Isoleer celtypespecifieke RNA's uit snap-frozen heterogene weefselmonsters zonder celsortering

Dit protocol is gericht op het verkrijgen van hoogwaardige celtypen specifieke RNA's van een klein aantal cellen in een complex weefsel zonder celsortering. Het maakt gebruik van een recent beschikbaar muismodel waarmee onderzoekers een ribosoomgebonden RNA's kunnen isoleren met behulp van GLP pull down. De methode is ook geschikt voor het isoleren van ribosoomgebonden RNA's van EGFP-expressiecellen.

Voeg om te beginnen twee milliliter ijskoude homogenisatiewerkbuffer toe aan een glazen weefselslijpset. Plaats het bevroren monster snel in de molen en homogeniseer het weefsel met 30 slagen op ijs met behulp van een losse stamper. breng het homogenaat over in een ronde bodembuis van twee milliliter en centrifugeer op 12.000 g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius.

Breng vervolgens het supernatant over naar een nieuwe buis van twee milliliter zonder de pellet te verstoren, waarbij 100 microliter als ingang wordt gereserveerd. Incubeer het supernatant met het anti-GFP-antilichaam bij vier graden Celsius op een end over end rotator 's nachts. Breng het homogenaat- en antilichaammengsel over in een nieuwe ronde onderbuis van twee milliliter met gewassen eiwitg-kralen en geïncubeerd vier graden Celsius op rotator bij 24 RPM gedurende twee uur.

Scheid de magnetische kralen van het supernatant met behulp van een magnetisch rek. Sla het supernatant op als de negatieve fractie die de RNA's bevat in EGFP-negatieve cellen en de RNA's in EGFP-positieve cellen die niet gebonden zijn aan ribosomen. Voeg een milliliter zoutrijke wasbuffer toe aan de kralen en vortex kort de buis om de kralen te wassen.

Plaats de buis vervolgens in een magnetisch rek. Verwijder de wasbuffer en herhaal de wasstappen nog twee keer om het ribosoom-RNA-complex van de kralen uit EGFP-positieve cellen te verkrijgen. Incubeer de kralen met 50 microliter extractiebuffer uit de RNA-isolatiekit in een ThermoMixer gedurende 30 minuten om RNA's uit de kralen vrij te maken.

Scheid de kralen met een magnetisch rek en breng het supernatant over in een buis van 1,5 milliliter. Centrifugeer de buis gedurende twee minuten op 3000 g. Pipetteer vervolgens het supernatant naar een nieuwe buis van 1,5 milliliter.

Om de RNA-zuiveringskolom vooraf te conditioneren, pipetteer 250 microliter conditioneringsbuffer op de zuiveringskolom en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer vervolgens de kolom op 16.000 g gedurende één minuut. Pipetteer een gelijk volume van 70% ethanol in het celextract en meng goed door pipetteer.

Pipetteer tot 200 microliter van het mengsel in de geconditioneerde RNA-zuiveringskolom. Om het verlies van monsters te verminderen, vult u de kolom niet meer dan 80% van zijn capaciteit. Herhaal deze stap meerdere keren totdat alle RNA's in dezelfde kolom van elke fractie zijn verzameld.

Centrifugeer de kolom gedurende twee minuten om RNA aan het membraan in de kolom te binden. Ga vervolgens door met centrifugatie gedurende 30 seconden. Gooi de doorstroom weg en pipetteer 100 microliter wasbuffer één in de kolom.

Centrifugeer gedurende één minuut en gooi de stroom vervolgens weg. Pipet 75 microliter DNA-oplossing mengt zich rechtstreeks in het zuiveringskolommembraan. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.

Pipet vervolgens 40 microliter wasbuffer één in de kolom en centrifugeer nog eens 30 seconden. Gooi de stroom weg. Pipetteer 100 microliter wasbuffer twee in de kolom en centrifugeer gedurende één minuut bij 8.000 g.

Gooi de stroom weg. Koop PET 100 microliter wasbuffer twee in de kolom en centrifugeer gedurende twee minuten op 16.000 g. Gooi de stroom weg en centrifugeer dezelfde kolom opnieuw op 16.000 g gedurende één minuut om alle sporen van wasbuffer te verwijderen.

Breng de kolom over naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. pipet 12 microliter RNase-vrij water rechtstreeks op het membraan van de zuiveringskolom, zodat de pipetpunt het membraan niet raakt. Incubeer gedurende één minuut bij kamertemperatuur en centrifugeer gedurende één minuut bij 1000 g.

Dan op 16.000 G gedurende één minuut om het RNA te elueren. Gebruik een bioanalyzer om de kwaliteit en kwantiteit van het geëxtraheerde RNA te beoordelen. Bewaar de RNA's in een vriezer van 80 graden of verzend ze voor verdere analyse.

Muizen met beide genetisch gemanipuleerde gen-allelen, Gli1-CreERT2 en NuTRAP, we worden eenmaal per dag geïnjecteerd met tamoxifen, om de andere dag gedurende drie injecties. Immunofluorescentieanalyse van verzamelde weefsels toont aan dat het EGFP tot expressie kwam in interstitiële cellen in de teelballen. EGFP werd ook gevonden in bijniercapsulaire cellen in Gli1-CreERT2, NuTRAP-muizen.

In Sonic Hedgehog-CreERT2, NuTRAP-muizen De EGFP-positieve celpopulatie bevindt zich in de buitenste cortex van de bijnier onder de capsule, wat de expressie van EGFP-pre-expresserende cellen bevestigt. Na de extractie van de celtypespecifieke RNA's werd het geëxtraheerde RNA verzonden voor microarray-analyse. De resultaten toonden aan dat ongeveer 3000 genen verrijkt waren in de positieve fractie, vergeleken met genen in de negatieve fractie, terwijl ongeveer 4.000 genen verrijkt waren in de negatieve fractie.

Onder de differentieel tot expressie gebrachte genen werden Leydig-celgeassocieerde genen Hsd11b1 en Hsd3b6 verrijkt in de positieve fractie. In de negatieve fractie werden de Sertoli-celgeassocieerde genen Desert Hedgehog en Gstm6 verrijkt. Slechts enkele differentieel tot expressie gebrachte genen werden geïdentificeerd bij het vergelijken van de negatieve fractie met de input.

Realtime kwantitatieve RT-PCR werd gebruikt om de expressie van sleutelgenen in de positieve en negatieve fracties te bevestigen. Vergelijkbaar met wat werd gevonden in de microarray-assay, werden steroidogene enzymen 3-beta hydroxy steroïde dehydrogenase en cholesterol side chain cleavage enzyme verrijkt in de positieve fractie. Ondertussen werden de Sertoli-celmarker SRY-boxtranscriptiefactor negen en de kiemcelmarker synaptonemaal complexeiwit drie verrijkt in de negatieve fractie.

Bij het proberen van dit protocol is het belangrijk om verse homogenisatie werkbuffer te bereiden Voeg DTT, cycloheximide recombinant ribonuclease en proteïnaseremmercocktail toe aan de homogenisatie stockoplossing alleen voor gebruik. Het is ook belangrijk om voor gebruik vers zoutarm en de hoge zoutwasbuffers te bereiden.