Name: Detectie van Plasmodium Sporozoïeten bij Anopheles-muggen met behulp van een enzymgekoppelde immunosorbenttest (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Leer een ELISA-protocol voor de detectie van Plasmodium sporozoïeten in Anopheles-muggen. Deze methode biedt hoge gevoeligheid en specificiteit voor malariatransmissieonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken de heer Kirakorn Kiatibutr, MVRU, voor de training en begeleiding. We danken ook mevrouw Pinyapat Kongngen, MVRU, voor haar technische assistentie bij het opstellen van figuur 2. Dit werk werd ondersteund door een subsidie van het National Institute for Allergy and Infectious Diseases en het National Institute of Health (U19 AI089672).

1. Bereiding van reagentia
OPMERKING: Raadpleeg de Tabel met materialen voor een lijst van apparatuur, reagentia en andere verbruiksartikelen die in dit protocol worden gebruikt en naar Tabel 1 voor een lijst met oplossingen en hun samenstelling.
<ol><li>Vangst en peroxidase-geconjugeerde mAbs<ol><li>Om de mAb te reconstitueren, resuspendeert u de gevriesdroogde mAb in een 1:1 mengsel van gedestilleerd water:glycerol bij 0,5 mg/ml. Maak zo nodig aliquots om herhaaldelijk vries- en dooien te voorkomen en bewaar ze bij -20 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Blokkerende buffer (BB)<ol><li>Bereid de blokkeerbuffer voor door 5 g caseïne van ELISA-kwaliteit op te lossen in 100 ml 0,1 N NaOH. Voeg 900 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe (zie tabel 1) om het uiteindelijke volume op 1,0 l te brengen.</li>
		<li>Voeg 0,02 g fenolrood toe als indicator en pas de pH aan naar 7,4 met HCl. Bewaar BB maximaal een week bij 4 °C, of aliquot in 50 ml voor langdurige opslag bij -20 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Positieve controles<ol><li>Om de positieve controles te reconstrueren, rehydrateert u de gevriesdroogde eiwitten door 1.000 μL BB toe te voegen. Maak naar behoefte aliquots van de positieve controleoplossingen en bewaar deze bij -20 °C.</li>
		<li>Voor seriële verdunning wordt elke positieve controlegroep verder verdund tot de uiteindelijke werkconcentratie in BB als volgt: Pf, 2 pg/μl; Pv (VK210), 182 (pg/μL); Pv (VK247), 89 pg/μL. OPMERKING: De exacte concentraties van de positieve controles kunnen van partij tot partij verschillen. Raadpleeg de productinformatiefiche voor de exacte benodigde concentratie. De concentraties positieve controles, uitgaande van de bovenstaande werkconcentratie, zijn 2, 1, 0,5, 0,25, 0,13, 0,06 pg/μL voor Pf; 182, 91, 46, 23, 11, 5,7 pg/μl voor PV210; en 89, 45, 22, 11, 5.6, 2.8 pg/μL PV247.</li>
	</ol></li>
	<li>Negatieve controles OPMERKING: De ideale negatieve controle is de kop-thoraxhomogenaat van vrouwelijke Anopheles-muggen die identiek zijn bereid als de testmonsters. BB kan echter ook worden gebruikt als negatieve controle.<ol><li>Met BB als negatieve controle gebruikt u de 2-voudige absorptiedrempel voor betrouwbare positieve uitlezingen.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Voorbereiding van muggenmonsters
<ol><li>Scheid het hoofd en de borstkas van elke verzamelde volwassen mug van de buik met een steriel scheermesje. Plaats de kop en de thorax in een vooraf gelabelde centrifugemaalbuis van 1.5 ml. Zwembadhoofden en thoraces van maximaal 10 muggen indien gewenst. OPMERKING: Voor de voorbereiding van het monster wordt meestal de speekselklier van een geïnfecteerde mug ontleed en onderworpen aan CS-ELISA. Het hoofd en de borstkas van verzamelde muggen kunnen echter ook worden gebruikt om CS-ELISA rechtstreeks uit te voeren (zonder speekselklieren te ontleden)12,13,19.</li>
	<li>Voeg 50 μL Grinding Buffer (GB) toe aan elke buis en homogeniseer het monster met een schone stamper (gewassen met zeep). Spoel de gebruikte stamper met 250 μL GB in de buis met de gehomogeniseerde mug(en) tot een eindvolume van ~300 μL.</li>
	<li>Bewaar het monster in een vriezer (-20 °C) tot gebruik of ga onmiddellijk verder met het uitvoeren van ELISA.</li>
</ol>3. Sporozoiet-ELISA
<ol><li>Vul het werkblad met sporozoiet-ELISA in (zie Aanvullend materiaal 1). Bereid één ELISA-plaat voor voor elke CSP (Pf, Pv-210 of Pv-247).</li>
	<li>Bereid de capture mAb-werkoplossing voor door het antilichaam op te lossen in PBS: 4 μg/ml Pf; 2 μg/ml Pv-210; 2 μg/ml Pv-247. Bereken de benodigde volumes op basis van de toevoeging van 5 ml per plaat. Draai de oplossing voorzichtig rond.</li>
	<li>Pipetteer 50 μl van elke werkende mAb-oplossing uit stap 3.2 in elk putje van de ELISA-plaat. Dek de plaat af met een plastic deksel en incubeer gedurende 30 minuten of een nacht bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Zuig de inhoud van het putje op en tik de plaat minstens 5 keer ondersteboven op keukenpapier om alle vloeistof te verwijderen. OPMERKING: Als er geen aspiratiesysteem (meerkanaals vacuümzuiging aangesloten op schone tips) beschikbaar is, gooi dan de antilichamen in de gootsteen en tik vervolgens met de plaat op keukenpapier.</li>
	<li>Voeg 200 μL BB toe om alle kuiltjes in de plaat te vullen. Dek de plaat af met een plastic deksel. Incubeer de plaat gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Zuig de inhoud van de put op of gooi deze weg. Tik 5 keer ondersteboven op keukenpapier om alle vloeistof te verwijderen.</li>
	<li>Laad het mughomogenaat en de controle op de plaat als volgt.<ol><li>Voeg 50 μl van de positieve controle toe aan de putjes H1 en H2.</li>
		<li>Voeg 50 μL BB toe aan de putjes in de kolommen 1 en 2 van rij C tot en met G. Voeg vervolgens 50 μl van de positieve controle toe aan de putjes G1 en G2. Maak een seriële verdunning van de positieve controle, beginnend bij G1 en G2, gevolgd door F1 en F2 tot C1 en C2. OPMERKING: Alle buisjes voor positieve controle moeten 50 μl bevatten.</li>
		<li>Voeg 50 μL BB (negatieve controle) toe aan de putjes A1, A2, B1 en B2.</li>
		<li>Voeg 50 μL van elk homogenaatmonster toe aan een onbekend (Unk) putje.</li>
		<li>Dek de plaat af en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.</li>
	</ol></li>
	<li>Begin na ongeveer 2 uur met het voorbereiden van de substraten. Voor de ABTS substraat 2-componenten kit meng je substraat A en substraat B in een verhouding van 1:1. OPMERKING: Voor een volledige plaat met 96 putjes is 5 ml substraat A en 5 ml substraat B nodig.</li>
	<li>Bereid de werkoplossingen van peroxidase-gelabelde mAbs voor Pf, Pv-210 en Pv-247 voor door BB toe te voegen aan het gereconstitueerde geconjugeerde mAb om een werkconcentratie van 1 μg/ml te verkrijgen.<ol><li>Bereken de benodigde volumes op basis van de toevoeging van 5 ml werkgeconjugeerde mAb-oplossing per plaat.</li>
		<li>Test de peroxidase-activiteit door 5 μl van de peroxidase-gelabelde mAb gemaakt in stap 3.8 te mengen met 100 μl van het substraat gemaakt in stap 3.7 in een aparte buis van 1,5 ml. Draai voorzichtig. OPMERKING: Er moet een snelle kleurverandering zijn van helder naar groen, wat aangeeft dat het peroxidase-enzym en de substraten werken.</li>
	</ol></li>
	<li>Zuig de inhoud van het putje op of gooi het weg en tik 5 keer met de plaat ondersteboven op keukenpapier om alle vloeistof te verwijderen.</li>
	<li>Was de putjes twee keer met 200 μL PBS-Tween, zuig de putinhoud op en tik elk 5 keer op de plaat.</li>
	<li>Voeg 50 μl peroxidase-gelabelde mAb gemaakt in stap 3.8 toe aan elk putje. Dek de plaat af en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker. Zuig de inhoud van het putje op of gooi het weg en tik 5 keer ondersteboven op keukenpapier op het bord.</li>
	<li>Was de putjes 3 keer met 200 μL PBS-Tween, zuig de inhoud van het putje op en tik elk 5 keer op de plaat.</li>
	<li>Voeg 100 μl van de in stap 3.7 bereide substraatoplossing toe aan elk putje. Dek de plaat af en incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker.</li>
	<li>Lees na 30 minuten de absorptie af bij 405-414 nm met behulp van een ELISA-plaatlezer. OPMERKING: Volg de specifieke instructies voor de gebruikte ELISA-plaatlezer. Voor meer informatie over de instructies voor de software die voor dit protocol wordt gebruikt, zie Aanvullend materiaal S2. Er moet een merkbare kleurverandering zijn van helder naar groen in de positieve controleputjes.</li>
</ol>4. Beoordeling
<ol><li>Detecteren van positieve monsters.<ol><li>Label monsters met extinctiewaarden boven de cut-off (tweemaal de gemiddelde extinctiewaarde van de negatieve monsters) als positief.</li>
	</ol></li>
	<li>Kwantificeren van CSP<ol><li>Schat de CSP-concentratie in het monster aan de hand van de standaardcurve die als volgt is samengesteld op basis van de controleverdunningsreeks.<ol><li>Maak de standaardcurve door de extinctiewaarden (y-as) van de serieel verdunde controles uit te zetten tegen hun concentraties (x-as).</li>
			<li>Voer lineaire regressie uit om de beste pasvorm te bepalen met behulp van y = A + Bx, waarbij A en B vrije parameters zijn.</li>
			<li>Bepaal de CSP-concentratie voor elk positief monster door de vergelijking voor een gegeven absorptiewaarde op te lossen.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Bray, R. S., Garnham, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+life-cycle+of+primate+malaria+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22British+Medical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">The life-cycle of primate malaria parasites.</a> British Medical Bulletin. 38 (2), 117-122 (1982).</li>
<li>Held, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primate+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Primate malaria.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 162 (1), 587-593 (1969).</li>
<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Division+of+Malaria+and+Other+Parasitic+Diseases.+Manual+on+practical+entomology+in+Malaria%2C+Part+I+and+Part+II%5BTitle%5D)+AND+%22World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Division of Malaria and Other Parasitic Diseases. Manual on practical entomology in Malaria, Part I and Part II.</a> World Health Organization. , Geneva. (1975).</li>
<li>Robert, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+distribution+of+circumsporozoite+antigen+in+Anopheles+gambiae+infected+with+Plasmodium+falciparum%2C+using+the+enzyme-linked+immunosorbent+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+Royal+Society+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Study of the distribution of circumsporozoite antigen in Anopheles gambiae infected with Plasmodium falciparum, using the enzyme-linked immunosorbent assay.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 82 (3), 389-391 (1988).</li>
<li>Fontenille, D., Meunier, J. Y., Nkondjio, C. A., Tchuinkam, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+circumsporozoite+protein+enzyme-linked+immunosorbent+assay+compared+with+microscopic+examination+of+salivary+glands+for+calculation+of+malaria+infectivity+rates+in+mosquitoes+%28Diptera%3A+Culicidae%29+from+Cameroon%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Use of circumsporozoite protein enzyme-linked immunosorbent assay compared with microscopic examination of salivary glands for calculation of malaria infectivity rates in mosquitoes (Diptera: Culicidae) from Cameroon.</a> Journal of Medical Entomology. 38 (3), 451-454 (2001).</li>
<li>Echeverry, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+robust+single+PCR+for+Plasmodium+sporozoite+detection+in+mosquitoes+using+the+cytochrome+oxidase+I+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">Fast and robust single PCR for Plasmodium sporozoite detection in mosquitoes using the cytochrome oxidase I gene.</a> Malaria Journal. 16 (1), 230(2017).</li>
<li>Singh, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genus-+and+species-specific+nested+polymerase+chain+reaction+malaria+detection+assay+for+epidemiologic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">A genus- and species-specific nested polymerase chain reaction malaria detection assay for epidemiologic studies.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 60 (4), 687-692 (1999).</li>
<li>Snounou, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotyping+of+Plasmodium+spp.+Nested+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genotyping of Plasmodium spp. Nested PCR.</a> Methods in Molecular Medicine. 72, 103-116 (2002).</li>
<li>Snounou, G., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nested+PCR+analysis+of+Plasmodium+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nested PCR analysis of Plasmodium parasites.</a> Methods in Molecular Medicine. 72, 189-203 (2002).</li>
<li>Snounou, G., Viriyakosol, S., Jarra, W., Thaithong, S., Brown, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+four+human+malaria+parasite+species+in+field+samples+by+the+polymerase+chain+reaction+and+detection+of+a+high+prevalence+of+mixed+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Identification of the four human malaria parasite species in field samples by the polymerase chain reaction and detection of a high prevalence of mixed infections.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 58 (2), 283-292 (1993).</li>
<li>Wirtz, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Plasmodium+vivax+sporozoites+in+mosquitoes+using+an+enzyme-linked+immunosorbent+assay%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Identification of Plasmodium vivax sporozoites in mosquitoes using an enzyme-linked immunosorbent assay.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 34 (6), 1048-1054 (1985).</li>
<li>Wirtz, R. A., Burkot, T. R., Graves, P. M., Andre, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field+evaluation+of+enzyme-linked+immunosorbent+assays+for+Plasmodium+falciparum+and+Plasmodium+vivax+sporozoites+in+mosquitoes+%28Diptera%3A+Culicidae%29+from+Papua+New+Guinea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Field evaluation of enzyme-linked immunosorbent assays for Plasmodium falciparum and Plasmodium vivax sporozoites in mosquitoes (Diptera: Culicidae) from Papua New Guinea.</a> Journal of Medical Entomology. 24 (4), 433-437 (1987).</li>
<li>Wirtz, R. A., Sattabongkot, J., Hall, T., Burkot, T. R., Rosenberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+an+enzyme-linked+immunosorbent+assay+for+Plasmodium+vivax-VK247+sporozoites%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of an enzyme-linked immunosorbent assay for Plasmodium vivax-VK247 sporozoites.</a> Journal of Medical Entomology. 29 (5), 854-857 (1992).</li>
<li>Burkot, T. R., Williams, J. L., Schneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Plasmodium+falciparum-infected+mosquitoes+by+a+double+antibody+enzyme-linked+immunosorbent+assay%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Identification of Plasmodium falciparum-infected mosquitoes by a double antibody enzyme-linked immunosorbent assay.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 33 (5), 783-788 (1984).</li>
<li>Rosenberg, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circumsporozoite+protein+heterogeneity+in+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+vivax%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Circumsporozoite protein heterogeneity in the human malaria parasite Plasmodium vivax.</a> Science. 245 (4921), 973-976 (1989).</li>
<li>Marie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+real-time+quantitative+PCR+to+measure+the+wild+Plasmodium+falciparum+infectivity+rate+in+salivary+glands+of+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a real-time quantitative PCR to measure the wild Plasmodium falciparum infectivity rate in salivary glands of Anopheles gambiae.</a> Malaria Journal. 12, 224(2013).</li>
<li>Arevalo-Herrera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoreactivity+of+sera+from+low+to+moderate+malaria-eEndemic+areas+against+Plasmodium+vivax+rPvs48%2F45+proteins+produced+in+Escherichia+coli+and+chinese+hamster+ovary+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunoreactivity of sera from low to moderate malaria-eEndemic areas against Plasmodium vivax rPvs48/45 proteins produced in Escherichia coli and chinese hamster ovary systems.</a> Frontiers in Immunology. 12, 634738(2021).</li>
<li>Balkew, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update+on+the+distribution%2C+bionomics%2C+and+insecticide+susceptibility+of+Anopheles+stephensi+in+Ethiopia%2C+2018-2020%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">An update on the distribution, bionomics, and insecticide susceptibility of Anopheles stephensi in Ethiopia, 2018-2020.</a> Malaria Journal. 20 (1), 263(2021).</li>
<li>Wirtz, R. A., Avery, M., Benedict, M., Sutcliffe, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+sporozoite+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Anopheles+Research%22%5BJournal%5D)">Plasmodium sporozoite ELISA.</a> Methods in Anopheles Research. , 333-343 (2016).</li>
<li>Durnez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((False+positive+circumsporozoite+protein+ELISA%3A+a+challenge+for+the+estimation+of+the+entomological+inoculation+rate+of+malaria+and+for+vector+incrimination%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">False positive circumsporozoite protein ELISA: a challenge for the estimation of the entomological inoculation rate of malaria and for vector incrimination.</a> Malaria Journal. 10, 195(2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

De CSP-ELISA biedt een zeer specifieke en kosteneffectieve methode om Plasmodium CSP te detecteren. Het maakt onderscheid mogelijk tussen P. falciparum en P. vivax sporozoïtes en tussen de twee subtypes, VK210 en VK247, van P vivax11,13,14,15. Bepaalde kritieke punten moeten in overweging worden genomen om betrouwbare en reproduceerbare resultaten te verkrijg...

Plasmodium sporozoïeten zijn het infectieuze stadium van de malariaparasieten in de muggen. De sporozoïeten worden via muggenbeten bij de mens afgeleverd. Bij de mug vormen de sporozoïeten zich eerst in de oöcysten op de middendarmwand. Eenmaal klaar, worden ze vrijgelaten in de hemocoel en reizen ze naar de speekselklieren van muggen. Daar rijpen ze en worden ze klaar voor overdracht op mensen tijdens bloedvoeding. Bij mensen worden de sporozoïeten afgezet in de dermis. Vervolgens komen ze het bloedvat binnen en reizen ze langs de bloedcirculatie om de lever te bereiken om een infectie in de hepatocyten vast te stellen 1,2.
Er zijn drie verschillende methoden gebruikt om sporozoietinfectie van de speekselklieren van muggen vast te stellen. De eerste methode is de dissectie van de speekselklieren, gevolgd door direct onderzoek van sporozoïeten onder een lichtmicroscoop. Deze methode is de gouden standaard voor het detecteren en kwantificeren van sporozoïeten in de speekselklieren van Anopheles-muggen 3. Het vereist echter een technicus die goed is opgeleid in zowel dissectie als microscopisch onderzoek. Bovendien kan het niet worden gebruikt om Plasmodium-soorten en CSP-subtypering (voor P. vivax) te bepalen4,5. De tweede methode maakt gebruik van polymerasekettingreactie (PCR) om Plasmodium-DNA in het bovenste deel van het muggenlichaam te detecteren6. Gezien de specificiteit van PCR zijn zowel soorten als subtypering van de parasiet mogelijk 7,8,9,10. Hoewel PCR steeds vaker wordt gebruikt, vereist het relatief dure apparatuur en goed opgeleid personeel. De laatste methode, de ELISA om het Plasmodium-specifieke circumsporozoiet-eiwit (CSP) te detecteren, is al drie decennia de steunpilaar 11,12,13. CSP is aanwezig in zowel oöcystsporozoïeten als speekselkliersporozoïeten 12,14. Met behulp van specifieke antilichamen maakt deze methode het mogelijk om Plasmodium-soorten te identificeren en CSP-subtypering van P. vivax sporozoïeten te bepalen. De grondgedachte voor deze test is de vereiste van een eenvoudige high-throughput assay om een groot aantal wilde muggen te onderzoeken om de overdracht van malaria te begrijpen (d.w.z. het sporozoietinfectiepercentage te bepalen).
De ELISA-methode heeft twee belangrijke voordelen ten opzichte van microscopisch onderzoek. Ten eerste kunnen onderzoekers muggenmonsters bewaren totdat ze klaar zijn voor monsterverwerking. Ten tweede kan de ELISA-methode worden gebruikt om Plasmodium-soorten te differentiëren door middel van soortspecifieke monoklonale antilichamen. Bovendien kan ELISA een groter aantal muggen herbergen, waardoor een veel hogere doorvoer mogelijkis 15. Vergeleken met PCR, dat sporozoiet-DNA detecteert, kost de ELISA-procedure meer tijd, maar minder16. De hier beschreven ELISA-test is ontwikkeld om de infectiviteit van muggen te bepalen en CSP van P. falciparum en elk van de twee CSP-varianten van P. vivax, VK210 en VK247, afzonderlijk te detecteren. Deze ELISA-methode is in veel onderzoeken gebruikt om de seizoensgebonden dynamiek van muggeninfectie te bepalen en de soorten van de belangrijkste malariavectoren in het veld te identificeren 12,13,17,18. Om deze test uit te voeren, volstaat een standaard laboratorium dat is uitgerust met een ELISA-plaatlezer.
De algemene aanpak is samengevat in figuur 1. In deze sandwich ELISA wordt het primaire (capture) monoklonale antilichaam (mAb) dat specifiek is voor elke Plasmodium-soort /subtype eerst gebruikt om de ELISA-plaat te coaten. Elke plaat is gecoat met een enkele capture mAb. De functie van de mAb is om het overeenkomstige CSP-antigeen in de muggenhomogenaten op te vangen. Na het afvangen van antigeen en het wassen van platen, wordt een tweede CSP-specifiek antilichaam gelabeld met peroxidase gebruikt om de aanwezigheid van CSP gebonden aan de vangst-mAb te detecteren. De chemische reactie die door peroxidase wordt gekatalyseerd, resulteert in kleurontwikkeling in putten die positief zijn voor CSP.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ELISA plate reader</td><td>BioTek Instrument, Inc.</td><td>Synergy H1</td><td>Absorbance wordt gemeten met behulp van de UV-VIS absorptiedetectiemodus</td></tr><tr><td>Grinder stamper</td><td>Axygen</td><td>PES-15-B-SI</td><td>Voor het homogeniseren van het kop/thoraxgedeelte van de mug</td></tr><tr><td>Reagentia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ABTS substraat 2-component</td><td>KPL</td><td>50-62-00</td><td>Voor door peroxidase aangedreven detectie</td></tr><tr><td>Blocking buffer (BB)</td><td></td><td></td><td>Opmerking: oplossing</td></tr><tr><td>Capture- en peroxidase-geconjugeerde monoklonale antilichamen (mAbs)</td><td></td><td></td><td>Opmerking: mAbs kunnen worden verkregen in de gelyofiliseerd vorm als onderdeel van de Sporozoite ELISA Reagent Kits (MRA-890 voor P. falciparum en MRA-1028K voor P. vivax) van BEI Resources (https://www.beiresources.org.)</td></tr><tr><td>Caseïne</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9000-71-9</td><td>Voor de bereiding van blocking buffer</td></tr><tr><td>Grinding buffer (GB)</td><td></td><td></td><td>Opmerking: oplossing</td></tr><tr><td>Igepal CA-630</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td>Voor de bereiding van grinding buffer</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7447-40-7</td><td>Voor de bereiding van fosfaatbufferzoutoplossing</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7778-77-0</td><td>Voor de bereiding van fosfaatbufferzoutoplossing</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7558-79-4</td><td>Voor de bereiding van fosfaatbufferzoutoplossing</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td>Voor de bereiding van fosfaatbufferzoutoplossing</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1310-73-2</td><td>Voor de bereiding van blocking buffer</td></tr><tr><td>PBS-Tween</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pf capture mAb</td><td>CDC</td><td>Pf-CAP</td><td>Voor het vastleggen van Pf circumsporozoïet eiwit</td></tr><tr><td>Pf peroxidase mAb</td><td>CDC</td><td>Pf-HRP</td><td>Voor het detecteren van Pf circumsporozoïet eiwit</td></tr><tr><td>Pf positieve controle</td><td>CDC</td><td>Pf-PC</td><td>Pf positieve controle</td></tr><tr><td>Fenol rood</td><td>Sigma Aldrich</td><td>143-74-8</td><td>Voor de bereiding van blocking buffer</td></tr><tr><td>Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)</td><td></td><td></td><td>Opmerking: oplossing</td></tr><tr><td>Positieve controles</td><td></td><td></td><td>Opmerking: oplossing</td></tr><tr><td>Pv210 capture mAb</td><td>CDC</td><td>Pv210-CAP</td><td>Voor het vastleggen van Pv210 circumsporozoïet eiwit</td></tr><tr><td>Pv210 peroxidase mAb</td><td>CDC</td><td>Pv210-HRP</td><td>Voor het detecteren van Pv210 circumsporozoïet eiwit</td></tr><tr><td>Pv210 positieve controle</td><td>CDC</td><td>Pv210-PC</td><td>Pv210 positieve controle</td></tr><tr><td>Pv247 capture mAb</td><td>CDC</td><td>Pv247-CAP</td><td>Voor het vastleggen van Pv247 circumsporozoïet eiwit</td></tr><tr><td>Pv247 peroxidase mAb</td><td>CDC</td><td>Pv247-HRP</td><td>Voor het detecteren van Pv247 circumsporozoïet eiwit</td></tr><tr><td>Pv247 positieve controle</td><td>CDC</td><td>Pv247-PC</td><td>Pv247 positieve controle</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9005-64-5</td><td>Voor de bereiding van PBS-Tween</td></tr><tr><td>Consumables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Weggeef pipetten reservoirs</td><td>Generic</td><td></td><td>Voor werkreagentia</td></tr><tr><td>ELISA platen: 96 wel duidelijke ronde bodem PVS</td><td>Corning Life Science</td><td>2797</td><td>Voor ELISA</td></tr><tr><td>Handschoenen: wegwerp handschoenen en vrieshandschoenen</td><td>Generic</td><td></td><td>Voor persoonlijke bescherming</td></tr><tr><td>Labjas</td><td>Generic</td><td></td><td>Voor persoonlijke bescherming</td></tr><tr><td>Multikanaals Pipet P30-300</td><td>Generic</td><td></td><td>Voor overdracht van oplossing</td></tr><tr><td>Pipetset, P2, P20, P200 en P1000</td><td>Generic</td><td></td><td>Voor overdracht van oplossing</td></tr><tr><td>Pipettips 10 &micro;L, 200 &micro;L en 1000 &micro;L</td><td>Generic</td><td></td><td>Voor overdracht van oplossing</td></tr><tr><td>Serologische pipetten 5 mL, 10 mL</td><td>Generic</td><td></td><td>Voor overdracht van oplossing</td></tr><tr><td>Transfer pipetten</td><td>Generic</td><td></td><td>Voor overdracht van oplossing</td></tr></tbody></table>

detectie van plasmodium sporozoïeten bij anopheles-muggen met behulp van een enzymgekoppelde immunosorbenttest

Detection of Plasmodium Sporozoites in Anopheles Mosquitoes using an Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Plasmodium sporozoïeten zijn het infectieuze stadium van malariaparasieten die mensen infecteren. De sporozoïeten die zich in de speekselklieren van vrouwelijke Anopheles-muggen bevinden, worden via muggenbeten tijdens de bloedvoeding op mensen overgedragen. De aanwezigheid van sporozoïeten in de speekselklieren van muggen bepaalt dus de besmettelijkheid van muggen. Om te bepalen of een Anopheles-mug Plasmodium sporozoïeten bij zich draagt, is de enzymgekoppelde immunosorbenttest (ELISA) -methode het standaardhulpmiddel geweest om het Plasmodium circumsporozoiet-eiwit (CSP), het belangrijkste oppervlakte-eiwit van de sporozoïeten, te detecteren. Bij deze methode wordt het hoofd samen met de thorax van elke mug gescheiden van de buik, gehomogeniseerd en onderworpen aan een sandwich-ELISA om de aanwezigheid van CSP te detecteren die specifiek is voor Plasmodium falciparum en elk van de twee subtypen, VK210 en VK247, van Plasmodium vivax. Deze methode is gebruikt om de overdracht van malaria te bestuderen, inclusief de seizoensgebonden dynamiek van muggeninfectie en de soorten van de belangrijkste malariavectoren op de onderzoekslocaties.

Representatieve ELISA-resultaten zijn weergegeven in figuur 2. In dit experiment detecteerde de P. falciparum ELISA sporozoietinfectie in put A7. De positieve put kon visueel worden gedetecteerd door zijn vage groene kleur (Figuur 2A). De extinctiewaarde van deze put lag boven de cut-off drempel (tweemaal de gemiddelde waarde van de vier negatieve controleputjes) (Figuur 2B). De verdeling van de absorptiewaarden van alle 80...

Dit protocol beschrijft een sandwich-enzymgekoppelde immunosorbenttest om speekselkliersporozoïeten bij muggen te detecteren. Met behulp van gemakkelijk verkrijgbare monoklonale antilichamen maakt de methode kosteneffectieve detectie met hoge doorvoer mogelijk van muggen die Plasmodium falciparum of Plasmodium vivax dragen. De methode is geschikt voor onderzoek naar de overdracht van malaria, inclusief vectoronderzoeken.

Detectie van Plasmodium Sporozoïeten bij Anopheles-muggen met behulp van een enzymgekoppelde immunosorbenttest

Plasmodium sporozoites are the infective stage of malaria parasites that infect humans. The sporozoites residing in the salivary glands of female ...

De ELISA-techniek is erg nuttig voor het detecteren van malariaparasiet in de muggenvector met hoge gevoeligheid en specificiteit, en in staat om tegelijkertijd veel monsters te verwerken. Deze techniek stelt onderzoekers in staat om muggenmonsters te bewaren totdat ze klaar zijn voor monsterverwerking, en het kan worden uitgevoerd om Plasmodium-soorten te differentiëren met behulp van soortspecifieke monoklonale antilichamen. Bereid het monster voor door het hoofd en de borstkas van de muggen van de buik te scheiden en plaats ze in een vooraf geëtiketteerde centrifugemaalbuis van 1,5 milliliter.Voeg 50 microliter maalbuffer toe aan elke buis en homogeniseer het monster met een stamper. Spoel de stamper af met 250 microliter maalbuffer en voeg de oplossing toe aan de buis om het uiteindelijke volume op 300 microliter te brengen. Bereid een ELISA-plaat voor op circumsporozoiet-eiwit en vul het sporozoiet-ELISA-werkblad in.Bereid de antilichaamoplossing in PBS voor en voeg vijf milliliter van de oplossing per plaat toe. Pipetteer 50 microliter van de antilichaamoplossing in elk putje van de ELISA-plaat. Plaats een deksel op het bord en broed 30 minuten of een nacht op kamertemperatuur.Zuig de oplossing in het putje op en tik vijf keer met het bord op keukenpapier om de vloeistof te verwijderen. Voeg 200 microliter blokkeerbuffer toe aan de putplaten en dek af met een deksel. Incubeer gedurende een uur bij kamertemperatuur en zuig de inhoud van de put op.Tik opnieuw met het bord op keukenpapier om de vloeistof te verwijderen. Voeg 50 microliter positieve controle toe aan de putjes H één en H twee. Voeg vervolgens 50 microliter blokkeerbuffer toe aan de putjes in de kolommen één en twee van de rijen C tot en met G. Voeg 50 microliter van de positieve controle toe aan de putjes G één en G twee.Verdun de positieve controle serieel, beginnend bij G één en G twee, gevolgd door F één en F twee tot C één en C twee. Voeg 50 microliter van de negatieve controle toe aan putten A één, A twee, B één en B twee. Extraheer 50 microliter van de homogenaatoplossing en voeg deze toe aan een onbekend putje.Dek de plaat af en broed deze twee uur op kamertemperatuur uit. Bereid de substraatoplossing voor door substraat A en B te mengen in een verhouding van één op één. Bepaal het vereiste volume op basis van het toevoegen van vijf milliliter werkende geconjugeerde antilichaamoplossing aan elke plaat.Evalueer de peroxidase-activiteit door vijf microliter van de met peroxidase gelabelde antilichaamoplossing toe te voegen aan 100 microliter van de substraatoplossing in een buis van 1.5 milliliter. Zuig de inhoud van het putje op en verwijder de vloeistof door de plaat ondersteboven op keukenpapier te leggen. Was de putjes twee keer met 200 microliter PBS Tween.Zuig de inhoud van het putje op en tik vijf keer op de plaat. Voeg 50 microliter peroxidase-gelabelde antilichaamoplossing toe aan elk putje. Broed vervolgens een uur in het donker op kamertemperatuur.Zuig de inhoud van het putje op en tik vijf keer met het bord op keukenpapier. Was de putjes drie keer met 200 microliter PBS Tween, zuig de inhoud op en tik vijf keer op de plaat. Voeg 100 microliter van de substraatoplossing toe aan elk putje.Dek de plaat af en broed 30 minuten in het donker op kamertemperatuur. Lees na de incubatie de absorptie af op 405 tot 414 nanometer met behulp van een ELISA-plaatlezer. Label de monsters met absorptie met een waarde boven de grenswaarde als positief en bepaal de CSP-concentratie in het monster met behulp van de standaard.Zet de absorptiewaarden af tegen de concentratie van de oplossing om een standaardcurve te genereren. Bepaal de beste pasvorm met behulp van de lineaire regressiemethode. Los de vergelijking van elke absorptiewaarde voor een positief monster op om de CSP-concentratie te bepalen.Na 30 minuten ELISA met ABTS te hebben uitgevoerd, kon sporozoietinfectie worden gedetecteerd door het verschijnen van een vage groene kleur in de put. De positieve controle vertoonde geen kleurverandering in het putje. De extinctiewaarden voor de negatieve en positieve putten werden bepaald.De positieve put vertoonde een absorptiewaarde die boven de afkapdrempel lag, terwijl de negatieve controles significant lagere waarden vertoonden. Verder werden ook de extinctiewaarden van de andere 80 onbekende putten verkregen. De ononderbroken lijn geeft de gemiddelde absorptie van de negatieve controleputten weer en de stippellijn geeft de positiviteitsdrempel weer.Met behulp van de standaardcurve werd de CSP-concentratie in put A zeven bepaald op 0,35 picogram per microliter Deze stap van ELISA-verwerking moet snel worden uitgevoerd om niet-specifieke vectoren te voorkomen. Bovendien moeten alle monsters en oplossing in de koelkast worden bewaard om microbiële groei te voorkomen. Onderzoekers wordt aanbevolen om de positieve detecties te bevestigen met andere methoden, zoals PCR.Dit zal het vertrouwen aanzienlijk verbeteren, vooral wanneer de enige meting boven de drempel wordt gewaardeerd. Deze techniek heeft onderzoekers in staat gesteld om op grotere schaal onderzoek te doen naar mogelijke infectie bij de muggen, wat belangrijk is voor het identificeren van de belangrijkste vector.

detection-plasmodium-sporozoites-anopheles-mosquitoes-using-an-enzyme

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Zodra een gen is geïdentificeerd als potentieel vuurvaste voor malaria, dient te worden geëvalueerd voor zijn rol in het voorkomen van Plasmodium besmettingen binnen de mug. Dit protocol illustreert hoe de mate van plasmodium infecties van muggen kunnen worden getest. De technieken voor de voorbereiding van de gametocyt cultuur, membraan voeden muggen menselijk bloed, en het testen van virale titers in de mug middendarm worden gedemonstreerd.

Protocol voor Plasmodium falciparum Infecties in Muggen en Infection Fenotype Bepaling

Een snelle en betaalbare manier om de kwaliteit malariaparasiet en vector-DNA extraheren uit mug exemplaren beschreven. Voortbouwend op chelerende eigenschappen van Chelex hars, maakt de eenvoudige methode genotypering van malariaparasieten in mug mid-darmkanaal en speekselklier fasen en moleculaire identificatie van...

Een eenvoudige Chelex protocol voor DNA-extractie van<em&gt; Anopheles</em&gt; Spp.

This video demonstrates an assay for immunizing a mouse model with live attenuated sporozoites. The radiation-attenuated Plasmodium sporozoites are injected into the dorsal side of the mouse's ear. After injections at multiple locations on both ears, the mouse is allowed to recover.

Intradermal Immunization with Live Attenuated Sporozoites in a Mouse Model

Muggen die malaria overdragen, hebben een aantal epidemiologisch belangrijke kenmerken die alleen kunnen worden gedetecteerd met behulp van moleculaire technieken. Door gebruik te maken van een MALDI-TOF-gebaseerde SNP-genotyperingsplatform, hebben we een test ontwikkeld voor het gelijktijdig detecteren van meerdere belangrijke eigenschappen (soorten, insecticideresistentie, parasietinfectie en gastheukeuze) van malariavectoren.

Een Multi-detectie test voor Malaria Zenden Muggen

We beschrijven hier een protocol voor het isoleren van myeloïde cellen uit muizenhuid en drainerende lymfknoop na intradermale injectie van Plasmodium sporozoïeten. Stroomcytometrie van de verzamelde cellen biedt een betrouwbare test om de ontstekingsreactie in de huid en de drainerende lymfknoop op de parasiet te karakteriseren.

Myeloïde Cell Isolatie van Mouse Skin en aftappen lymfkliertest Na Intradermal Immunisatie met levende verzwakte<em&gt; Plasmodium</em&gt; sporozoieten

We beschrijven een muismodel van experimentele cerebrale malaria en laten zien hoe inflammatoire en microvasculaire pathologie in vivo kunnen worden gevolgd met behulp van magnetische resonantie beeldvorming.

In vivo Tracking van Oedema Ontwikkeling En Microvasculaire Patologie In Een Model Van Experimentele Cerebrale Malaria Met Magnetic Resonance Imaging

Als gevolg van de opvallende gelijkenissen van de levenscyclus en de biologie van knaagdieren malariaparasieten voor menselijke malariaparasieten, knaagdieren malaria modellen zijn onmisbaar geworden voor malaria onderzoek. Hierin hebben we enkele van de belangrijkste technieken gestandaardiseerd die worden gebruikt in de fenotypische analyse van wild-type en transgene knaagdier malaria soorten.

Fenotypische analyse van knaagdieren malaria parasiet asexual en seksuele bloed stadia en muggen stadia

Huidige multiplexed diagnostiek te detecteren Zika, chikungunya, dengue virussen vereisen complexe monstervoorbereiding en dure instrumentatie en moeilijk te gebruiken in omgevingen met lage resource. Laten we een diagnose die gebruikmaakt van isotherme amplificatie met doelgroepen gerichte strand verschuifbare sondes op te sporen en deze virussen onderscheiden met hoge gevoeligheid en specificiteit.

Multiplexed isotherme amplificatie gebaseerd diagnostische Platform om te detecteren Zika, Chikungunya en Dengue 1

De standaard membraanvoedingstest (SMFA) wordt beschouwd als de gouden standaard voor de beoordeling en identificatie van potentiële antimalariaverbindingen. Dit kunstmatige voedingssysteem wordt gebruikt om muggen te infecteren om de effecten van dergelijke verbindingen op de intensiteit en prevalentie van de Plasmodium falciparum-parasiet verder te evalueren.

Standaard membraanvoedingstest voor de detectie van Plasmodium falciparum-infectie in Anopheles Mosquito Vectors

Bij Mycoplasma pneumoniae-infectie kunnen serologische tests goede resultaten opleveren, maar met een lage specificiteit vanwege immunologische kruisreactie. De in-house antigeenvangst ELISA, beschreven in dit artikel, garandeert een hoge soortspecificiteit en is een betrouwbare screeningstest gebleken voor een nauwkeurige diagnose van M. pneumoniae.

Antigeen-Capture Enzyme-Linked Immunosorbent Assay voor specifieke detectie van Mycoplasma pneumoniae

Malaria wordt overgedragen door inoculatie van het sporozoietstadium van Plasmodium door geïnfecteerde muggen. Transgeen Plasmodium heeft ons in staat gesteld de biologie van malaria beter te begrijpen en heeft rechtstreeks bijgedragen aan de ontwikkeling van malariavaccins. Hier beschrijven we een gestroomlijnde methodologie om transgene Plasmodium berghei sporozoïeten te genereren.

Genereren van genetisch gemodificeerde Plasmodium berghei Sporozoïeten

Leer een ELISA-protocol voor de detectie van Plasmodium sporozoïeten in Anopheles-muggen. Deze methode biedt hoge gevoeligheid en specificiteit voor malariatransmissieonderzoek.

Detectie van Plasmodium Sporozoïeten bij Anopheles-muggen met behulp van een enzymgekoppelde immunosorbenttest

Meer video's verkennen