Name: Ex Utero Kweek van muizenembryos van pregastrulatie tot geavanceerde organogenese (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Leer een betrouwbare methode voor ex utero-kweek van muizenembryo's tot zes dagen, van pregastrulatie tot geavanceerde organogenese. Dit protocol ondersteunt gedetailleerd onderzoek naar vroege ontwikkelingsprocessen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door Pascal en Ilana Mantoux; Europese Onderzoeksraad (ERC-CoG-2016 726497-Cellnaivety); Flight Attendant Medical Research Council (FAMRI); Israel Cancer Research Fund (ICRF) hoogleraarschap, BSF, Helen en Martin Kimmel Institute for Stem Cell Research, Helen en Martin Kimmel Award for Innovative Investigation; Israel Science Foundation (ISF), Minerva, het Sherman Institute for Medicinal Chemistry, Nella en Leon Benoziyo Center for Neurological Diseases, David and Fela Shapell Family Center for Genetic Disorders Research, Kekst Family Institute for Medical Genetics, Dr. Beth Rom-Rymer Stem Cell Research Fund, Edmond de Rothschild Foundations, Zantker Charitable Foundation, Estate of Zvia Zeroni.

Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de Animal Protection Guidelines van weizmann Institute of Science en goedgekeurd door het relevante Weizmann Institute IACUC (#01390120-1, 01330120-2, 33520117-2). Gezonde zwangere vrouwen werd gevraagd om hun geïnformeerde toestemming te geven om bloed uit hun navelstreng te verzamelen, zoals goedgekeurd door het Rambam Medical Center Helsinki Committee (#RMB-0452-15). Gezonde volwassenen werd gevraagd om hun geïnformeerde toestemming om bloed te laten verzamelen volgens de richtlijnen van het Weizmann Institute of Science Helsinki Committee (# 1566-3).
1. Mediavoorbereiding
<ol><li>Bereid het dissectiemedium met 500 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) zonder fenolrood en L-glutamine, aangevuld met 10% foetaal runderserum, 5 ml penicilline / streptomycine en filtersteriliseren met behulp van een filter van 0,22 μm. OPMERKING: Houd het dissectiemedium maximaal 1 maand op 4 °C.</li>
	<li>Bereid ex utero embryo kweekmedium (EUCM) elke dag vers in een biologische kap met behulp van 25% embryonaal medium plus 50% rattenserum en 25% humaan navelstrengbloedserum (HCS) of menselijk volwassen bloedserum (HBS).</li>
	<li>Om embryonaal medium te bereiden, voegt u 5 ml glutamine, 5 ml HEPES en 5 ml penicilline / streptomycine toe aan 500 ml DMEM zonder fenolrood en L-glutamine. Bereid 10-15 ml aliquots en bewaar ze bij 4 °C gedurende maximaal twee maanden. OPMERKING: Verdubbel de antibioticaconcentratie als u een besmetting ervaart.</li>
	<li>Inactiveer het rattenserum bij 56 °C gedurende 30-45 minuten en filtreer door een polyvinylideendifluoridefilter van 0,22 μm. Gebruik het serum voor kweek op dezelfde dag van inactivatie. Ontdooi HCS of HBS en gebruik het onmiddellijk voor experimenten. OPMERKING: Commercieel rattenserum geeft consistente resultaten (minimaal 4 partijen werden getest zonder duidelijke variatie). Als alternatief kan in eigen huis een hoogwaardig rattenserum worden verkregen, zoals eerder beschreven8,14. Als HCS niet beschikbaar is, vervang het dan door in eigen beheer ingezameld HBS. Rattenserum, HCS en HBS kunnen eenmaal worden ingevroren en op -20 °C worden bewaard voor gebruik op een andere dag. Ontdooi en combineer het opnieuw ingevroren serum met een groter volume vers ontdooide serum en vries het niet opnieuw in.</li>
</ol>2. Inzameling van menselijk navelstrengbloedserum en menselijk volwassen bloedserum
<ol><li>Om HCS te isoleren, verzamelt u navelstrengbloed van gezonde zwangere vrouwen op de dag van de geplande keizersnede.<ol>
<li>Klem de navelstreng dubbel op 5-7 cm van de navelstreng en transect tussen de klemmen onmiddellijk na de bevalling van het kind.</li>
		<li>Trek handmatig bloed af met behulp van een naald met een grote boring van 14 G en een spuit van 50 ml rechtstreeks uit de navelstrengader terwijl de placenta ter plaatse blijft om sporen van hemolyse te voorkomen. OPMERKING: Verzamel bloed nadat het kind uit het operatiegebied is verwijderd en navelstrengbloed is afgenomen voor klinische tests.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Doseer het verzamelde bloed tot 5 ml procoagulant steriele reageerbuizen en breng ze onmiddellijk over naar 4 °C gedurende 15 minuten om volledige coagulatie mogelijk te maken. Centrifugeer de gecoaguleerde reageerbuizen bij 2.500 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C.</li>
	<li>Gooi buisjes weg die tekenen van hemolyse vertonen (roze-rood serum). Verzamel het serum (geelkleur) met een pipet van 5 ml en filter het door een filter van 0,22 μm. Inactiveer het serum onmiddellijk in een waterbad van 56 °C gedurende 45 minuten.</li>
	<li>Bereid 1-1,5 ml aliquots van het geïnactiveerde serum en bewaar ze bij -80 °C gedurende maximaal zes maanden. Verzend indien nodig bij -70 °C met droogijs.</li>
	<li>Voor de afname van menselijk bloedserum voor volwassenen, bloed afnemen van gezonde volwassenen en onmiddellijk serum isoleren volgens hetzelfde protocol dat wordt beschreven voor navelstrengbloedserum. Bewaar het HBS als warmte-geïnactiveerde en gefilterde aliquots bij -80 °C gedurende maximaal zes maanden. OPMERKING: Humaan navelstrengserum en volwassen menselijk serum dat vers in eigen huis werd bereid, gaven superieure resultaten ten opzichte van in de handel verkrijgbaar serum. Verzamel HCS van gezonde vrouwen, ouder dan 18 jaar en jonger dan 40 jaar gepland voor een keizersnede. Sluit vrouwen uit die vaginaal zijn bevallen en vrouwen met een chronische ziekte of actieve medische aandoeningen, waaronder zwangerschapsdiabetes of hypertensie.</li>
</ol>3. Ex utero roller kweek van embryo's van E7.5 tot E11
<ol><li>Opzetten van de rollercultuur incubator en gasregelaar<ol>
<li>Kweek E7.5 of meer geavanceerde embryo's met behulp van het rollerkweekincubatorsysteem. Zet de rotator en de verwarmingseenheid gedurende ten minste 1 uur vóór de dissecties van het embryo bij 37 °C aan. Voeg geautoclaveerd water toe aan de gasinlaatfles en de uitlaattestbuis. OPMERKING: Plaats een thermometer naast de roterende trommel en controleer regelmatig de stabiliteit van de temperatuur in de incubator. Open de incubator zo snel mogelijk, omdat een langere openingstijd de temperatuur zal verhogen en de ontwikkeling van het embryo zal beïnvloeden. Voeg indien nodig meer geautoclaveerd water toe aan de gasinlaatfles en de uitlaattestbuis om ze tijdens het kweken tot een minimum van halve capaciteit te houden. Bescherm de embryo's in de incubator tegen licht door de incubator te bedekken met een doek.</li>
		<li>Schakel de gasregelaarmodule in door op de hoofdschakelaar te drukken en schakel vervolgens de zuurstof-/stikstof- en CO2-regelaars in (figuur 1A). Stel de zuurstof- en CO2-waarden in op 5% met behulp van de respectievelijke controllers. Open de gasregelaar en stel de gasdruk in op ~ 6,5-7 pond per vierkante inch (psi) door de spanningsschakelaar in de druktransmitter te verplaatsen (figuur 1B). Bevestig de gasdrukwaarde met behulp van een digitale manometer.</li>
		<li>Bewaak de gasstroom door de snelheid te controleren van de bellen die zijn gemaakt in de met water gevulde reageerbuis die is toegewezen in de precisie-incubator. Stel de juiste bellensnelheid in door de gasstroomklep op het deksel van de waterfles te sluiten/openen. Zorg ervoor dat de gasstroom de vorming van bellen mogelijk maakt met een snelheid van 2-4 bellen per seconde of stel de bellenstroom in op het eerste punt waar borrelen uitkomt op de met water gevulde uitlaatbuis.</li>
		<li>Vul de kweekflessen met 2 ml kweekmedium en sluit ze aan op de uitgeholde roterende trommel voor voorafgaande controle gedurende 1 uur. Gebruik de uitgeholde siliconen bungs om de flessen aan de trommel af te sluiten. Houd de lege ruimtes in de roterende trommel afgesloten met behulp van de massieve bungs. OPMERKING: De afwezigheid van bellen in de uitlaatbuis (er komt geen gas door het systeem) of een uitzonderlijk hoge gasstroom kan de ontwikkeling van het embryo beïnvloeden. In het geval van een gebrek aan bellenstroom naar de uitlaattestbuis, controleert u of alle siliconen bungs correct in de roterende trommel zijn geplaatst en het systeem afdichten, en controleert u of de waterfles goed is gesloten en alle slangen correct zijn aangesloten. Een gebrek aan bubbels die in de waterfles komen, kan wijzen op een storing in de gasregelaar.</li>
	</ol></li>
	<li>Dissectie van muizenembryo's van zwangere muizen<ol><li>Stel het dissectiemedium in een incubator vooraf in bij 37 °C en 5% CO2 gedurende minimaal 1 uur. Laat het deksel iets open om gasuitwisseling mogelijk te maken.</li>
		<li>Offer het zwangere vrouwtje op door cervicale dislocatie, reinig de buik van het vrouwtje met 70% ethanol en knip de huid en buikwand met een schaar. Lokaliseer het ene uiteinde van de baarmoeder en snijd op de kruising tussen de eierstok en de baarmoeder. Snijd vervolgens langs de baarmoeder tot het andere uiteinde en breng het over naar een petrischaaltje van 100 mm gevuld met dulbecco's fosfaatbuffered zoutoplossing (DPBS) op kamertemperatuur. OPMERKING: Het gebruik van niet-hormoongeprimeerde, natuurlijk gepaarde vrouwtjes wordt aanbevolen.</li>
		<li>Was de conceptussen snel in DPBS en snijd ze in paren om de behandeling van embryo's te vergemakkelijken. Verplaats alle paar conceptuses naar vooraf uitgebalanceerd dissectiemedium in een petrischaaltje van 60 mm en snijd ze in afzonderlijke conceptussen.</li>
		<li>Verwijder de baarmoederwand van de conceptuses door het baarmoederweefsel te scheuren met behulp van een grove tang. Gebruik een fijne microchirurgische tang om de punt van de peervormige decidua te snijden. Plaats de tang naast het embryo evenwijdig aan zijn lange as en open de tang om de decidua in tweeën te splitsen.</li>
		<li>Laat ten slotte de intacte ectoplacentale kegel aan de eicilinder vastzitten door het embryo uit de decidua te grijpen en de pariëtale dooierzak van het embryo af te pellen met een fijne tang. OPMERKING: Om te voorkomen dat het embryo wordt aangetast, voert u dissecties uit op een microscoop die is uitgerust met een verwarmingsplaat bij 37 °C binnen maximaal 30-40 minuten. Ontleed één nest embryo's tegelijk.</li>
		<li>Breng de embryo's onmiddellijk na de dissectie over op een nieuwe plaat gevuld met een gebalanceerd dissectiemedium met behulp van een glazen Pasteur-pipet om te voorkomen dat de embryo's aan het weefselafval blijven plakken.</li>
		<li>Selecteer die embryo's in het neurale plaat / vroege hoofdplooistadium die geen schade in de epiblast vertonen en breng 5-6 embryo's per fles over naar de vooraf uitgebalanceerde glazen kweekflessen. OPMERKING: Om de glazen Pasteur pipet te bereiden, snijdt u de opening van de pipet op een voldoende grootte om de embryo's te passen met behulp van een glassnijder en bewaart u deze in ethanol om besmetting te voorkomen. Was de glazen pipet met PBS voordat u embryo's terugbrengt. Wanneer u de embryo's overbrengt naar de kweekfles, moet u ervoor zorgen dat u zo min mogelijk volume van het dissectiemedium meeneemt om te voorkomen dat de EUCM verdunt.</li>
		<li>Plaats de flessen in het roterende kweeksysteem bij 37 °C, in een atmosfeer van 5% O2 en 5% CO2.</li>
		<li>Verwijder elke dag van de kweek de flessen één voor één uit de couveuse om de ontwikkeling van het embryo onder een stereomicroscoop te evalueren. Zorg ervoor dat u het lege gat in de trommel sluit met een stevige bung bij het verwijderen van een fles. Snijd de punt van een steriele plastic Pasteur-pipet op maat van het embryo en verplaats de embryo's naar een petrischaal om observatie te vergemakkelijken. Zorg ervoor dat de embryo's altijd bedekt zijn met medium. OPMERKING: Minimaliseer de tijd dat de embryo's zich buiten de couveuse bevinden om schadelijke effecten in de embryo's als gevolg van een afname van de lichaamstemperatuur te voorkomen. Behandel de embryo's zorgvuldig om scheuren van de bloedvaten van de dooierzak te voorkomen, wat de overleving van het embryo beïnvloedt.</li>
		<li>Breng op kweekdag 1 (equivalent aan E8.5) groepen van 3 embryo's over in een nieuwe fles met 2 ml verse en vooraf uitgebalanceerde EUCM met extra 3 mg / ml D-glucose en een gasmengsel van 13% O2, 5% CO2.</li>
		<li>Breng na 48 uur (equivalent aan E9,5) groepen van twee embryo's over in een nieuwe fles met vers voorverwarmde EUCM plus 3,5 mg/ml glucose in een gasatmosfeer van 18% O2 en 5% CO2.</li>
		<li>Verplaats bij 72 uur cultuur (equivalent aan E10,5) elk embryo naar een individuele fles met 1,5-2 ml vers medium aangevuld met 4 mg / ml glucose en een gastoevoer van 21% O2 en 5% CO2. OPMERKING: Embryo's bereiken hun maximale groei rond middernacht van kweekdag 4.</li>
		<li>Gebruik een fijne tang om de dooierzak en amnion te verwijderen en maak de navelstreng los voor een goede observatie van de embryomorfologie. Schakel de gasregelmodule en precisie-incubator uit. OPMERKING: Pre-inspecteur van het kweekmedium gedurende 1 uur door incubatie in een glazen fles in de rolkweek met een adequate gasatmosfeer volgens het embryostadium. Reinig de kweekflessen en alle incubatorglaswerk na elk gebruik door drie wasbeurten uit te voeren met stromend gedestilleerd water gevolgd door een nachtelijke wasbeurt ondergedompeld in 70% ethanol. Drie keer opnieuw wassen met stromend gedestilleerd water, de flessen een nacht laten drogen en steriliseren met een autoclaaf. Autoclaaf de siliconenpluggen ook regelmatig. Reinig alle dissectiegereedschappen grondig met 70% ethanol en steriliseer ze droog.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Uitgebreide embryokweek van E5.5/E6.5 tot E11
<ol><li>Kweek pregastrulatie (E5.5) en vroege gastrulatie (E6.5) embryo's tot het vroege somietstadium (E8.5) in statische platen.</li>
	<li>Stel het dissectiemedium gedurende 1 uur vooraf uit in een incubator met 5% CO2 bij 37 °C. OPMERKING: Om gasuitwisseling mogelijk te maken, sluit u het deksel van de buis niet volledig.</li>
	<li>Bereid de kweekplaten door aan elke put 250 μL vers bereide EUCM toe te voegen. Plaats de platen in een CO2-incubator bij 37 °C voor voorafgaande controle. OPMERKING: Hoewel 8-well platen zeer geschikt zijn voor embryogroei, kan kweek in elke andere plaat worden gedaan door het volume van het medium aan te passen aan de grootte van de plaat.</li>
	<li>Ontleed eicilinderembryo's uit de baarmoeder volgens de techniek beschreven voor E7.5. Verwijder de pariëtale dooierzak van het embryo en laat de intacte ectoplacentale kegel aan de eicilinder bevestigd.</li>
	<li>Breng individuele embryo's terug in elke put van de 8-putplaat met behulp van een micropipette en plaats de plaat in de couveuse met 5% CO2 bij 37 °C.</li>
	<li>Stel de embryo's onder een stereomicroscoop voor en selecteer voor kweek alleen die met een goed gevormde vruchtwaterholte, zonder duidelijke schade en zonder het membraan van de Reichert. OPMERKING: Gebruik 20 μL pipetpunten om E5.5 embryo's over te brengen en 200 μL tips om E6.5 embryo's terug te brengen. In het geval van culturen vanaf E6.5 kan HCS worden vervangen door vers verzameld HBS.</li>
	<li>Verwijder de helft van het medium en voeg na 24 uur kweek 250 μL vers bereide voorverwarmde EUCM toe, zodat de embryo's altijd in het kweekmedium worden ondergedompeld. In het geval van culturen vanaf E5,5, verwijdert u na twee dagen kweek (equivalent aan E7,5) 200 μL en voegt u 250 μL nieuwe EUCM toe. OPMERKING: Tijdens statische kweek kunnen embryo's zich aan de plaat hechten (voornamelijk bij gebruik van plastic platen), wat de ontwikkeling van het embryo ernstig in gevaar zal brengen. Hechting van het embryo aan de plaat komt vaker voor op de eerste dag van het kweken van E5.5-embryo's. Om aanhechting te voorkomen, duwt u de embryo's voorzichtig weg van het plaatoppervlak met behulp van een fijne, steriele tang. Controleer of alleen de ectoplacentale kegel aan het oppervlak van de plaat blijft kleven.</li>
	<li>Breng de embryo's in het vroege somietstadium over in de rolkweek (4-7 somites; na drie dagen kweek voor embryo's geëxplanteerd in E5,5 en twee dagen voor culturen begonnen bij E6,5), volgens dezelfde indicaties die eerder zijn beschreven voor embryo's in het E8,5-stadium. OPMERKING: Het overbrengen van de embryo's naar de rollercultuur in somietstadia die anders zijn dan hierboven aangegeven, resulteert in het falen van de verdere ontwikkeling. In tegenstelling tot E7.5 ex utero-culturen is het mogelijk om de embryo's in een constante atmosfeer van 21% zuurstof en 5% CO2 te houden, wat een iets hogere efficiëntie van embryo-ontwikkeling oplevert dan atmosferen met dynamische zuurstofconcentratie.</li>
</ol>

<ol><li>New, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-embryo+culture+and+the+study+of+mammalian+embryos+during+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Reviews+of+the+Cambridge+Philosophical+Society%22%5BJournal%5D)">Whole-embryo culture and the study of mammalian embryos during organogenesis.</a> Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 53 (1), 81-122 (1978).</li>
<li>Tam, P. P., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+gastrulation%3A+the+formation+of+a+mammalian+body+plan%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Mouse gastrulation: the formation of a mammalian body plan.</a> Mechanisms of Development. 68 (1-2), 3-25 (1997).</li>
<li>Huang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of mouse embryos.</a> Science. 368 (6487), 181-186 (2020).</li>
<li>White, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lived+binding+of+Sox2+to+DNA+predicts+cell+fate+in+the+four-cell+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-lived binding of Sox2 to DNA predicts cell fate in the four-cell mouse embryo.</a> Cell. 165 (1), 75-87 (2016).</li>
<li>Tam, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postimplantation+mouse+development%3A+whole+embryo+culture+and+micro-manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Postimplantation mouse development: whole embryo culture and micro-manipulation.</a> International Journal of Developmental Biology. 42 (7), 895-902 (1998).</li>
<li>Nicholas, J. S., Rudnick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+rat+embryos+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The development of rat embryos in tissue culture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 20 (12), 656-658 (1934).</li>
<li>New, D. A., Stein, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+mouse+embryos+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cultivation of mouse embryos in vitro.</a> Nature. 199, 297-299 (1963).</li>
<li>Rivera-Pérez, J. A., Jones, V., Tam, P. P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+whole+mouse+embryos+at+early+postimplantation+to+organogenesis+stages%3A+developmental+staging+and+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Culture of whole mouse embryos at early postimplantation to organogenesis stages: developmental staging and methods.</a> Methods in Enzymology. 476, 185-203 (2010).</li>
<li>New, D. A. T., Coppola, P. T., Terry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+explanted+rat+embryos+in+rotating+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Reproduction+and+Fertility%22%5BJournal%5D)">Culture of explanted rat embryos in rotating tubes.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 35 (1), 135-138 (1973).</li>
<li>Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+and+historical+review+of+culture+methods+for+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">A comparative and historical review of culture methods for vertebrates.</a> International Journal of Developmental Biology. 41 (12), 127-137 (1997).</li>
<li>Parameswaran, M., Tam, P. P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regionalisation+of+cell+fate+and+morphogenetic+movement+of+the+mesoderm+during+mouse+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Genetics%22%5BJournal%5D)">Regionalisation of cell fate and morphogenetic movement of the mesoderm during mouse gastrulation.</a> Developmental Genetics. 17 (1), 16-28 (1995).</li>
<li>Beddington, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+a+second+neural+axis+by+the+mouse+node%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Induction of a second neural axis by the mouse node.</a> Development. 120 (3), 613-620 (1994).</li>
<li>Aguilera-Castrejon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+utero+mouse+embryogenesis+from+pre-gastrulation+to+late+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis.</a> Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).</li>
<li>Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+rat+serum+suitable+for+mammalian+whole+embryo+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Preparation of rat serum suitable for mammalian whole embryo culture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51969(2014).</li>
<li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Isolation, culture and manipulation of postimplantation embryos. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBehringer%2C+R+%22Manipulating+the+Mouse+Embryo%3A+a+Laboratory+Manual%22">Manipulating the Mouse Embryo: a Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 149-193 (2014).</li>
<li>Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transferring+genes+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+Growth+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Development, Growth and Differentiation. 50 (6), 485-497 (2008).</li>
<li>Mathieu, J., Ruohola-Baker, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+remodeling+during+the+loss+and+acquisition+of+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Metabolic remodeling during the loss and acquisition of pluripotency.</a> Development. 144 (4), 541-551 (2017).</li>
<li>Sturm, K., Tam, P. P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+whole+postimplantation+embryos+and+germ+layer+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of whole postimplantation embryos and germ layer derivatives.</a> Methods in Enzymology. 225, 164-190 (1993).</li>
</ol>

J.H.H. is adviseur van Biological Industries Ltd. en heeft een octrooiaanvraag ingediend met betrekking tot de hierin beschreven rol- en statische cultuuromstandigheden (ingediend door J.H.H. en het Weizmann Institute of Science). Andere auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.

Het hierin gepresenteerde kweekprotocol kan een goede en continue ontwikkeling van muizenembryo ex utero gedurende maximaal zes dagen ondersteunen, van E5.5 tot E11. Voorheen konden embryo's in deze ontwikkelingsstadia zich normaal in cultuur slechts gedurende korte perioden (tot 48 uur) ontwikkelen15. De koppeling van de gasregelmodule aan de rolkweekincubator voor nauwkeurige controle van de zuurstofconcentratie en hyperbare gasdruk is van cruciaal belang voor de juiste muizenembryocult...

Intra-uteriene ontwikkeling van het zoogdierembryo heeft de studie van de vroege stadia van postimplantatieontwikkeling beperkt1,2. De ontoegankelijkheid van het zich ontwikkelende embryo belemmert het begrip van belangrijke ontwikkelingsprocessen die plaatsvinden nadat het embryo zich in de baarmoeder heeft geïmplanteerd, zoals de vaststelling van het dierlijke lichaamsplan, specificatie van de kiemlagen of de vorming van weefsels en organen. Bovendien maakt de zeer kleine omvang van het vroege postimplanteerde embryo het moeilijk om te observeren door intravitale beeldvorming in utero vóór E103. Het onvermogen om levende embryo's in deze stadia te observeren en te manipuleren heeft de studie van vroege postimplantatie-embryogenese beperkt tot momentopnamen tijdens de ontwikkeling.
Protocollen voor in vitro kweek van pre-implantatie zoogdierembryo's zijn goed ingeburgerd, betrouwbaar en worden regelmatig gebruikt4. Niettemin hadden pogingen om ex utero-kweeksystemen op te zetten die in staat zijn een goede postimplantatie-embryogroei bij zoogdieren te ondersteunen, beperkt succes5. Al meer dan een eeuw wordt een verscheidenheid aan kweektechnieken voorgesteld, voornamelijk door het kweken van de embryo's in conventionele statische platen6,7,8 of roterende flessen (rolculturen)5,9,10. Deze platforms bleken nuttig bij het uitbreiden van de kennis over de ontwikkeling van zoogdieren na implantatie11,12, ondanks het feit dat ze zeer inefficiënt waren voor normale embryooverleving en beperkt waren tot korte perioden. De embryo's begonnen al 24-48 uur na kweekinitiatie ontwikkelingsachterstand en morfologische anomalieën te vertonen.
Deze studie geeft een gedetailleerde beschrijving voor het opzetten van het ex utero embryokweeksysteem dat een continue ontwikkeling mogelijk maakt van pregastrulatie tot gevorderde organogenesestadia gedurende maximaal zes dagen postimplantatieontwikkeling13. Dit artikel beschrijft het verbeterde rollerkweekprotocol dat de groei van E7.5-embryo's (neurale plaat en headfold-stage) ondersteunt tot het vormingsstadium van de achterpoten (~ E11) en de uitgebreide kweek van E5.5 / E6.5 door cultuur te combineren op statische platen en rolkweekplatforms.

<table><tbody><tr><td>0.22 &micro;m pore size filter (250 mL)</td><td>JetBiofil</td><td>FCA-206-250</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &micro;m pore size syringe PVDF filter</td><td>Millipore</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>8-well &micro;-plates glass bottom/ibiTreat</td><td>iBidi</td><td>80827/80826</td><td></td></tr><tr><td>Bottle met adapterdop voor gasinlaat</td><td>Arad Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bungs (gat)</td><td>B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering</td><td>BTC 06</td><td>Wordt gebruikt om de flessen af te sluiten op het vat</td></tr><tr><td>Bungs (stevig)</td><td>B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering</td><td>BTC 07</td><td>Wordt gebruikt om het roterende vat te af te sluiten</td></tr><tr><td>Kweekflessen</td><td>B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering</td><td>BTC 03/BTC 04</td><td>Hetzij glazen flessen (klein) BTC 03 of glazen flessen (groot) BTC 04</td></tr><tr><td>D(+)-glucose monohydraat</td><td>J.T. Baker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diamantmes</td><td>Fine Science Tools</td><td>10100-30/45</td><td></td></tr><tr><td>Digitaal drukpeil</td><td>Shanghai Benxu Electronics Technology co. Ltd</td><td>BX-DPG80</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>11880</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline</td><td>Biological industries</td><td>02-020-1A</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>Biological industries</td><td>04-013-1A</td><td></td></tr><tr><td>Gasregelmodule</td><td>Arad Technologies</td><td>HannaLab1</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>GIBCO</td><td>35050061</td><td>glutamine</td></tr><tr><td>Graefe-tang</td><td>Fine Science Tools</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>GIBCO</td><td>15630056</td><td></td></tr><tr><td>Microchirurgische pincetten (Dumont #5, #55)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurpipetten (glas)</td><td>Hilgenberg</td><td>3150102</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurpipetten (kunststof)</td><td>Alexred</td><td>SO P12201</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/streptomycine</td><td>Biological industries</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen (60 mm en 100 mm)</td><td>Falcon</td><td>351007/351029</td><td></td></tr><tr><td>Precisie-incubatorsysteem</td><td>B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering</td><td>BTC01</td><td>BTC01 model met gasbubbelkit</td></tr><tr><td>Pro-coagulerende steriele testbuisjes (5 mL)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>#456005</td><td></td></tr><tr><td>Ratten-geheel embryocultuurserum</td><td>ENVIGO Bioproducts</td><td>B-4520</td><td></td></tr><tr><td>Stereoscopische microscoop uitgerust met verwarmingsplaat</td><td>Nikon</td><td>SMZ18</td><td></td></tr><tr><td>Steriele spuiten (5, 10 ml) voor serumfiltratie</td><td>Pic Solution</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische schaar</td><td>Fine Science Tools</td><td>14094-11</td><td></td></tr></tbody></table>

ex utero kweek van muizenembryo's van pregastrulatie tot geavanceerde organogenese

Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis

Postimplantatie embryokweekmethoden van zoogdieren zijn over het algemeen inefficiënt en beperkt tot korte perioden na dissectie uit de baarmoeder. Er zijn onlangs platforms ontwikkeld voor zeer robuuste en langdurige ex utero-kweek van muizenembryo's vanaf ei-cilinderstadia tot gevorderde organogenese. Deze platforms maken een geschikte en getrouwe ontwikkeling van pregastruerende embryo's (E5.5) mogelijk tot het stadium van de vorming van de achterpoten (E11). Late gastrulatende embryo's (E7.5) worden in deze omgevingen gekweekt in roterende flessen, terwijl uitgebreide kweek uit pregastrulatiestadia (E5.5 of E6.5) een combinatie van statische en roterende flesculturen vereist. Bovendien zijn gevoelige regulatie van O2 - en CO2-concentratie , gasdruk, glucosespiegels en het gebruik van een specifiek ex utero kweekmedium van cruciaal belang voor een goede embryo-ontwikkeling. Hier wordt een gedetailleerd stap-voor-stap protocol voor uitgebreide ex utero muis embryokweek gegeven. Het vermogen om normale muizenembryo's ex utero te laten groeien van gastrulatie tot organogenese is een waardevol hulpmiddel voor het karakteriseren van het effect van verschillende experimentele verstoringen tijdens de embryonale ontwikkeling.

De beschreven rolkweekomstandigheden voor E7,5-embryo's (late gastrulatiefase) ondersteunen een constante en normale embryogroei met een gemiddelde efficiëntie van bijna 75% na 4 kweekdagen (figuur 2 en tabel 1). De efficiëntie van de embryo-ontwikkeling kan variëren tussen verschillende genetische achtergronden van muizen, maar is consistent robuust (figuur 2C). Suppletie met HBS in plaats van HCS levert een efficiëntie op van ~68% na 4 dagen <...

Een verbeterd platform voor de kweek van hele embryo's maakt een continue en robuuste ex utero-ontwikkeling van postimplantatiemuismyo's gedurende maximaal zes dagen mogelijk, van pregastrulatiestadia tot gevorderde organogenese. In dit protocol beschrijven we de standaardprocedure voor succesvolle embryokweek met behulp van statische platen en roterende flessystemen.

Ex Utero Kweek van muizenembryo's van pregastrulatie tot geavanceerde organogenese

Postimplantation mammalian embryo culture methods have been generally inefficient and limited to brief periods after dissection out of the uterus. ...

Deze methode zal fundamenteel zijn voor het begrijpen van gastrulatie langs een formatie bij zoogdieren. Door experimenten met levende embryo's mogelijk te maken tijdens embryonale stadia die lang verborgen zijn geweest in de baarmoeder van de moeder. Het maakt een efficiënte en geschikte groei van muizenembryo's buiten de baarmoeder mogelijk voor een langere periode van maximaal 6 dagen.Snelle en adequate embryodissectie en pregastrulatie van de gasconcentratie en -druk zijn de meest kritieke stappen voor een succesvolle embryogroei. Om te beginnen met het kweken van 7,5 dagen oude of meer geavanceerde muizenembryo's, schakelt u de rotator en de verwarmingseenheid van het rollerkweekincubatorsysteem gedurende ten minste 1 uur vóór de dissecties van het embryo in. Voeg ook autoclaafwater toe aan de gasinlaatfles en de uitlaattestbuis.Schakel vervolgens de gasregelaarmodule in door op de hoofdschakelaar te drukken en gebruik vervolgens de respectieve controllers om de zuurstof- en koolstofdioxidewaarden in te stellen op 5% Open de gasregelaar en verplaats de spanningsschakelaar in de druktransmitter om de gasdruk in te stellen op ongeveer 6,5 tot 7 pond per vierkante inch. Bevestig

ex-utero-culture-mouse-embryos-from-pregastrulation-to-advanced

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

We presenteren een methode om organotypische plakjes van mid-dracht muis embryo's voor te bereiden op de teelt en de time-lapse imaging van perifere zenuwen uitgroei.

Organotypische Slice Cultuur van GFP-expressie muis embryo&#39;s voor real-time beeldvorming van perifere zenuwen uitgroei

Een methode waardoor de directe farmacologische manipulatie van muis embryo's tijdens neurulatie dat maternale metabolisme omzeilt wordt beschreven. De techniek kan worden aangepast aan de verschillende aspecten van de neurulatie studie door het variëren van het tijdstip en farmacologische agent.

Neurale buis sluiting in Mouse Whole Embryo Cultuur

Ontwikkelingsstudies in de muis worden gehinderd door de ontoegankelijkheid van het embryo tijdens de dracht. Om de lange termijn cultuur van het embryonale hart te bevorderen in de late stadia van de zwangerschap, hebben we een protocol waarin het uitgesneden hart wordt gekweekt in een semi-vaste, verdunde Matrigel ontwikkeld.

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cultuur Methode voor de embryonale Mouse Hart

Serum gebruikt in embryocultures bevat onbekende componenten die het resultaat van experimenten vooral in studies met signalering interacties beïnvloeden. Hier gebruikte we een serumvrij zuurstof kweeksysteem aantonen dat mid-dracht muizenembryo's gekweekt gedurende 16-40 uur vertonen morfologische ontwikkeling vergelijkbaar embryo ontwikkeling in utero.

Muis embryonale ontwikkeling in een Serumvrij Hele Embryo Cultuur System

We beschrijven de dissectie en ex vivo cultuur van muis embryonale huid. De cultuur systeem houdt een lucht-vloeistof-interface over het weefsel oppervlak en maakt beeldvorming op een omgekeerde microscoop. Melanoblasten, een component van de ontwikkeling huid, worden fluorescerend gemerkte waardoor hun gedrag wordt waargenomen met behulp van confocale microscopie.

Ex vivo cultuur van muis embryonale Huid en live-beeldvorming van melanoblast Migratie

Verbeterde beeldvormingstechnologie maakt driedimensionale beeldvorming van organen mogelijk tijdens de ontwikkeling. Hier beschrijven we een systeem voor de kweek van hele organen dat levende beeldvorming van de zich ontwikkelende villi in de foetale muizendarm mogelijk maakt.

Muis Foetale Hele Darm Cultuur System voor Ex Vivo Manipulatie van signaalwegen en Driedimensionale Live-Imaging van Villus Development

De ex vivo rechtopstaande druppelcultuur is een alternatief voor huidige in vitro en in vivo experimentele technieken. Dit protocol is eenvoudig uit te voeren en vereist kleinere hoeveelheden reagens, terwijl het de mogelijkheid biedt om foetale vasculaire vorming, morfogenese en organogene te manipuleren en te bestuderen.

Gebruik<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Upright Droplet Culturen van Whole Foetale organen Developmental processen te bestuderen tijdens Mouse Organogenese

We presenteren een methode voor de isolatie en de cultuur van de muis Wolffian kanaal (WD). We hebben ook een gedetailleerde procedure voor de hele berg immunokleuring van gekweekte / vers geïsoleerde WDS met fluorescent gelabelde antilichamen aan te tonen. Samen vormen deze technieken kan de studie van de WD ontwikkeling, oprollen, en differentiatie.

Orgelcultuur en Whole Mount immunofluorescentiekleuring van Muis gangen van Wolff

We presenteren een gedetailleerd protocol voor het kweken en beeldvorming van muizenembryo's dat 3D + tijdbeeldvorming van cardiale voorlopercellen mogelijk maakt. Deze video-toolkit behandelt de belangrijkste vaardigheden die nodig zijn voor succesvolle live imaging die anders moeilijk te verkrijgen zijn uit tekstpublicaties.

Live beeldvorming van vroege cardiale voorlopers in het muizenembryo

Dit artikel stelt een pijplijn op voor hoogwaardige eencellige en kernsuspensies van gastrulerende muizenembryo's voor sequencing van individuele cellen en kernen.

Single-cell RNA-sequencing van gemuteerde hele muizenembryo's: van de epiblast tot het einde van de gastrulatie

Leer een betrouwbare methode voor ex utero-kweek van muizenembryo's tot zes dagen, van pregastrulatie tot geavanceerde organogenese. Dit protocol ondersteunt gedetailleerd onderzoek naar vroege ontwikkelingsprocessen.

Ex Utero Kweek van muizenembryo's van pregastrulatie tot geavanceerde organogenese

Meer video's verkennen