de zoutoplossingcontrole. Hoewel sommige punta's in de technische controlebeelden voorkomen, zijn ze over het algemeen niet even groot als de witte specificatie in vergelijking met de grote punta in de andere panelen.

Verder bevinden deze punta's zich niet op dezelfde locatie als aangetoond door sommige punta's die in de soma voorkomen. DetectSyn kan veranderingen in synapsen identificeren als gevolg van een ziektetoestand of medicamenteuze behandeling. Deze methode kan helpen inzicht te geven in elk onderzoeksgebied dat de aandoeningen bestudeert die de ontwikkeling of afbraak van synapsen beïnvloeden.