Name: Ex Vivo Leverperfusie door de poortader in muis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: Leer een gestroomlijnde leverperfusietechniek via de poortader in muizen voor metabole studies. Deze methode biedt rigoureuze controle over voedingsstoffen en hormonen bij ziekteonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door financiering van de National Institutes of Health (R01-DK105346, P41-GM122698, 5U2C-DK119889). Een deel van dit werk werd uitgevoerd in het McKnight Brain Institute in de Advanced Magnetic Resonance Imaging and Spectroscopy (AMRIS) Facility van het National High Magnetic Field Laboratory, die wordt ondersteund door de National Science Foundation Cooperative Agreement No. DMR-1644779 en de staat Florida.

Experimenten met muizen werden behandeld in overeenstemming met de University of Florida Institutional Animal Care and Use Committee (protocolnummer # 201909320). De gebruikte muizenstam was C57BL/6J; alle muizen waren mannelijk. Deze methode is over het algemeen ook toepasbaar voor studies met andere standaard muizenstammen. Deze operatie wordt optimaal uitgevoerd door twee personen die samenwerken.
1. Initiële set-up
<ol><li>Perfuseer levers met perfusaat dat Krebs-Henseleit-elektrolytenbevat 6(25 mM NaHCO3, 112 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM elk van MgSO4, KH2PO4 en 0,5 mM natrium-EDTA, 1,25 mM CaCl2), 6 mM natriumlactaat, 0,6 mM natriumpyruvaat, 0,2 mM [U-13C] natriumpropionaat, 10% (v/v) D2O, en 0,63 mM gemengde vetzuren (met palmitinezuur (22,1% van het totaal), palmitoleïnezuur (5,2%), stearinezuur (2,7%), oliezuur (27%), linolzuur (37,7%), γ-linoleenzuur (2,4%) en decosahexanoïnezuur (2,8%)) samen met 2% (w / v) runderserumalbumine. Stel de uiteindelijke pH van perfusaat in op 7,3 met behulp van HCl (en NaOH, indien nodig).</li>
</ol>2. Pre-operatieve opstelling
<ol><li>Monteer twee spuiten van 1 ml met een naald van 23 G die 19,05 mm lang zijn. Vul één spuit met 0,01 ml van 1000 eenheden/ml heparine en 0,19 ml zoutoplossing (0,9% (w/v) NaCl in water; Tabel 1).</li>
	<li>Vul de tweede spuit met 0,2 ml 2% lidocaïne en 0,6 ml 0,9% zoutoplossing (tabel 1). Vul in een andere spuit van 1 ml met een naald van 27 G 38,1 mm met het perfusaat en houd het op 37 °C.</li>
</ol>3. Perfusate kolom set-up
<ol><li>Plaats de glazen fles met 500 ml perfusaat in het waterbad (figuur 1B). Zet het waterbad aan en stel de temperatuur in op ~42 °C. De hogere temperatuur in het waterbad maakt het mogelijk om 37 °C in de perfusiekolom te behouden.</li>
	<li>Zodra het water is opgewarmd tot 42 °C, schakelt u de twee pompen in om het perfusaat uit de fles door de dunne film oxygenator en de met water omhulde glazen kolom van 100 cm te laten circuleren (figuur 1A-E).</li>
	<li>Schakel het zuurstofhoudende gas (95% zuurstof en 5% koolstofdioxide) in om de oxygenator7 onder druk te zetten (figuur 1C). Pas de hoogte van de perfusaatkolom aan om een debiet van 8 ml/min te bereiken met de katheter bevestigd (zie stap 9 voor het meten van het debiet)5,8,9. OPMERKING: Stroomsnelheid verwijst naar de snelheid waarmee perfusaat door de lever wordt verdreven.</li>
</ol>4. Verdoving van de muis
<ol><li>Draag PBM's zoals vereist door het IACUC-protocol en andere toepasselijke veiligheidsrichtlijnen. OPMERKING: De volgende stappen zijn geoptimaliseerd voor muizen die 9 - 13 weken oud zijn.</li>
	<li>Plaats de muis in de isofluraankamer. Draai het afgiftegas naar 100% zuurstof, een debiet van 1 l/min en het isofluraan naar 2%10. Wacht tot de ademhaling vertraagt en stabiel is. OPMERKING: Om de muis een stabiel chirurgisch vlak te laten bereiken, zoals blijkt uit een langzame en gestage ademhalingsfrequentie en een gebrek aan teenknijpersreflex, kan de zuurstofstroomsnelheid worden aangepast tot ~ 1,5 l / min tot ~ 3 l / min en de isofluraanconcentratie van 1 - 3%. De afgiftesnelheid van de concentratie van dragergas en isofluraan is afhankelijk van de leeftijd en het gewicht van het dier en factoren zoals geluid en licht.</li>
	<li>Desinfecteer de buik met 70% alcohol. Dien heparine toe via een diepe subcutane injectie in de buikvetlaag (figuur 2). Plaats de muis gedurende 10 minuten terug in de anesthesiekamer. OPMERKING: Scheren is niet vereist omdat deze procedure terminaal is.</li>
</ol>5. Celiotomie
<ol><li>Breng de muis over van de anesthesiekamer naar het operatieplatform en plaats deze in rugligging (figuur 3).</li>
	<li>Plaats de neus van de muis in een neuskegel en plak de poten naar beneden. Zorg ervoor dat u de nek niet belast die tot verstikking kan leiden.</li>
	<li>Dien lidocaïne toe via een subcutane injectie bilateraal in het voorste iliacale kamgebied11 (figuur 3). Voer een teenknijptest uit om de afwezigheid van alle pijnreflexen te bevestigen.</li>
	<li>Voer celiotomie uit om de inwendige organen bloot te leggen (figuur 4). Maak een 3 cm brede incisie (de breedte van de hele buik van de muis). OPMERKING: De breedte verandert met de leeftijd en het dieet van de muis.</li>
	<li>Breid de incisie uit met behulp van een hemostaat die tractie trekt door op het xiphoid-proces te klemmen (figuur 4).</li>
</ol>6. Cannulatie van poortader
<ol><li>Gebruik een applicator met katoenpunt om de dunne en dikke darm die de poortader bedekken, te verwijderen. Plaats een zijden hechting onder de boog van de poortader proximaal van de lever (figuur 4A).</li>
	<li>Plaats, afhankelijk van de anatomische structuur, de tweede zijdenaad proximaal of distale van de inferieure mesenteriale aderdistale van de lever (figuur 4A)12,13. Gebruik een 2-0 hechting voor beide hechtingen.</li>
	<li>Zodra de hechtingen op hun plaats zijn, cannuleer de poortader met een 22G-katheter14 (figuur 4B). Houd bij het inbrengen van de katheter de schuine kant omhoog gericht. Betreed de poortader in een hoek van niet meer dan 15°.</li>
	<li>Bind de eerste hechting langs de kathetertapper. Nadat de poortader is gecannuleerd, verankert u de katheter 2-3 mm distal van de tak van de poortader met de zijdenaad (figuur 4B). OPMERKING: De assistent moet schouders en polsen rollen om te voorkomen dat de katheter losraakt of de poortader scheurt. Elke hechting vereist twee knopen.</li>
	<li>Zet vervolgens het onderste deel van de katheter vast met de tweede hechting. Bind met behulp van de chirurgische assistent een knoop met de hechtdraad om de katheter vast te zetten aan het distale deel van de poortader en het omliggende weefsel.</li>
</ol>7. Resectie van leverpostportaal ader cannulatie
<ol><li>Nadat de katheter is vastgezet, plaatst u een spuit van 1 ml met een naald van 27 G die 38,1 mm lang is in de katheter om bloed en luchtbellen te spoelen. OPMERKING: Er is meestal een terugstroom van bloed uit de katheter van de druk.</li>
	<li>Gebruik een 1 mm I.D. x 5 mm O.D. siliconenbuis met een vaste stopkraan om de perfusiekolom (figuur 1A) aan de katheter te koppelen, waardoor de buffer in de lever kan stromen en het begin van de perfusie markeert. Start op dit punt een timer om het begin van de perfusie te markeren.</li>
	<li>Verlicht de verhoogde vasculaire druk door met behulp van een schaar een incisie te maken in de inferieure vena cava.</li>
	<li>Bevestig de stroom van perfusaat door de lever door de homogene verandering in leverkleur van roze / rood naar lichtgeel te observeren. Zodra de stroom is bevestigd, snijdt u de maag, dunne darm, dikke darm en de rechternier uit het omliggende weefsel.</li>
	<li>Manoeuvreer met behulp van de chirurgische assistent de lever rond de buik- en borstholte terwijl de chirurg door het pariëtale peritoneum en thoracale weefsel snijdt om de lever te reseceren</li>
	<li>Til ten slotte de lever naar boven en knip de resterende bindweefsels die de lever op zijn plaats houden met een schaar. Manipuleer langzaam de lever voor het gemak van het zicht. Verwijder alle vacht die aan de lever kleeft door af te spoelen met perfusaat voordat u het inkapselt in de NMR-buis. OPMERKING: Bij deze procedure wordt alleen de lever verwijderd. Alle andere organen blijven achter in het lichaam van het dier. De galwegen kunnen worden verwijderd op basis van het protocol van het experiment. Hoewel het voor dit experiment op zijn plaats werd gelaten.</li>
</ol>8. De lever aan de kolom hangen
<ol><li>Zodra de chirurg de lever en slang aan de assistent overhandigt, maakt de assistent de slang los van de katheter en kolom.</li>
	<li>Vul de katheter met perfusaat totdat er een meniscus is gevormd aan de bovenkant van de katheter. Bevestig de katheter aan de kolom zodat de lever kan hangen en perfuseren. OPMERKING: De parel van perfusaat op de katheter biedt voldoende volume om de lever te laten functioneren totdat deze is aangesloten. De katheter die aan de lever is bevestigd, wordt aan de onderkant van de kolom ingedrukt.</li>
	<li>Schroef een NMR-buis van 20 mm op de glazen kolom van 100 cm om de lever in te kapselen (figuur 5). Om torsie van de lever en de poortader te voorkomen, schroeft u langzaam de NMR-buis vast. Als torsie optreedt en de stroom wordt gestopt, schroeft u de NMR-buis los en schroeft u deze opnieuw. Dit zal de occlusie verhelpen en de stroom zal terugkeren.</li>
	<li>Perfuseer de lever gedurende 30-60 minuten op basis van de details van het onderzoek. OPMERKING: De tijd is gebaseerd op het perfusie-experiment. Voor dit experiment werd de metabole omzet binnen 30 minuten gemeten. De leverperfusie kan tot 10 minuten duren om een stabiele toestand te bereiken. De tijd tot steady-state begint zodra de inferieure vena cava is gesneden en de leverstroom is vastgesteld.</li>
</ol>9. Flow meting
<ol><li>Plaats een weegboot op een bovenste laadbalans en nul de balans. Plaats de slang van de rolpomp die efferente perfusaat uit de NMR trekt in de weegboot en start de timer.</li>
	<li>Weeg de massa vloeistof die zich gedurende 1 minuut heeft opgehoopt en die de stroomsnelheid van de lever oplevert. Plaats de buis terug in de afval-/opvangcontainer.</li>
</ol>10. Zuurstofmeting
OPMERKING: De metingen van de zuurstofmeter zijn ingesteld volgens de instructies van de fabrikant15.
<ol><li>Plaats de elektrode met 20 μL 50% KCl verzadigde oplossing op de platina koepel en plaats vijf druppels van 10 μL rond de onderste platina ring van de elektrode.</li>
	<li>Verwijder de lijm van het sigarettenpapier. Leg een stuk polytetrafluorethyleenmembraan over het sigarettenpapier.</li>
	<li>Plaats de twee stukken bovenop de elektrode. Plaats een kleine O-ring rond de bovenkant van de elektrode. Snijd het papier bij om plat op de onderste platina ring op de elektrode te liggen. OPMERKING: Enige overhang is acceptabel. Het is essentieel om het zilver van de elektrode te bedekken.</li>
	<li>Plaats de grotere O-ring op de elektrode. Koppel de elektrode aan de waterkamer en draai de basis vast om de elektrode op zijn plaats te houden. Zet het waterbad aan en laat opwarmen tot 37 °C.</li>
	<li>Open zuurstofmeter software. Klik op Kalibreer > luchtverzadigd water. Stel de roersnelheid in op 75 en de temperatuur op 37 °C.</li>
	<li>Vul een injectieflacon van 50 ml halverwege met water en schud krachtig gedurende 2 minuten. Dit is luchtverzadigd water, gebruik het als 100% standaard. Vul de zuurstofmeterkamer met ~ 2 ml water en plaats de tweedelige stop erop.</li>
	<li>Klik op OK op het scherm en laat het signaal plateau. Zodra het signaal een plateau heeft bereikt, klikt u op OK. Gooi vloeistof in de kamer en droog met tissuepapier.</li>
	<li>Herhaal stap 10,6-10,7, maar met 200 mM natriumsulfiet (0% standaard). Klik op Kalibratie opslaan. OPMERKING: Er is geen krachtig schudden nodig voor de 0%-norm.</li>
	<li>Gebruik tijdens de perfusie twee spuiten van 5 ml. Eén spuit voor circulerend perfusaat (zuurstof in) en de tweede voor efferente perfusaat uit de NMR-buis (zuurstof uit).</li>
	<li>Trek bij het opstellen van perfusaat voor zowel in- als uitmetingen telkens 3-4 ml. OPMERKING: Deze kolom heeft glazen buizen om toegang tot de NMR-buis mogelijk te maken om het perfusaat dat door de lever is gestroomd, op te zuigen.</li>
	<li>Meet het circulerende perfusaat, eerst net als water in stap 10.6 en weggooien in stap 10.7. Herhaal dezelfde stappen voor het efferente perfusaat.</li>
	<li>Voer elke 10 minuten zuurstofmetingen uit.</li>
</ol>

<ol><li>Ragavan, M., McLeod, M. A., Giacalone, A. G., Merritt, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+Dihydroxyacetone+Is+a+Sensitive+Probe+of+Hepatic+Gluconeogenic+State%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolites%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized Dihydroxyacetone Is a Sensitive Probe of Hepatic Gluconeogenic State.</a> Metabolites. 11 (7), 441(2021).</li>
<li>Lumata, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+%2813%29C+Magnetic+Resonance+and+Its+Use+in+Metabolic+Assessment+of+Cultured+Cells+and+Perfused+Organs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized (13)C Magnetic Resonance and Its Use in Metabolic Assessment of Cultured Cells and Perfused Organs.</a> Methods in Enzymology. 561, 561-573 (2015).</li>
<li>Moreno, K. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+detection+of+hepatic+gluconeogenic+and+glycogenolytic+states+using+hyperpolarized+%5B2-13C%5D+dihydroxyacetone%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Real-time detection of hepatic gluconeogenic and glycogenolytic states using hyperpolarized [2-13C] dihydroxyacetone.</a> The Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35859-35867 (2014).</li>
<li>Moreno, K. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+%CE%B4-%5B1-13C%5D+gluconolactone+as+a+probe+of+the+pentose+phosphate+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+in+Biomedicine%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized δ-[1-13C] gluconolactone as a probe of the pentose phosphate pathway.</a> NMR in Biomedicine. 30 (6), (2017).</li>
<li>Merritt, M. E., Harrison, C., Sherry, A. D., Malloy, C. R., Burgess, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flux+through+hepatic+pyruvate+carboxylase+and+phosphoenolpyruvate+carboxykinase+detected+by+hyperpolarized+13C+magnetic+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Flux through hepatic pyruvate carboxylase and phosphoenolpyruvate carboxykinase detected by hyperpolarized 13C magnetic resonance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (47), 19084-19089 (2011).</li>
<li>Bailey, L. E., Ong, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Krebs-Henseleit+solution+as+a+physiological+buffer+in+perfused+and+superfused+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+Methods%22%5BJournal%5D)">Krebs-Henseleit solution as a physiological buffer in perfused and superfused preparations.</a> Journal of Pharmacological Methods. 1 (2), 171-175 (1978).</li>
<li>Kolwicz, S. C. Jr, Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Cardiac+Function+and+Energetics+in+Isolated+Mouse+Hearts+Using+31P+NMR+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2069(2010).</li>
<li>Hwang, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+butylated+hydroxylanisole+against+hydrogen+peroxide-induced+apoptosis+in+primary+cultured+mouse+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Science%22%5BJournal%5D)">Protective effect of butylated hydroxylanisole against hydrogen peroxide-induced apoptosis in primary cultured mouse hepatocytes.</a> Journal of Veterinary Science. 16 (1), 17-23 (2015).</li>
<li>Bessems, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolated+perfused+rat+liver%3A+standardization+of+a+time-honoured+model%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">The isolated perfused rat liver: standardization of a time-honoured model.</a> Laboratory Animals. 40 (3), 236-246 (2006).</li>
<li>Beal, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Small+Animal+Model+of+Ex+Vivo+Normothermic+Liver+Perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57541(2018).</li>
<li>Collins, J. B., Song, J., Mahabir, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onset+and+duration+of+intradermal+mixtures+of+bupivacaine+and+lidocaine+with+epinephrine%5BTitle%5D)+AND+%22The+Canadian+Journal+of+Plastic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Onset and duration of intradermal mixtures of bupivacaine and lidocaine with epinephrine.</a> The Canadian Journal of Plastic Surgery. 21 (1), 51-53 (2013).</li>
<li>Medical Dictionary. , Merriam-Webster. Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.merriam-webster.com/medical">https://www.merriam-webster.com/medical</a> (2022).</li>
<li>Thorpe, D. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThorpe%2C+DR+%22A+Dissection+in+Color%3A+The+Rat+%28and+the+Sheep%27s+Brain%29%22">A Dissection in Color: The Rat (and the Sheep's Brain)</a>. , National Press Books. Palo Alto, CA. (1968).</li>
<li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Hepatocytes+and+Sinusoidal+Endothelial+Cells+from+Mouse+Liver+Perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993(2018).</li>
<li>Operations Manual Setup, Installation and Maintenance. , Hansatech Instruments. Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.chem.ucla.edu/dept/Faculty/merchant/pdf/electrode_prep_maintenance.pdf">https://www.chem.ucla.edu/dept/Faculty/merchant/pdf/electrode_prep_maintenance.pdf</a> (2006).</li>
<li>Heparin. , DrugBank Online. Available from: 
 <a target="_blank" href="https://go.drugbank.com/drugs/DB01109">https://go.drugbank.com/drugs/DB01109</a> (2022).</li>
<li>Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+anesthesia+and+euthanasia+on+metabolomics+of+mammalian+tissues%3A+studies+in+a+C57BL%2F6J+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: studies in a C57BL/6J mouse model.</a> PloS One. 10 (2), 0117232(2015).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben. De financiers hadden geen rol in de opzet van het onderzoek; bij het verzamelen, analyseren of interpreteren van gegevens; bij het schrijven van het manuscript; of in de beslissing om de resultaten te publiceren.

Deze chirurgische ingreep is een uitdaging en vereist uitgebreide oefening om reproduceerbare resultaten te bereiken. Isofluraan en dragergas moeten indien nodig worden aangepast om de levensvatbaarheid van het dier te behouden gedurende zoveel mogelijk van de chirurgische ingreep. Omgeving, tijd van de dag, leeftijd, gewicht en verschillende andere factoren zullen de anesthesie beïnvloeden. Gewicht, dieet, muizenstam en leeftijd kunnen van invloed zijn op de operatie, omdat vetopbouw het visualiseren van de poortader ka...

Ex vivo perfusies zijn cruciaal in de studie van het levermetabolisme en perfusie via de poortader is de standaard voor deze studies. Om het levermetabolisme afzonderlijk te bestuderen, moet de lever uit het lichaam worden gereseceerd om complicaties als gevolg van het metabolisme in andere organen (d.w.z. het metabolisme van het hele lichaam) te voorkomen en om controle uit te oefenen over de beschikbaarheid van hormonen (insuline, glucagon, enz.). Deze aanpak kan essentieel zijn voor het begrijpen van de effecten van ziekten zoals diabetes, NAFLD en NASH op het levermetabolisme, evenals mechanismen voor de werking van geneesmiddelen. Dit artikel dient als een gids voor hepatische resectie en perfusie. We hebben een gestroomlijnde procedure ontwikkeld om deze metabole leverstudies met voldoende nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid uit te voeren. Als de operatie niet correct wordt uitgevoerd, is er een uitgesproken variabiliteit in de verkregen metabole gegevens. We beschrijven een georganiseerde methode om portaladerkatheterisatie en leverresectie uit te voeren in de context van metabole studies in situ in een kernspinresonantie (NMR) spectrometer, zoals beschreven in de literatuur 1,2,3,4,5.
Momenteel is er geen literatuur die een ex vivo leverperfusie beschrijft met behulp van een glazen kolom binnen een NMR. Evenmin is er een video- of tekstpublicatie die een duidelijk voorbeeld geeft van hoe de procedure met de lever van de muis moet worden uitgevoerd, met name door te demonstreren hoe de poortader moet worden gekatheteriseerd, een lever kan worden gereseceerd, overgedragen en de lever aan een glazen kolom kan worden opgehangen. Omdat de genetisch gemodificeerde muis alomtegenwoordig wordt gebruikt voor het bestuderen van het levermetabolisme, is dit een essentiële procedure die een volledige beschrijving verdient. Leverperfusieoperaties zijn niet nieuw, maar dit artikel is een gouden standaardmethode vergezeld van een video die de technische uitmuntendheid demonstreert die in dit artikel wordt beschreven om iedereen die geïnteresseerd is in deze procedure te helpen. De hier gepresenteerde methode zou het beste kunnen worden toegepast op real-time metabolisme om de functie en omzet van metabolieten in ziektemodellen te detecteren.
Deze methode maakt gebruik van een 100 cm wateromhulde glazen kolom, waardoor de lever aan de onderkant van de canule kan hangen, ingekapseld door perfusaat in een NMR-buis. Verwarmd water in de glazen mantel wordt gebruikt om de perfusaattemperatuur te regelen. Een dunne laag oxygenator wordt onder druk gezet met 95%/5% O2/CO2 voor pH-controle. Door gebruik te maken van drie afzonderlijke pompen wordt de perfusaatkolomhoogte ingesteld, die zorgt voor een constante druk op de lever. De stroomsnelheden worden niet geregeld na de toepassing van constante druk (figuur 1). Om te bevestigen dat de lever naar behoren functioneert, worden zuurstofmetingen uitgevoerd samen met stroomsnelheden. In onze handen leidt deze set van randvoorwaarden tot zeer herhaalbare NMR-experimenten voor de beoordeling van de leverstofwisselingsfunctie.

<table><tbody><tr><td>1 mL Luer-Lock Single Use Sterile Disposable Syringe</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Non-specifiek merk</td></tr><tr><td>100 cm Water Jacketed Glass Column</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Op maat gemaakt</td></tr><tr><td>2-0 Silk Suture</td><td>Braintree Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>22 Gauge Catherter 1 in. Without Safety</td><td>Terumo</td><td>SRFF2225</td><td></td></tr><tr><td>23 G 0.75 in. Hypodemeric Needles</td><td>Exel International</td><td>26407</td><td></td></tr><tr><td>27 G 1.5 in. Hypodemeric Needles</td><td>Exel International</td><td>26426</td><td></td></tr><tr><td>4x4 in. Surgical Platform</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Op maat gemaakt</td></tr><tr><td>70% Alcohol Wipe</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Non-specifiek merk</td></tr><tr><td>Circulating Water Bath</td><td>MS Lauda</td><td>N/A</td><td>Model wordt niet meer geproduceerd</td></tr><tr><td>Cotton Tip Applicator</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Non-specifiek merk</td></tr><tr><td>Delicate Operating Scissors; Straight; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4 3/4 "</td><td>Roboz</td><td>RS-6702</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45 Forceps</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 - Fine Forceps</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11274-20</td><td></td></tr><tr><td>Hemostats</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>13015-14</td><td></td></tr><tr><td>Heparin Sodium Injectable 1000 units/mL</td><td>RX Generics</td><td>71288-0402-02</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Patterson Veterinary</td><td>14043-0704-06</td><td></td></tr><tr><td>Lidocaine HCl 2%</td><td>VEDCO Inc.</td><td>50989-0417-12</td><td></td></tr><tr><td>Membrane-Thin-Layer Oxygenator</td><td>Radnoti</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Metzenbaum Scissors; Curved; Blunt; 27 mm Blade Length; 5 "</td><td>Roboz</td><td>RS-6013</td><td></td></tr><tr><td>Oxygen Meter System</td><td>Hanstech Instruments Ltd.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Saline 0.9% Solution</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Saline wordt gemaakt in laboratorium</td></tr><tr><td>Scale</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Non-specifiek merk</td></tr><tr><td>&nbsp;Variable Speed Analog Console Pump Systems</td><td>Cole Palmer</td><td>N/A</td><td>Modellen zijn op maat gemaakt per toepassing</td></tr><tr><td>Weigh boats</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Non-specifiek merk</td></tr></tbody></table>

ex vivo leverperfusie door de poortader in muis

Ex Vivo Hepatic Perfusion Through the Portal Vein in Mouse

Metabole ziekten zoals diabetes, pre-diabetes, niet-alcoholische leververvetting (NAFLD) en niet-alcoholische steatohepatitis (NASH) komen steeds vaker voor. Ex vivo leverperfusies maken een uitgebreide analyse van het levermetabolisme mogelijk met behulp van nucleaire magnetische resonantie (NMR), in voedingsomstandigheden die rigoureus kunnen worden gecontroleerd. Omdat silico-simulaties een voornamelijk theoretisch middel blijven om hormoonwerkingen en de effecten van farmaceutische interventie te beoordelen, blijft de geperfuseerde lever een van de meest waardevolle testbanken voor het begrijpen van het levermetabolisme. Omdat deze studies basisinzichten in de leverfysiologie begeleiden, moeten de resultaten nauwkeurig en reproduceerbaar zijn. De grootste factor in de reproduceerbaarheid van ex vivo leverperfusie is de kwaliteit van de chirurgie. Daarom hebben we een georganiseerde en gestroomlijnde methode geïntroduceerd om ex vivo leverperfusies van muizen uit te voeren in de context van in situ NMR-experimenten . We beschrijven ook een unieke toepassing en bespreken veelvoorkomende problemen die in deze onderzoeken worden aangetroffen. Het algemene doel is om een ongecompliceerde gids te bieden voor een techniek die we in de loop van meerdere jaren hebben verfijnd en die we beschouwen als de gouden standaard voor het verkrijgen van reproduceerbare resultaten in hepatische resecties en perfusies in de context van in situ NMR-experimenten. De afstand tot het midden van het veld voor de magneet en de ontoegankelijkheid van het weefsel voor interventie tijdens het NMR-experiment maakt onze methoden nieuw.

De leverfunctie wordt voornamelijk beoordeeld aan de hand van het zuurstofverbruik en de stroomsnelheid. Een debiet van 4-8 ml/min en zuurstofverbruik van 1 μmol/min.g is typisch. Deze maatregelen zullen variëren afhankelijk van specifieke experimentele omstandigheden en biologische verschillen.
De exacte hoeveelheid isofluraan die wordt gebruikt, is afhankelijk van het type anesthesiesysteem dat wordt gebruikt, evenals de omgeving en leeftijd / gewicht van de muis. Tijdens de operatie verande...

Het protocol beschrijft een eenvoudige methode voor het resectie van een intacte muizenlever voor metabolische studies door middel van poortaderperfusie.

Ex Vivo Leverperfusie door de poortader in muis

Metabolic diseases such as diabetes, pre-diabetes, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), and nonalcoholic steatohepatitis (NASH) are becoming ...

Deze video demonstreert een gestroomlijnde procedure die is ontwikkeld om metabole leverstudies uit te voeren met voldoende nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid, die als leidraad kan dienen voor het uitvoeren van leverresectie voor de vivo perfusiestudies. De techniek kan het beste worden toegepast op real-time metabolisme om de functie te detecteren, in omzetmetabolieten in ziektemodellen. Perfusie maakt nauwkeurige controle van voedingsstoffen en hormonen beschikbaar voor de lever mogelijk.Hoewel de techniek niet gericht is op therapie, kunnen leverperfusies een belangrijke rol spelen bij het begrijpen van de etiologie en impact van ziekten, zoals diabetes, NAFLD en NASH op het levermetabolisme. Naarmate nieuwe geneesmiddelen worden ontwikkeld, worden methoden voor het beoordelen van het centrale energiemetabolisme van de lever essentieel. Deze methode kan worden gebruikt met modellen van verschillende ziekten, waaronder kankers en in verschillende stadia van ziekteprogressie.Plaats om te beginnen de neus van de muis in een neuskegel na de inductie van anesthesie en plak de poten af. Dien lidocaïne toe via een subcutane injectie bilateraal in het voorste iliacale kamgebied. Voer

ex-vivo-hepatic-perfusion-through-the-portal-vein-in-mouse

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

This video describes a procedure for mouse liver perfusion through the portal vein using collagenase solution prior to isolating liver cells.

In Vivo Murine Liver Perfusion: A Method to Infuse the Rodent Liver with Solution via the Portal Vein

Levermacrofagen, Kupffer-cellen genoemd, zijn verantwoordelijk voor het opvangen van circulerende nanodeeltjes. We beschrijven hier een methode, met hoge celzuiverheid en opbrengst, voor het isoleren van Kupffer-cellen. De gemodificeerde LDH-test wordt hier gebruikt om de toxiciteit veroorzaakt door koolstofnanoboortjes in Kupffer-cellen te meten.

Kupffer Cell Isolatie Nanoparticle toxiciteit testen

Het doel van dit protocol is te verkrijgen van hoge levensvatbaarheid en hoog rendement van hepatocyten en sinusoïdale endotheliale cellen van lever. Dit wordt bereikt door zoogdierlevercellen de lever met een type IV collagenase oplossing via de portal ader, gevolgd door differentiële centrifugeren hepatocyten en sinusoïdale endotheliale cellen te verkrijgen.

Zuivering van hepatocyten en sinusvormige endotheliale cellen van lever muis perfusie

Er is een belangrijke donor van lever tekort, en criteria voor lever donoren hebben uitgebreid. Normothermic ex vivo lever perfusie (NEVLP) is ontwikkeld om te evalueren en wijzigen van orgaanfunctie. Deze studie toont een model van de rat van NEVLP en test het vermogen van gepegyleerde-katalase, te verzachten lever behoud letsel.

Een kleine diermodel van Ex Vivo Normothermic lever perfusie

Een protocol wordt beschreven voor in situ perfusie van het onderlichaam van de muis, met inbegrip van de blaas, de prostaat, geslachtsorganen, bot, spier en voethuid.

Oprichting van In Situ Closed Circuit Perfusie van onderbuikorganen en achterpoten bij muizen

Vetzuur β-oxidatie is een essentiële metabole route die verantwoordelijk is voor het genereren van energie in veel verschillende celtypen, waaronder hepatocyten. Hier beschrijven we een methode om vetzuur β-oxidatie te meten in vers geïsoleerde primaire hepatocyten met behulp van 14C-gelabeld palmitinezuur.

Meting van vetzuur β-oxidatie in een suspensie van vers geïsoleerde muizenhepatocyten

Het huidige protocol optimaliseert de lever in situ perfusie / decellularisatie en twee-foton microscopie methoden om een betrouwbaar platform te creëren om de dynamiek van extracellulaire matrix (ECM) remodellering tijdens niet-alcoholische steatohepatitis (NASH) te visualiseren.

3D-beeldvorming van de extracellulaire levermatrix in een muismodel van niet-alcoholische steatohepatitis

Met lipiden beladen hepatocyten zijn inherent aan leverregeneratie, maar gaan meestal verloren bij centrifugatie van dichtheidsgradiënt. Hier presenteren we een geoptimaliseerd celisolatieprotocol dat steatotische hepatocyten behoudt, wat representatieve populaties van regenererende hepatocyten oplevert na gedeeltelijke hepatectomie bij muizen.

Isolatie van regenererende hepatocyten na gedeeltelijke hepatectomie bij muizen

Een normotherm ex vivo leverperfusie (NEVLP) systeem werd gecreëerd voor muizenlevers. Dit systeem vereist ervaring in microchirurgie, maar zorgt voor reproduceerbare perfusieresultaten. Het vermogen om muizenlevers te gebruiken vergemakkelijkt het onderzoek van moleculaire routes om nieuwe perfusaatadditieven te identificeren en maakt de uitvoering van experimenten gericht op orgaanherstel mogelijk.

Normothermic Ex Vivo Lever Machine Perfusie in Muis

Hier presenteren we een robuuste methode voor in situ perfusie van de muizenlever om de acute en directe regulatie van het levermetabolisme te bestuderen zonder de leverarchitectuur te verstoren, maar in afwezigheid van extra-hepatische factoren.

Glucoseproductie in de lever, ureagenese en lipolyse gekwantificeerd met behulp van het geperfuseerde levermodel van muizen

Hier beschrijven we een platform dat niet-invasieve in vivo beeldvorming mogelijk maakt van leversferoïden die zijn geënt in de voorste oogkamer van het oog van de muis. De workflow strekt zich uit van het genereren van sferoïden van primaire levercellen tot transplantatie in het oog van de muis en in vivo beeldvorming met cellulaire resolutie door confocale microscopie.

In vivo beeldvorming van leversferoïden geënt in de voorste oogkamer van het muizenoog

Leer een gestroomlijnde leverperfusietechniek via de poortader in muizen voor metabole studies. Deze methode biedt rigoureuze controle over voedingsstoffen en hormonen bij ziekteonderzoek.

Ex Vivo Leverperfusie door de poortader in muis

Meer video's verkennen