Name: Isoleer celtypespecifieke RNAs uit snap-frozen heterogene weefselmonsters zonder celsortering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Leer celtypespecifieke RNA's isoleren uit snap-frozen heterogene weefsels zonder celsortering met het NuTRAP muizenmodel. Deze methode maakt extractie van hoogwaardige RNA's uit kleine celpopulaties mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door NIH R00HD082686. We bedanken de Endocrine Society Summer Research Fellowship aan H.S.Z. We bedanken ook Dr. Yuan Kang voor het fokken en onderhouden van de muizenkolonie.

Alle uitgevoerde dierproeven volgden de protocollen die zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) aan de Auburn University.
OPMERKING: Het volgende protocol gebruikt één testis (ongeveer 100 mg) bij P28 van Gli1-CreERT2; NuTRAP muizen (Mus musculus). Volumes reagentia moeten mogelijk worden aangepast op basis van de soorten monsters en het aantal weefsels.
1. Weefselverzameling
<ol><li>Euthanaseer de muizen met behulp van een CO2-kamer , ontsmet het buikoppervlak met 70% ethanol.</li>
	<li>Open de onderbuik met een schaar en verwijder de teelballen. Gebruik vloeibare stikstof (LN2) om de teelballen onmiddellijk te bevriezen.</li>
	<li>Bewaar monsters in de dampfase van LN2 tot gebruik.</li>
</ol>2. Bereiding van reagentia en kralen
<ol><li>Bereid de homogenisatie stockoplossing: Voeg 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mM MgCl2, 100 mM KCl, 1% NP-40 en 1 mg/ml heparine toe. Bewaar de oplossing bij 4 °C tot gebruik (maximaal 1 maand).</li>
	<li>Bereid de homogenisatiewerkbuffer uit de stamoplossing (stap 2.1) vers voor gebruik: Voeg DTT (eindconcentratie: 1 mM), cycloheximide (eindconcentratie: 100 μg/ml), recombinant ribonuclease (eindconcentratie: 200 eenheden/ml) en proteaseremmercocktail (eindconcentratie: 1x) toe aan de homogenisatievoorraadoplossing om de vereiste hoeveelheid van de homogenisatiewerkbuffer te maken. Bewaar de vers bereide werkbuffer op ijs tot gebruik.</li>
	<li>Bereid de zoutarme en de zoutrijke wasbuffers:<ol><li>Voor de bereiding van zoutarme wasbuffer mengt u 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mM MgCl2, 100 mM KCl en 1% NP-40. Voeg voor gebruik DTT (eindconcentratie: 1 mM) en cycloheximide (eindconcentratie: 100 μg/ml) toe.</li>
		<li>Voor de bereiding van zoutrijke wasbuffer mengt u 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mM MgCl2, 300 mM KCl, 1% NP-40. Voeg voor gebruik DTT (eindconcentratie: 2 mM) en Cycloheximide (eindconcentratie: 100 μg/ml) toe.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereid eiwit G-kralen (materiaaltabel):<ol><li>Elk monster heeft 50 μL eiwit G-kralen nodig. Plaats de benodigde hoeveelheid kralen in een centrifugebuis van 1,5 ml en scheid de kralen van de oplossing met behulp van een magnetisch rek door de buis 30-60 s op het rek te laten liggen.</li>
		<li>Verwijder het supernatant door te pipetteren. Was de kralen drie keer met telkens 1 ml ijskoude zoutarme wasbuffer.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Weefsellyse en homogenisatie
<ol><li>Voeg 2 ml ijskoude homogenisatiewerkbuffer (vers bereid uit stap 2.2) toe aan een glazen weefselslijpset. Plaats het bevroren monster snel in de molen en homogeniseer het weefsel met 30 slagen op ijs met behulp van een losse stamper.</li>
	<li>Breng het homogenaat over in een buis met ronde bodem van 2 ml en centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.</li>
	<li>Breng het supernatant over in een nieuwe buis van 2 ml. Bespaar 100 μL aan een buis van 1,5 ml als "ingang".</li>
	<li>Incubeer het supernatant in de buis van 2 ml met het anti-GFP-antilichaam (5 μg/ml; 1:400) bij 4 °C op een end-over-end rotator (24 rpm) 's nachts.</li>
</ol>4. Immunoprecipitatie
<ol><li>Breng het homogenaat/antilichaammengsel over in een nieuwe buis met ronde bodem van 2 ml met daarin de gewassen eiwit G-kralen uit stap 2.4. Incubeer bij 4 °C op een end-over-end rotator (24 rpm) gedurende 2 uur.</li>
	<li>Scheid de magnetische kralen van het supernatant met behulp van een magneetrek. Bewaar het supernatant als de "negatieve fractie". De negatieve fractie bevat (1) RNA's in EGFP-negatieve cellen en (2) RNA's in EGFP-positieve cellen die niet gebonden zijn aan ribosomen.</li>
	<li>Voeg 1 ml zoutrijke wasbuffer toe aan de kralen en draai de buis kort om de kralen te wassen. Plaats de buis in een magneetrek.</li>
	<li>Verwijder de wasbuffer. Herhaal de wasstap nog twee keer. De kralen bevatten nu het kralen-ribosoom-RNA-complex van EGFP-positieve cellen.</li>
</ol>5. RNA-extractie
OPMERKING: De volgende stappen zijn aangepast van de RNA-isolatiekit (Materiaaltabel). Behandel elke fractie (d.w.z. input, positief en negatief) als een onafhankelijk monster en isoleer RNA's onafhankelijk.
<ol><li>Incubeer de kralen uit stap 4.4 met 50 μL extractiebuffer (uit de RNA-isolatiekit) in een thermomixer (42 °C, 500 tpm) gedurende 30 minuten om RNA's uit kralen vrij te maken.</li>
	<li>Scheid de kralen met een magneetrek, breng het supernatant dat het kralen-ribosoom-RNA-complex bevat over naar een buis van 1,5 ml.</li>
	<li>Centrifugeer de buis op 3000 x g gedurende 2 minuten en pipetteer het supernatant vervolgens naar een nieuwe buis van 1,5 ml. Deze buis bevat de "positieve fractie" van de TRAP-stap. OPMERKING: Voor de input en de negatieve fracties, extraheer RNA uit 25 μL monsters met behulp van 1 ml extractiebuffer. Incubeer in een thermomixer (42 °C, 500 tpm) gedurende 30 min.</li>
	<li>Conditioneer de RNA-zuiveringskolom vooraf: Pipet 250 μL conditioneringsbuffer op de zuiveringskolom. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT). Centrifugeer de kolom bij 16.000 x g gedurende 1 min.</li>
	<li>Pipetteer gelijk volume van 70% EtOH in het supernatant vanaf stap 5.3 (ongeveer 50 μL van 70% EtOH voor de positieve fractie en 1 ml van 70% EtOH voor de input en de negatieve fracties). Meng goed door op en neer te pipetteren.</li>
	<li>Pipetteer het mengsel in de kolom vanaf stap 5.4.</li>
	<li>Centrifugeer de kolom bij 100 x g gedurende 2 minuten om RNA-binding aan het membraan in de kolom mogelijk te maken en ga vervolgens onmiddellijk verder met centrifugeren bij 16.000 x g gedurende 30 s. Gooi de doorstroom weg. OPMERKING: Voeg voor de input en de negatieve fracties telkens 250 μL van het mengsel toe aan de kolom. Herhaal stap 5.6 en 5.7 totdat alle mengsels zijn gebruikt.</li>
	<li>Pipetteer 100 μL washbuffer 1 (W1) in de kolom en centrifugeer bij 8.000 x g gedurende 1 min. Gooi de doorstroom weg.</li>
	<li>Pipet 75 μL DNase-oplossing meng direct in het zuiveringskolommembraan. Incubeer bij RT gedurende 15 min.</li>
	<li>Pipetteer 40 μL W1 in de kolom en centrifugeer bij 8.000 x g gedurende 30 s. Gooi de doorstroom weg.</li>
	<li>Pipetteer 100 μL wasbuffer 2 (W2) in de kolom en centrifugeer bij 8.000 x g gedurende 1 minuut. Gooi de doorstroom weg.</li>
	<li>Pipetteer 100 μL W2 in de kolom en centrifugeer bij 16.000 x g gedurende 2 min. Gooi de doorstroom weg. Centrifugeer dezelfde kolom opnieuw bij 16.000 x g gedurende 1 minuut om alle sporen van wasbuffer voorafgaand aan de elutiestap te verwijderen.</li>
	<li>Breng de kolom over naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml.</li>
	<li>Pipetteer 12 μL RNase-vrij water rechtstreeks op het membraan van de zuiveringskolom. De pipetpunt mag het membraan niet raken. Incubeer bij RT gedurende 1 min en centrifugeer bij 1000 x g gedurende 1 min. Ga vervolgens door met centrifugatie bij 16.000 x g gedurende 1 minuut om het RNA te elueren.</li>
</ol>6. RNA-concentratie en kwaliteit
<ol><li>Gebruik een bioanalyzer om de kwaliteit en kwantiteit van het geëxtraheerde RNA10 te beoordelen.</li>
</ol>7. Opslag en verdere analyse
<ol><li>Bewaar het RNA bij -80 °C (tot 1 jaar) tot verdere analyse (bijv. microarray, kwantitatieve PCR (qPCR) en RNA-seq, enz.). OPMERKING: Voor details van de qPCR-analyse, inclusief cDNA-synthese, raadpleegt u Lyu et al.11. Primers voor qPCR staan vermeld in de tabel met materialen.</li>
</ol>

<ol><li>Yang, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+RNA+sequencing+reveals+dynamic+regulation+of+myocardial+noncoding+RNAs+in+failing+human+heart+and+remodeling+with+mechanical+circulatory+support%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Deep RNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support.</a> Circulation. 129 (9), 1009-1021 (2014).</li>
<li>Soumillon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+source+and+mechanisms+of+high+transcriptome+complexity+in+the+mammalian+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cellular source and mechanisms of high transcriptome complexity in the mammalian testis.</a> Cell Reports. 3 (6), 2179-2190 (2013).</li>
<li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+subtypes+and+diversity+revealed+by+single-nucleus+RNA+sequencing+of+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain.</a> Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).</li>
<li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+%28TRAP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).</li>
<li>Bertin, B., Renaud, Y., Aradhya, R., Jagla, K., Junion, G. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRAP-rc%2C+translating+ribosome+affinity+purification+from+rare+cell+populations+of+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">TRAP-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (103), e52985(2015).</li>
<li>Thellmann, M., Andersen, T. G., Vermeer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+ribosome+affinity+purification+%28trap%29+to+investigate+Arabidopsis+thaliana+root+development+at+a+cell+type-specific+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Translating ribosome affinity purification (trap) to investigate Arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60919(2020).</li>
<li>Moran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+ribosome+affinity+purification+%28TRAP%29+for+RNA+isolation+from+endothelial+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Translating ribosome affinity purification (TRAP) for RNA isolation from endothelial cells in vivo.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59624(2019).</li>
<li>Roh, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+transcriptional+and+epigenomic+profiling+from+specific+cell+types+within+heterogeneous+tissues+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo.</a> Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).</li>
<li>Varjosalo, M., Taipale, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog%3A+functions+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog: functions and mechanisms.</a> Genes & Development. 22 (18), 2454-2472 (2008).</li>
<li>Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+integrity+number+%28RIN%29-standardization+of+RNA+quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Agilent+Technologies%22%5BJournal%5D)">RNA integrity number (RIN)-standardization of RNA quality control.</a> Agilent Technologies. , Application Note 1 1-8 (2004).</li>
<li>Lyu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq+reveals+sub-zones+in+mouse+adrenal+zona+fasciculata+and+the+sexually+dimorphic+responses+to+thyroid+hormone%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">RNA-seq reveals sub-zones in mouse adrenal zona fasciculata and the sexually dimorphic responses to thyroid hormone.</a> Endocrinology. 161 (9), (2020).</li>
<li>King, P., Paul, A., Laufer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shh+signaling+regulates+adrenocortical+development+and+identifies+progenitors+of+steroidogenic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Shh signaling regulates adrenocortical development and identifies progenitors of steroidogenic lineages.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21185-21190 (2009).</li>
<li>Huang, C. C., Miyagawa, S., Matsumaru, D., Parker, K. L., Yao, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor+cell+expansion+and+organ+size+of+mouse+adrenal+is+regulated+by+sonic+hedgehog%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Progenitor cell expansion and organ size of mouse adrenal is regulated by sonic hedgehog.</a> Endocrinology. 151 (3), 1119-1128 (2010).</li>
<li>Benton, L., Shan, L. -X., Hardy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+adult+Leydig+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Steroid+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of adult Leydig cells.</a> The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 53 (1-6), 61-68 (1995).</li>
<li>Monder, C., Hardy, M., Blanchard, R., Blanchard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+aspects+of+11%CE%B2-hydroxysteroid+dehydrogenase.+Testicular+11%CE%B2-hydroxysteroid+dehydrogenase%3A+development+of+a+model+for+the+mediation+of+Leydig+cell+function+by+corticosteroids%5BTitle%5D)+AND+%22Steroids%22%5BJournal%5D)">Comparative aspects of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase. Testicular 11β-hydroxysteroid dehydrogenase: development of a model for the mediation of Leydig cell function by corticosteroids.</a> Steroids. 59 (2), 69-73 (1994).</li>
<li>Bitgood, M. J., Shen, L., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sertoli+cell+signaling+by+Desert+hedgehog+regulates+the+male+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Sertoli cell signaling by Desert hedgehog regulates the male germline.</a> Current Biology. 6 (3), 298-304 (1996).</li>
<li>Beverdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox9-dependent+expression+of+Gstm6+in+Sertoli+cells+during+testis+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Sox9-dependent expression of Gstm6 in Sertoli cells during testis development in mice.</a> Reproduction. 137 (3), 481(2009).</li>
<li>Gross, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technologies+for+single-cell+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Technologies for single-cell isolation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 16897-16919 (2015).</li>
<li>Ziegenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+single-cell+RNA+sequencing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods.</a> Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li>
<li>Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+considerations+for+single-cell+rna+sequencing+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Development+Biology%22%5BJournal%5D)">Experimental considerations for single-cell rna sequencing approaches.</a> Frontiers in Cell and Development Biology. 6, 108(2018).</li>
<li>Chucair-Elliott, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+cell-specific+mouse+models+for+paired+epigenetic+and+transcriptomic+studies+of+microglia+and+astroglia%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia.</a> Communications Biology. 3 (1), 693(2020).</li>
<li>Barsoum, I., Yao, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redundant+and+differential+roles+of+transcription+factors+Gli1+and+Gli2+in+the+development+of+mouse+fetal+Leydig+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Redundant and differential roles of transcription factors Gli1 and Gli2 in the development of mouse fetal Leydig cells.</a> Biology of Reproduction. 84 (5), 894-899 (2011).</li>
<li>Mori, H., Shimizu, D., Fukunishi, R., Christensen, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphometric+analysis+of+testicular+Leydig+cells+in+normal+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Morphometric analysis of testicular Leydig cells in normal adult mice.</a> The Anatomical Record. 204 (4), 333-339 (1982).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.

Het nut van de analyse van het hele weefsel transcriptoom kan worden gedempt, vooral bij het bestuderen van complexe heterogene weefsels. Het verkrijgen van celtype-specifieke RNA's wordt een dringende noodzaak om de krachtige RNA-seq-techniek te ontketenen. De isolatie van celtypespecifieke RNA's is meestal afhankelijk van het verzamelen van een specifiek type cellen met behulp van micromanipulatie, fluorescent-activated cell sorting (FACS) of laser capture microdissection (LCM)18. Andere moderne...

High-throughput benaderingen, waaronder RNA-sequencing (RNA-seq) en microarray, hebben het mogelijk gemaakt om genexpressieprofielen op genoombreed niveau te ondervragen. Voor complexe weefsels zoals het hart, de hersenen en testis zullen de celtypespecifieke gegevens meer details geven waarin het gebruik van RNA's uit het hele weefsel wordt vergeleken 1,2,3. Om de impact van cellulaire heterogeniteit te overwinnen, is de Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) methode ontwikkeld sinds het begin van de jaren 20104. TRAP is in staat om ribosoomgebonden RNA's te isoleren van specifieke celtypen zonder weefseldissociatie. Deze methode is gebruikt voor translatoom (mRNA's die worden gerekruteerd voor het ribosoom voor vertaling) analyse in verschillende organismen, waaronder het richten op een uiterst zeldzame populatie spiercellen in Drosophila embryo's5, het bestuderen van verschillende wortelcellen in de modelplant Arabidopsis thaliana6, en het uitvoeren van transcriptoomanalyse van endotheelcellen bij zoogdieren7.
TRAP vereist een genetische modificatie om het ribosoom van een modelorganisme te labelen. Evan Rosen en collega's hebben onlangs een muismodel ontwikkeld met de naam Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) muis8, dat sinds 2017 beschikbaar is via het Jackson Laboratory. Door te kruisen met een Cre-muislijn kunnen onderzoekers dit NuTRAP-muismodel gebruiken om ribosoomgebonden RNA's en celkernen te isoleren van Cre-tot expressie brengende cellen zonder celsortering. In Cre-expresserende cellen die ook het NuTRAP-allel dragen, maakt het EGFP / L10a-gelabelde ribosoom de isolatie mogelijk van het vertalen van mRNA's met behulp van affiniteit pulldown-assays. In dezelfde cel maakt het biotine ligase herkenningspeptide (BLRP)-gelabelde kernmembraan, dat ook mCherry-positief is, de nucleaire isolatie mogelijk door gebruik te maken van affiniteits- of fluorescentiegebaseerde zuivering. Hetzelfde onderzoeksteam genereerde ook een vergelijkbare muislijn waarin het kernmembraan alleen wordt gelabeld met mCherry zonder biotine8. Deze twee genetisch gemodificeerde muislijnen geven toegang tot het karakteriseren van gepaarde epigenomische en transcriptomische profielen van specifieke soorten cellen in belang.
De egel (Hh) signaleringsroute speelt een cruciale rol in de weefselontwikkeling9. GLI1, een lid van de GLI-familie, fungeert als een transcriptionele activator en bemiddelt de Hh-signalering. Gli1+ cellen zijn te vinden in veel hormoonafscheidende organen, waaronder de bijnier en de testis. Om celtypespecifieke DNA's en RNA's uit Gli1+ cellen te isoleren met behulp van het NuTRAP-muismodel , werden Gli1-CreERT2-muizen gekruist met de NuTRAP-muizen . Shh-CreERT2-muizen werden ook gekruist met de NuTRAP-muizen die sonische egel (Shh) tot expressie brengen van cellen te isoleren. Het volgende protocol laat zien hoe u Gli1-CreERT2 gebruikt; NuTRAP-muizen om ribosoomgebonden RNA's te isoleren uit Gli1+ cellen in volwassen muistestes.

<table><tbody><tr><td>Actb</td><td>eurofins</td><td>qPCR primers</td><td>ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (forward primer/reverse primer)</td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td>2100 Bioanalyzer Instrument</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Mini EDTA-vrije Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Millipore</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>cycloheximide</td><td>Millipore</td><td>239764-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Cyp11a1</td><td>eurofins</td><td>qPCR primers</td><td>CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (forward primer/reverse primer)</td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0191</td><td></td></tr><tr><td>DTT, Dithiothreitol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P2325</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 magneet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes 15 mL</td><td>VWR</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>GFP antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab290</td><td></td></tr><tr><td>Glass grinder set</td><td>DWK Life Sciences</td><td>357542</td><td></td></tr><tr><td>heparine</td><td>BEANTOWN CHEMICAL</td><td>139975-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Hsd3b</td><td>eurofins</td><td>qPCR primers</td><td>GACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (forward primer/reverse primer)</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Biosciences</td><td>R005</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Biosciences</td><td>R004</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes 2 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-707-354</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Clariom S Assay microarrays</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Microarray service</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Millipore</td><td>492018-50 Ml</td><td></td></tr><tr><td>oligo (dT)20</td><td>Invitrogen</td><td>18418020</td><td></td></tr><tr><td>PicoPure RNA Isolation Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>KIT0204</td><td></td></tr><tr><td>Protein G Dynabead</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>RNase-vrij water</td><td>growcells</td><td>NUPW-0500</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>Sox9</td><td>eurofins</td><td>qPCR primers</td><td>TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (forward primer/reverse primer</td></tr><tr><td>Superscript IV reverse transcriptase</td><td>Invitrogen</td><td>18090050</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green PCR Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4309155</td><td></td></tr><tr><td>Sycp3</td><td>eurofins</td><td>qPCR primers</td><td>GAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (forward primer/reverse primer)</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Alfa Aesar</td><td>J62848</td><td></td></tr></tbody></table>

isoleer celtypespecifieke rna's uit snap-frozen heterogene weefselmonsters zonder celsortering

Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting

Cellulaire heterogeniteit vormt een uitdaging voor het begrijpen van de functie van complexe weefsels op transcriptoomniveau. Het gebruik van celtypespecifieke RNA's vermijdt potentiële valkuilen veroorzaakt door de heterogeniteit van weefsels en ontketent de krachtige transcriptoomanalyse. Het hier beschreven protocol demonstreert hoe de Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) methode kan worden gebruikt om ribosoomgebonden RNA's te isoleren van een kleine hoeveelheid EGFP-expresserende cellen in een complex weefsel zonder celsortering. Dit protocol is geschikt voor het isoleren van celtypespecifieke RNA's met behulp van het onlangs beschikbare NuTRAP-muismodel en kan ook worden gebruikt om RNA's te isoleren van EGFP-expressiecellen.

Gli1-CreERT2-muizen (Jackson Lab Stock Number: 007913) werden voor het eerst gekruist met de NuTRAP-reportermuis (Jackson Lab Stock Number: 029899) om dubbelmutante muizen te genereren. Muizen met beide genetisch gemanipuleerde gen-allelen (d.w.z. Gli1-CreERT2 en NuTRAP) werden eenmaal daags, om de andere dag, geïnjecteerd met tamoxifen gedurende drie injecties. Weefselmonsters werden verzameld op de7e dag na de1e dag van de injectie. Immunofluorescen...

Dit protocol is bedoeld om celtypespecifiek te isoleren, ribosomale mRNA's te vertalen met behulp van het NuTRAP-muismodel.

Isoleer celtypespecifieke RNA's uit snap-frozen heterogene weefselmonsters zonder celsortering

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids ...

Dit protocol is gericht op het verkrijgen van hoogwaardige celtypen specifieke RNA's van een klein aantal cellen in een complex weefsel zonder celsortering. Het maakt gebruik van een recent beschikbaar muismodel waarmee onderzoekers een ribosoomgebonden RNA's kunnen isoleren met behulp van GLP pull down. De methode is ook geschikt voor het isoleren van ribosoomgebonden RNA's van EGFP-expressiecellen.Voeg om te beginnen twee milliliter ijskoude homogenisatiewerkbuffer toe aan een glazen weefselslijpset. Plaats het bevroren monster snel in de molen en homogeniseer het weefsel met 30 slagen op ijs met behulp van een losse stamper. breng het homogenaat over in een ronde bodembuis van twee milliliter en centrifugeer op 12.000 g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius.Breng vervolgens het supernatant over naar een nieuwe buis van twee milliliter zonder de pellet te verstoren, waarbij 100 microliter als ingang wordt gereserveerd. Incubeer het supernatant met het anti-GFP-antilichaam bij vier graden Celsius op een end over end rotator 's nachts. Breng het homogenaat- en antilichaammengsel over in een nieuwe ronde onderbuis van twee milliliter met gewassen eiwitg-kralen en geïncubeerd vier graden Celsius op rotator bij 24 RPM gedurende twee uur.Scheid de magnetische kralen van het supernatant met behulp van een magnetisch rek. Sla het supernatant op als de negatieve fractie die de RNA's bevat in EGFP-negatieve cellen en de RNA's in EGFP-positieve cellen die niet gebonden zijn aan ribosomen. Voeg een milliliter zoutrijke wasbuffer toe aan de kralen en vortex kort de buis om de kralen te wassen.Plaats de buis vervolgens in een magnetisch rek. Verwijder de wasbuffer en herhaal de wasstappen nog twee keer om het ribosoom-RNA-complex van de kralen uit EGFP-positieve cellen te verkrijgen. Incubeer de kralen met 50 microliter extractiebuffer uit de RNA-isolatiekit in een ThermoMixer gedurende 30 minuten om RNA's uit de kralen vrij te maken.Scheid de kralen met een magnetisch rek en breng het supernatant over in een buis van 1,5 milliliter. Centrifugeer de buis gedurende twee minuten op 3000 g. Pipetteer vervolgens het supernatant naar een nieuwe buis van 1,5 milliliter.Om de RNA-zuiveringskolom vooraf te conditioneren, pipetteer 250 microliter conditioneringsbuffer op de zuiveringskolom en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer vervolgens de kolom op 16.000 g gedurende één minuut. Pipetteer een gelijk volume van 70% ethanol in het celextract en meng goed door pipetteer.Pipetteer tot 200 microliter van het mengsel in de geconditioneerde RNA-zuiveringskolom. Om het verlies van monsters te verminderen, vult u de kolom niet meer dan 80% van zijn capaciteit. Herhaal deze stap meerdere keren totdat alle RNA's in dezelfde kolom van elke fractie zijn verzameld.Centrifugeer de kolom gedurende twee minuten om RNA aan het membraan in de kolom te binden. Ga vervolgens door met centrifugatie gedurende 30 seconden. Gooi de doorstroom weg en pipetteer 100 microliter wasbuffer één in de kolom.Centrifugeer gedurende één minuut en gooi de stroom vervolgens weg. Pipet 75 microliter DNA-oplossing mengt zich rechtstreeks in het zuiveringskolommembraan. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.Pipet vervolgens 40 microliter wasbuffer één in de kolom en centrifugeer nog eens 30 seconden. Gooi de stroom weg. Pipetteer 100 microliter wasbuffer twee in de kolom en centrifugeer gedurende één minuut bij 8.000 g.Gooi de stroom weg. Koop PET 100 microliter wasbuffer twee in de kolom en centrifugeer gedurende twee minuten op 16.000 g. Gooi de stroom weg en centrifugeer dezelfde kolom opnieuw op 16.000 g gedurende één minuut om alle sporen van wasbuffer te verwijderen.Breng de kolom over naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. pipet 12 microliter RNase-vrij water rechtstreeks op het membraan van de zuiveringskolom, zodat de pipetpunt het membraan niet raakt. Incubeer gedurende één minuut bij kamertemperatuur en centrifugeer gedurende één minuut bij 1000 g.Dan op 16.000 G gedurende één minuut om het RNA te elueren. Gebruik een bioanalyzer om de kwaliteit en kwantiteit van het geëxtraheerde RNA te beoordelen. Bewaar de RNA's in een vriezer van 80 graden of verzend ze voor verdere analyse.Muizen met beide genetisch gemanipuleerde gen-allelen, Gli1-CreERT2 en NuTRAP, we worden eenmaal per dag geïnjecteerd met tamoxifen, om de andere dag gedurende drie injecties. Immunofluorescentieanalyse van verzamelde weefsels toont aan dat het EGFP tot expressie kwam in interstitiële cellen in de teelballen. EGFP werd ook gevonden in bijniercapsulaire cellen in Gli1-CreERT2, NuTRAP-muizen.In Sonic Hedgehog-CreERT2, NuTRAP-muizen De EGFP-positieve celpopulatie bevindt zich in de buitenste cortex van de bijnier onder de capsule, wat de expressie van EGFP-pre-expresserende cellen bevestigt. Na de extractie van de celtypespecifieke RNA's werd het geëxtraheerde RNA verzonden voor microarray-analyse. De resultaten toonden aan dat ongeveer 3000 genen verrijkt waren in de positieve fractie, vergeleken met genen in de negatieve fractie, terwijl ongeveer 4.000 genen verrijkt waren in de negatieve fractie.Onder de differentieel tot expressie gebrachte genen werden Leydig-celgeassocieerde genen Hsd11b1 en Hsd3b6 verrijkt in de positieve fractie. In de negatieve fractie werden de Sertoli-celgeassocieerde genen Desert Hedgehog en Gstm6 verrijkt. Slechts enkele differentieel tot expressie gebrachte genen werden geïdentificeerd bij het vergelijken van de negatieve fractie met de input.Realtime kwantitatieve RT-PCR werd gebruikt om de expressie van sleutelgenen in de positieve en negatieve fracties te bevestigen. Vergelijkbaar met wat werd gevonden in de microarray-assay, werden steroidogene enzymen 3-beta hydroxy steroïde dehydrogenase en cholesterol side chain cleavage enzyme verrijkt in de positieve fractie. Ondertussen werden de Sertoli-celmarker SRY-boxtranscriptiefactor negen en de kiemcelmarker synaptonemaal complexeiwit drie verrijkt in de negatieve fractie.Bij het proberen van dit protocol is het belangrijk om verse homogenisatie werkbuffer te bereiden Voeg DTT, cycloheximide recombinant ribonuclease en proteïnaseremmercocktail toe aan de homogenisatie stockoplossing alleen voor gebruik. Het is ook belangrijk om voor gebruik vers zoutarm en de hoge zoutwasbuffers te bereiden.

isolate-cell-type-specific-rnas-from-snap-frozen-heterogeneous-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In dit artikel beschrijven we een eenvoudige methode voor het verzamelen van enkele cellen van rat primaire neuronale culturen en de daaropvolgende transcriptoom analyse met behulp van ARNA versterking. Deze aanpak is generaliseerbaar naar een willekeurige cel type.

Transcriptoom Analyse van de individuele cellen

Genexpressie analyse van een subset van cellen in een specifiek weefsel vormt een grote uitdaging. In dit artikel wordt beschreven hoe u een hoge kwaliteit totaal RNA van een specifieke cel populatie te isoleren door het combineren van een snelle immunolabeling methode met lasermicrodissectie.

RNA isolatie van de Cel specifieke subpopulaties met behulp van laser-capture Microdissection Gecombineerd met Rapid immunolabeling

Hier presenteren we een protocol voor laser-geassisteerde microdissectie van specifieke plantencellen voor transcriptioneel profileren. Hoewel het protocol geschikt is voor verschillende soorten en celtypen, is de focus op zeer ontoegankelijke cellen van de vrouwelijke kiemlijn die belangrijk zijn voor seksuele en apomictische reproductie in het kruisbloemigengeslacht Boechera.

Laser-assisted Microdissection (LAM) als een tool voor Transcriptionele Profiling van individuele cel Types

Hier presenteren we een protocol om snel isoleren kwalitatief hoogwaardige kernen uit de verse of bevroren weefsel voor downstream massaal parallelle RNA sequencing. Wij omvatten wasmiddel-mechanische en hypotone-mechanische weefsel verstoring en cel lysis van de opties, die beide kunnen worden gebruikt voor isolatie van kernen.

Isolatie van volwassen ruggenmerg kernen voor Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Dit protocol beschrijft de procedure om te isoleren van één fluorescently geëtiketteerde neuronen gevolgd door in vitro transcriptie gebaseerde mRNA versterking voor hoge-diepte eencellige RNA sequencing sorteren handleiding.

Eencellige RNA Sequencing van Fluorescently geëtiketteerde muis neuronen met behulp van handmatig sorteren en dubbele In Vitro transcriptie met Absolute aantallen Sequencing (DIVA-Seq)

Een laser Capture microdissection (LCM)-protocol werd ontwikkeld om voldoende hoeveelheid kwalitatief hoogwaardig RNA te verkrijgen voor genexpressie analyse in botcellen. De huidige studie focust op de muis dijbeen secties. Het hier gerapporteerde LCM-protocol kan echter worden gebruikt om genexpressie in cellen van een hard weefsel te bestuderen.

Een laser Capture microdissection protocol dat hoge kwaliteit RNA oplevert van vers-bevroren muis botten

Deze publicatie beschrijft een protocol voor de isolatie van kernen van volwassen adipocyten, zuivering door fluorescentie-geactiveerde sortering en transcriptie op eencellig niveau.

Isolatie van vetweefselkern voor eencellige genomische toepassingen

Enkele kernisolatie is afhankelijk van dissociatie en detergent-gebaseerde permeabilisatie van het celmembraan, stappen die optimalisatie nodig hebben en gevoelig zijn voor de invoering van technische artefacten. We demonstreren een wasmiddel- en enzymvrij protocol voor snelle isolatie van intacte kernen rechtstreeks uit hele weefsel, wat kernen oplevert die geschikt zijn voor single-nucleus RNA-seq (snRNA-Seq) of ATAC-seq.

Nuclei isolatie van hele weefsel met behulp van een wasmiddel en enzym-vrije methode

Hier presenteren we een protocol voor het isoleren van kernen uit flash-bevroren, gearchiveerde leverweefsels voor single-nucleus RNA-seq, ATAC-seq en gezamenlijke multiomics (RNA-seq en ATAC-seq).

Isolatie van kernen uit flash-bevroren leverweefsel voor eencellige multiomics

Hier presenteren we een protocol dat de voorbereiding van celkernen beschrijft. Na microdissectie en enzymatische dissociatie van hartweefsel in afzonderlijke cellen, werden de voorlopercellen bevroren, gevolgd door isolatie van zuivere levensvatbare cellen, die werden gebruikt voor single-nucleus RNA-sequencing en de single-nucleus assay voor transposase-toegankelijk chromatine met high-throughput sequencing-analyses.

Kernisolatie van hartvoorlopercellen van muizen voor epigenoom- en genexpressieprofilering met eencellige resolutie

De studie beschrijft een eenvoudig, snel en gedeeltelijk geautomatiseerd protocol om kernen van hoge kwaliteit te isoleren uit bevroren zoogdierweefsels voor stroomafwaartse RNA-sequencing met één kern.

Een eenvoudig, snel en gedeeltelijk geautomatiseerd protocol voor de isolatie van afzonderlijke kernen uit ingevroren zoogdierweefsels voor sequencing van één kern

Leer celtypespecifieke RNA's isoleren uit snap-frozen heterogene weefsels zonder celsortering met het NuTRAP muizenmodel. Deze methode maakt extractie van hoogwaardige RNA's uit kleine celpopulaties mogelijk.

Isoleer celtypespecifieke RNA's uit snap-frozen heterogene weefselmonsters zonder celsortering

Meer video's verkennen