Name: Semi-gerichte ultra-high-performance chromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie analyse van fenolische metabolieten in plasma van oudere volwassenen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 39 s
Description: Leer een semi-gerichte UPLC-MS/MS-methode om fenolische metabolieten in plasma van oudere volwassenen te detecteren. Deze techniek helpt onderzoekers om de effecten van voedingsinterventies op gezondheid te analyseren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs zijn dankbaar voor de financiële steun van CONACYT, Mexico (CB- 2016-01-286449), en UACJ-PIVA (Projecten 313-17-16 en 335-18-13). OAMB wil CONACYT bedanken voor zijn Ph.D. beurs. Technische ondersteuning van het Multimedia Production-kantoor van UACJ wordt dankbaar erkend.

De plasmamonsters die in dit protocol worden gebruikt, werden verzameld in een eerdere studie volgens alle ethische richtlijnen en goedgekeurd door de Commissie institutionele ethiek en bio-ethiek (CIEB-2018-1-37) van de Universidad Autónoma de Ciudad Juárez. Het volledige protocol voor de extractie en identificatie van de fenolverbindingen en metabolieten in plasma door UPLC-MS/MS is weergegeven in figuur 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63164/63164fig01.jpg"> Figuur 1: Schematische weergave van de extractie en identificatie van fenolverbindingen en metabolieten in plasma volgens de semi-gerichte UPLC-MS/MS-methode. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63164/63164fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
1. Monstervoorbereiding
<ol><li>Bewaar de plasmamonsters bij -80 °C tot de analyse.</li>
	<li>Ontdooi de plasmamonsters bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. OPMERKING: De monsters kunnen in een waterbad bij 37 °C worden geplaatst om het proces te versnellen (5 min).</li>
	<li>Plaats 200 μL plasmamonster in een microbuisje van 2 ml en meng met 1.000 μL zuivere ethanol. Vortex het plasmamonster gedurende 30 s. OPMERKING: Gebruik altijd handschoenen bij het werken met plasmamonsters.</li>
	<li>Centrifugeer het monster gedurende 5 minuten bij 6.580 x g . Verzamel na het centrifugeren het supernatant met een micropipette of Pasteur pipet en plaats het in een nieuwe microbuis. Bewaar het supernatant bij 4 °C.</li>
	<li>Meng de pellet uit de vorige stap met 1.000 μL 100% ethanol, vortex gedurende 30 s en centrifugeer vervolgens gedurende 5 minuten bij 6.580 x g . OPMERKING: De pellet is sterk verpakt en moet goed worden geresuspendeerd om contact tussen het monster en zuivere ethanol te garanderen. Het gebruik van een micropipette om de pellet met ethanol te spoelen wordt aanbevolen.</li>
	<li>Verzamel na het centrifugeren het supernatant en meng met het supernatant dat eerder is verkregen uit stap 1.4. in een microbuisje van 2 ml.</li>
	<li>Verwijder ethanol uit het monster met zuivere stikstof (99,997%) bij 135 psi. Houd de naald op 1 cm afstand van de bovenkant van de microbuis om monsterverlies te voorkomen en spoel totdat het monster droog is. Er is geen warmte nodig om de ethanol te verdampen. OPMERKING: De stikstofstroom moet laag zijn om monsterverlies te voorkomen. Zodra de ethanol is gedroogd, houdt u de stikstofstroom gedurende ten minste 5 minuten om de droogheid van het monster te garanderen. Het protocol kan op dit punt worden gepauzeerd; de monsters moeten bij -20 °C worden bewaard. Bewaar de monsters niet langer dan 12 uur.</li>
	<li>Resuspend de droge monsters in 100 μL van een mengsel van acetonitril: water in een verhouding van 50:50 (v:v).</li>
	<li>Filtreer het monster door een nylon spuitmembraan van 0,45 μm rechtstreeks in een micro-inzetstuk van een HPLC-injectieflacon. OPMERKING: De monsters in de injectieflacon kunnen vóór de analyse bij -20 °C worden bewaard. Bewaar de monsters niet langer dan 8 uur. Het wordt aanbevolen om de monsters net na filtratie in het UPLC-systeem te injecteren.</li>
</ol>2. UPLC-MS/MS-analyse
<ol><li>Injecteer 3 μL monster op een UPLC uitgerust met een C18 omgekeerde fase kolom (50 mm x 2,1 mm; 1,8 μm). Stel de autosamplertemperatuur in op 20 °C en de kolomthermostaat op 25 °C. Injecteer elk monster in drievoud.</li>
	<li>Gebruik 0,1% (v:v) mierenzuur in water als oplosmiddel A en 100% acetonitril als oplosmiddel B. Stel het debiet in op 0,4 ml/min en een gradiëntprogramma als volgt: 0-1 min 10% B, 1-4 min 30% B, 4-6 min 38% B, 6-8 min 60% B, 8-8,5 min 60% B, 8,5-9 min 10% B (tabel 1).</li>
	<li>Stel de massaspectrometer in op ionisatie in negatieve modus. Gebruik stikstof als drooggas bij 340 °C en een debiet van 13 L/min. Stel de vernevelingsdruk in op 60 psi. Stel de capillaire spanning in op 4.000 V, de fragmentorspanning op 175 V en de Skimmerspanning op 65 V. Gebruik botsingsenergie op 20 V (tabel 2).</li>
	<li>Scan de massa's tussen 100-1100 massa/ladingsverhouding (m/z) en, voor MS/MS, scan massa's tussen 50-1000 m/z (tabel 2). Stel gegevensverzameling in op de automatische MS/MS-modus. Gebruik de volgende referentiemassa: 119.036 en 966.0007.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tijd (min)</td>
			<td>Oplosmiddel A (0,1 % mierenzuur in HPLC-water)</td>
			<td>Oplosmiddel B (100 % acetonitril)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 tot 1</td>
			<td>90</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 tot 4</td>
			<td>70</td>
			<td>30</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 tot 6</td>
			<td>62</td>
			<td>38</td>
		</tr>
<tr>
<td>6 tot 8</td>
			<td>40</td>
			<td>60</td>
		</tr>
<tr>
<td>8 tot 8,5</td>
			<td>40</td>
			<td>60</td>
		</tr>
<tr>
<td>8,5 tot 9</td>
			<td>90</td>
			<td>10</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Mobiele fasegradiënt gebruikt voor de scheiding van fenolverbindingen door UPLC.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Ionisatiemodus</td>
			<td>Negatief</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gas drogen</td>
			<td>Stikstof bij 340 °C, debiet 13 L/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Vernevelaar druk</td>
			<td>60 psi</td>
		</tr>
<tr>
<td>Capillaire spanning</td>
			<td>175 v</td>
		</tr>
<tr>
<td>MS scan massa's</td>
			<td>100-1100 m/z</td>
		</tr>
<tr>
<td>MS/MS scan massa's</td>
			<td>50-1000 m/z</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: Ionisatieparameters voor de MS/MS-analyse.
3. Database constructie
<ol><li>Zoek naar fenolverbindingen, fenolische metabolieten of andere verbindingen van belang in de wetenschappelijke literatuur.</li>
	<li>Open de databasebeheersoftware die is opgenomen in het UPLC-systeem. Selecteer Bestand | Nieuwe PCDL-| (Personal Database Compound Library) Maak een nieuwe PCDL. Selecteer het type PCDL: LC/MS Metabolomics. Stel een naam in voor de PCDL. Selecteer vervolgens Maken.</li>
	<li>Selecteer op de werkbalk PCDL en vervolgens de optie Bewerken toestaan . Klik vervolgens op de knop Verbindingen zoeken . OPMERKING: Aangezien het een nieuwe PCDL is, zijn de tabelresultaten leeg. Dit zal veranderen zodra nieuwe verbindingen aan de PCDL worden toegevoegd.<ol>
<li>Voeg verbindingen toe aan de gespecialiseerde samengestelde bibliotheek voor persoonlijke databases door ze te kopiëren uit de algemene bibliotheek van het instrument. Open de bestaande database van het instrument die is opgenomen in de databasebeheersoftware. Klik op de knop Verbindingen zoeken. Voer in de optie Enkele zoekopdracht de samengestelde zoekcriteria in om de interessante samenstelling te vinden. OPMERKING: Verbindingen kunnen worden gevonden op naam, molecuulformule, exacte massa en retentietijd.</li>
		<li>Selecteer in de tabel met samengestelde resultaten de samengestelde factor van belang. Als u meer dan één samengestelde compound wilt selecteren, klikt u op de eerste samengestelde compound, houdt u CTRL ingedrukt en klikt u vervolgens op elke interessante compound. Klik vervolgens met de rechtermuisknop op alle gemarkeerde verbindingen en selecteer Toevoegen aan PCDL.</li>
		<li>Zoek en selecteer in het nieuwe venster het gespecialiseerde persoonlijke databasebestand. Markeer de vakjes Spectra opnemen voor verbindingen indien aanwezig en Inclusief ionenmobiliteitsinformatie voor verbindingen indien aanwezig. Klik op de knop Toevoegen . Selecteer in het nieuwe dialoogvenster Ja om de nieuwe toegevoegde verbindingen te controleren. Selecteer Nee om te blijven zoeken naar meer interessante samenstellingen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Als de interessante verbindingen niet beschikbaar zijn in de algemene bibliotheek van het instrument, voegt u handmatig nieuwe verbindingen toe.<ol>
<li>Open de gespecialiseerde persoonlijke database. Eenmaal geopend, volgt u stap 3.3. Selecteer de optie Verbindingen bewerken . Klik op de knop Nieuwe toevoegen .</li>
		<li>Vul in het bovenste gedeelte van het venster de informatie voor de nieuwe verbinding in. Vul de formule, naam, IUPAC-naam, CAS-nummer, Chemspider-ID en andere id's in.</li>
		<li>Gebruik de informatie die beschikbaar is in de gratis online bibliotheken (Chemspider, PubChem en Phenol Explorer) om de informatie voor de nieuwe samenstelling van interesse in te vullen. Als u klaar bent, klikt u op de knop Opslaan als nieuw om de nieuwe samengestelde informatie op te slaan in de gespecialiseerde persoonlijke database. OPMERKING: Wanneer u informatie uit vrije bibliotheken toevoegt, moet u de samengestelde informatie opnemen zonder de aanwezigheid van chloride- of jodide-ionen. Dit kan de exacte massa en molecuulformule van de samengestelde stof van belang wijzigen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Herhaal het proces met alle interessante verbindingen om de gespecialiseerde persoonlijke database te voltooien.</li>
</ol>4. Data-analyse
<ol><li>Gebruik de kwalitatieve managersoftware van het instrument om de fenolische verbindingen en fenolische metabolieten in de monsters te identificeren.</li>
	<li>Open het voorbeeldbestand. Selecteer in het deelvenster Chromatogram definiëren de optie Chromatogrammen definiëren en extraheer het totale ionchromatogram (TIC), het geëxtraheerde ionchromatogram van MS (EIC) en de EIC van MS/MS. Selecteer de optie chromatogram integreren.</li>
	<li>Selecteer in het deelvenster Verbindingen zoeken de optie Zoeken op formule-opties. Selecteer in het nieuwe venster Formulebron en vervolgens de optie Database/bibliotheek . Zoek de persoonlijke database die eerder is gemaakt en klik op Openen.</li>
	<li>Selecteer de optie Formula Matching en stel een massamatchtolerantie in van 5 delen per miljoen (ppm). OPMERKING: Een andere matchtolerantie van massa's kan worden ingesteld op 10 ppm; dit verschil is afhankelijk van de gebruikte massaspectrometer.</li>
	<li>Selecteer de optie Negatieve ionen en selecteer alleen het dialoogvenster -H . Markeer in de optie Resultaten de dialoogvensters EIC extraheren, Opgeschoond spectrum extraheren, Ruw spectrum extraheren en Structuur opnemen .</li>
	<li>Selecteer de optie Resultaatfilters . Markeer Waarschuw als de score is en stel de score match in op 80,00%. Markeer Niet overeenkomen als de score is en stel de score in op 75,00%. OPMERKING: De match/not match scores kunnen indien nodig worden gewijzigd in lagere waarden. Dit zal de nauwkeurigheid van de identificatie verminderen.</li>
	<li>Klik op de find compounds by formula om interessante verbindingen in het monster te identificeren.</li>
</ol>

<ol><li>Morley, J. E., Anker, S. D., von Haehling, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence%2C+incidence%2C+and+clinical+impact+of+sarcopenia%3A+facts%2C+numbers%2C+and+epidemiology-update+2014%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cachexia%2C+Sarcopenia+and+Muscle%22%5BJournal%5D)">Prevalence, incidence, and clinical impact of sarcopenia: facts, numbers, and epidemiology-update 2014.</a> Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 5 (4), 253-259 (2014).</li>
<li>Cruz-Jentoft, A. J., Sayer, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sarcopenia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Sarcopenia.</a> The Lancet. 393 (10191), 2636-2646 (2019).</li>
<li>Beaudart, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrition+and+physical+activity+in+the+prevention+and+treatment+of+sarcopenia%3A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoporosis+International%22%5BJournal%5D)">Nutrition and physical activity in the prevention and treatment of sarcopenia: systematic review.</a> Osteoporosis International. 28 (6), 1817-1833 (2017).</li>
<li>Ozer, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenolic+compositions+and+antioxidant+activities+of+Maya+nut+%28Brosimum+alicastrum%29%3A+Comparison+with+commercial+nuts%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Food+Properties%22%5BJournal%5D)">Phenolic compositions and antioxidant activities of Maya nut (Brosimum alicastrum): Comparison with commercial nuts.</a> International Journal of Food Properties. 20 (11), 2772-2781 (2017).</li>
<li>Subiria-Cueto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brosimum+alicastrum+Sw.+%28Ram%C3%B3n%29%3A+An+alternative+to+improve+the+nutritional+properties+and+functional+potential+of+the+wheat+flour+tortilla%5BTitle%5D)+AND+%22Foods%22%5BJournal%5D)">Brosimum alicastrum Sw. (Ramón): An alternative to improve the nutritional properties and functional potential of the wheat flour tortilla.</a> Foods. 8 (12), 1-18 (2019).</li>
<li>Martínez-Ruiz, N., Torres, L. E. J., del Hierro-Ochoa, J. C., Larqué-Saavedra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bebida+adicionada+con+Brosimum+alicastrum+sw.%3A+Una+alternativa+para+requerimientos+dietarios+especiales%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+Salud+P%C3%BAblica+y+Nutrici%C3%B3n%22%5BJournal%5D)">Bebida adicionada con Brosimum alicastrum sw.: Una alternativa para requerimientos dietarios especiales.</a> Revista Salud Pública y Nutrición. 18 (3), 1-10 (2019).</li>
<li>Rodríguez-Tadeo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionality+of+bread+and+beverage+added+with+brosimum+alicastrum+sw.+Seed+flour+on+the+nutritional+and+health+status+of+the+elderly%5BTitle%5D)+AND+%22Foods%22%5BJournal%5D)">Functionality of bread and beverage added with brosimum alicastrum sw. Seed flour on the nutritional and health status of the elderly.</a> Foods. 10 (8), 1-21 (2021).</li>
<li>Muñoz-Bernal, ÓA., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuevo+acercamiento+a+la+interacci%C3%B3n+del+reactivo+de+Folin-Ciocalteu+con+az%C3%BAcares+durante+la+cuantificaci%C3%B3n+de+polifenoles+totales%5BTitle%5D)+AND+%22TIP+Revista+Especializada+en+Ciencias+Qu%C3%ADmico-Biol%C3%B3gicas%22%5BJournal%5D)">Nuevo acercamiento a la interacción del reactivo de Folin-Ciocalteu con azúcares durante la cuantificación de polifenoles totales.</a> TIP Revista Especializada en Ciencias Químico-Biológicas. 20 (2), 28-33 (2017).</li>
<li>Luca, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactivity+of+dietary+polyphenols%3A+The+role+of+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Food+Science+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Bioactivity of dietary polyphenols: The role of metabolites.</a> Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 60 (4), 626-659 (2020).</li>
<li>Kawabata, K., Yoshioka, Y., Terao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+intestinal+microbiota+in+the+bioavailability+and+physiological+functions+of+dietary+polyphenols%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Role of intestinal microbiota in the bioavailability and physiological functions of dietary polyphenols.</a> Molecules. 24 (2), (2019).</li>
<li>de Llano, D. G., Moreno-Arribas, M. V., Bartolomé, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cranberry+polyphenols+and+prevention+against+urinary+tract+Infections%3A+Relevant+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Cranberry polyphenols and prevention against urinary tract Infections: Relevant considerations.</a> Molecules. 25 (15), (2020).</li>
<li>Alsaleh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry%3A+A+guide+for+the+clinician%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+and+Experimental+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry: A guide for the clinician.</a> Journal of Clinical and Experimental Hepatology. 9 (5), 597-606 (2019).</li>
<li>Wang, X., Sun, H., Zhang, A., Wang, P., Han, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-performance+liquid+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry+as+a+sensitive+and+powerful+technology+for+metabolomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Separation+Science%22%5BJournal%5D)">Ultra-performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry as a sensitive and powerful technology for metabolomic studies.</a> Journal of Separation Science. 34 (24), 3451-3459 (2011).</li>
<li>Feliciano, R. P., Mills, C. E., Istas, G., Heiss, C., Rodriguez-Mateos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absorption%2C+metabolism+and+excretion+of+cranberry+%28poly%29phenols+in+humans%3A+A+dose+response+study+and+assessment+of+inter-individual+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Absorption, metabolism and excretion of cranberry (poly)phenols in humans: A dose response study and assessment of inter-individual variability.</a> Nutrients. 9 (3), (2017).</li>
<li>Mateos, R., Goya, L., Bravo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake+and+metabolism+of+hydroxycinnamic+acids+%28chlorogenic%2C+caffeic%2C+and+ferulic+acids%29+by+HepG2+cells+as+a+model+of+the+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Uptake and metabolism of hydroxycinnamic acids (chlorogenic, caffeic, and ferulic acids) by HepG2 cells as a model of the human liver.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (23), 8724-8732 (2006).</li>
<li>Rodriguez Lanzi,, Perdicaro, C., Antoniolli, D. J., Piccoli, A., Vazquez Prieto, M. A., Fontana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenolic+metabolites+in+plasma+and+tissues+of+rats+fed+with+a+grape+pomace+extract+as+assessed+by+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Phenolic metabolites in plasma and tissues of rats fed with a grape pomace extract as assessed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. , 28-33 (2018).</li>
<li>Hou, Y., He, D., Ye, L., Wang, G., Zheng, Q., Hao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+detection+and+identification+strategy+for+untargeted+metabolomics+based+on+UPLC-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">An improved detection and identification strategy for untargeted metabolomics based on UPLC-MS.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 191, 113531(2020).</li>
<li>Nagy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+identification+of+dimethoxycinnamic+acids+in+human+plasma+after+coffee+intake+by+liquid+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">First identification of dimethoxycinnamic acids in human plasma after coffee intake by liquid chromatography-mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography A. 1218 (3), 491-497 (2011).</li>
<li>Marmet, C., Actis-Goretta, L., Renouf, M., Giuffrida, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+phenolic+acids+and+their+methylates%2C+glucuronides%2C+sulfates+and+lactones+metabolites+in+human+plasma+by+LC-MS%2FMS+after+oral+ingestion+of+soluble+coffee%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Quantification of phenolic acids and their methylates, glucuronides, sulfates and lactones metabolites in human plasma by LC-MS/MS after oral ingestion of soluble coffee.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 88, 617-625 (2014).</li>
<li>McCord, J., Strynar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+per-and+polyfluorinated+chemical+species+with+a+combined+targeted+and+non-targeted-screening+high-resolution+mass+spectrometry+workflow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Identifying per-and polyfluorinated chemical species with a combined targeted and non-targeted-screening high-resolution mass spectrometry workflow.</a> Journal of Visualized Experiments. 2019 (146), 1-15 (2019).</li>
<li>Muñoz-Bernal, ÓA., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phytochemical+characterization+and+antiplatelet+activity+of+Mexican+red+wines+and+their+by-products%5BTitle%5D)+AND+%22South+African+Journal+of+Enology+and+Viticulture%22%5BJournal%5D)">Phytochemical characterization and antiplatelet activity of Mexican red wines and their by-products.</a> South African Journal of Enology and Viticulture. 42 (1), 77-90 (2021).</li>
<li>Muñoz-Bernal, ÓA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enriquecimiento+de+un+vino+tinto+con+un+extracto+de+compuestos+fen%C3%B3licos+provenientes+de+orujo+de+uva%3A+bioaccesibilidad%2C+an%C3%A1lisis+sensorial+y+respuesta+biol%C3%B3gica%5BTitle%5D)+AND+%22Universidad+Aut%C3%B3noma+de+Ciudad+Ju%C3%A1rez%22%5BJournal%5D)">Enriquecimiento de un vino tinto con un extracto de compuestos fenólicos provenientes de orujo de uva: bioaccesibilidad, análisis sensorial y respuesta biológica.</a> Universidad Autónoma de Ciudad Juárez. , (2021).</li>
<li>Low, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+sharing+in+PredRet+for+accurate+prediction+of+retention+time%3A+Application+to+plant+food+bioactive+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Data sharing in PredRet for accurate prediction of retention time: Application to plant food bioactive compounds.</a> Food Chemistry. , 357(2021).</li>
<li>Sánchez-Patán, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbial+catabolism+of+grape+seed+flavan-3-ols+by+human+faecal+microbiota.+Targeted+analysis+of+precursor+compounds%2C+intermediate+metabolites+and+end-products%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Gut microbial catabolism of grape seed flavan-3-ols by human faecal microbiota. Targeted analysis of precursor compounds, intermediate metabolites and end-products.</a> Food Chemistry. 131 (1), 337-347 (2012).</li>
<li>Zhang, X., Sandhu, A., Edirisinghe, I., Burton-Freeman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+and+urinary+%28poly%29phenolic+profiles+after+4-week+red+raspberry+%28Rubus+idaeus+L.%29+intake+with+or+without+fructo-oligosaccharide+supplementation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Plasma and urinary (poly)phenolic profiles after 4-week red raspberry (Rubus idaeus L.) intake with or without fructo-oligosaccharide supplementation.</a> Molecules. 25 (20), (2020).</li>
</ol>

Alle auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.

De identificatie en kwantificering van de bioactieve fytochemicaliën die worden geabsorbeerd na consumptie van een voedingsmiddel of voedingssupplement zijn cruciaal voor het aantonen en begrijpen van de gezondheidsvoordelen van deze verbindingen en de voedingsmiddelen die ze bevatten. In het huidige werk werd de UPLC-MS / MS-methode ontwikkeld, alleen gericht op de identificatie van de belangrijkste fenolverbindingen en hun metabolieten die in concentratie in plasma toenamen na een voedingsinterventie van 30 dagen met t...

Sarcopenie is een progressieve skeletaandoening gerelateerd aan een versneld spierverlies bij de oudere bevolking. Deze aandoening verhoogt het risico op vallen en leidt tot beperkte activiteiten van het dagelijks leven. Sarcopenie is aanwezig bij ongeveer 5%-10% van de personen ouder dan 65 jaar en ongeveer 50% van de personen van 80 jaar of ouder1. Er zijn geen specifieke geneesmiddelen goedgekeurd voor de behandeling van sarcopenie, dus preventie met fysieke activiteit en een uitgebalanceerd dieet is belangrijk1,2. Voedingsinterventies met speciaal samengestelde voedingsmiddelen verrijkt met zuiveleiwitten en essentiële aminozuren hebben positieve resultaten laten zien bij het voorkomen van sarcopenie2. In andere studies hebben auteurs vitamines en antioxidanten, zoals vitamine E en isoflavonen, in het dieet opgenomen, waardoor de voordelen voor spiergroei op de taille en heupen toenemen3.
Brosimum alicastrum Sw. (Ramón) is een boom die groeit in de Mexicaanse tropische gebieden; het is geconsumeerd door Maya-culturen vanwege de hoge voedingswaarde4. Het is een goede bron van eiwitten, vezels, mineralen en fenolische antioxidanten, zoals chlorogeenzuur5. Omdat het kan worden vermalen tot poeder en kan worden gebruikt in bakproducten of geconsumeerd in dranken, hebben recente studies de opname van Ramón-zaadmeel (RSF) in verschillende voedingsmiddelen geëvalueerd om hun voedingswaarde te verbeteren. Een RSF-aangevulde drank met cappuccino-smaak werd geformuleerd, die rijk was aan voedingsvezels en meer dan 6 g eiwit per portie bevatte, en zeer werd geaccepteerd door consumenten; het werd dus beschouwd als een potentieel alternatief om aan speciale dieetwensen te voldoen6. In een vervolgstudie werd RSF ook gebruikt om een muffin en een nieuwe drank te formuleren die rijk is aan eiwitten, voedingsvezels, micronutriënten en fenolische antioxidanten. De muffin en drank werden gebruikt in een dieetinterventie voor ouderen, die beide producten twee keer per dag gedurende 30 dagen consumeerden. Na deze periode verbeterde de voedings- en sarcopeenstatus van de deelnemers en nam het totale fenolgehalte van plasma toe7. De bepaling van de totale fenolverbindingen in plasma werd echter uitgevoerd met een spectrofotometrische methode, zodat identificatie van de werkelijke fenolverbindingen die werden geabsorbeerd niet mogelijk was; bovendien is deze methode niet volledig specifiek voor fenolverbindingen, dus enige overschatting kan optreden8.
Identificatie en kwantificering van de fenolverbindingen die worden geabsorbeerd na consumptie van voedingsmiddelen die rijk zijn aan deze antioxidanten is een moeilijke taak, maar is noodzakelijk om de biologische activiteit van deze fytochemicaliën aan te tonen. De biologische beschikbaarheid van de meeste fenolverbindingen is laag; minder dan 5% van hen kan worden gevonden zonder structurele transformatie in plasma. Fenolverbindingen ondergaan verschillende biotransformaties, zoals methylatie, sulfonatie of glucuronidering, die worden uitgevoerd door enterocyten en hepatocyten9. Fenolverbindingen worden ook door de microbiota biotransformeerd in bacteriële katabolieten die hun gunstige effecten in het lichaam kunnen uitoefenen nadat ze in het plasma zijn opgenomen10. Fenylazijnzuur is bijvoorbeeld een product van de bacteriële transformatie van flavonoïden en oligomere proanthocyanidinen, die tot 40% van de bacterie (Escherichia coli) adhesie in de urinewegen kunnen remmen na cranberryconsumptie11.
De structurele diversiteit van natuurlijk voorkomende fenolverbindingen, toegevoegd aan de diversiteit van hun metabolieten en hun lage biologische beschikbaarheid, maakt hun identificatie in plasma nog uitdagender. Metabolomische profilering, met behulp van spectroscopische analyseplatforms zoals nucleaire magnetische resonantie (NMR) en tandemmassaspectroscopie (MS / MS), is waarschijnlijk de beste aanpak om dit doel te bereiken; helaas is de apparatuur niet gemakkelijk toegankelijk en is de ontwikkeling van analyseprotocollen nog beperkt12. Verschillende studies hebben MS/MS in combinatie met een scheidingssysteem (zoals vloeistofchromatografie) gerapporteerd als een strategie om de complexiteit van massaspectra in metabolomische studies te verminderen. De recente introductie van ultra-high-performance vloeistofchromatografie (UPLC) scheidingsmethoden heeft de analysetijd verkort en de resolutie en gevoeligheid verhoogd in vergelijking met conventionele high-performance vloeistofprotocollen, zodat UPLC-MS / MS-systemen snel algemeen zijn geaccepteerd door de analytische metabolomics-gemeenschap13. Op deze manier hebben sommige studies fenolmetabolieten onderzocht en glucuronideerde derivaten van cafeïnezuur, quercetine en ferulazuur gedetecteerd, evenals gesulfoneerde derivaten van syringine en vanillinezuur in het plasma van individuen na cranberry-inname14. Eerdere protocollen waren bedoeld om fenolverbindingen en fenolische metabolieten te vinden in biofluïden zoals plasma. Deze protocollen waren gebaseerd op identificatie en kwantificering door middel van high-performance vloeistofchromatografie (HPLC) gekoppeld aan een UV-vis detector15. Niettemin vereisen dergelijke protocollen het gebruik van authentieke normen om absolute identificatie en nauwkeurige kwantificering te beoordelen. Een breed scala aan studies heeft de meest voorkomende metabolieten in biofluïden (gesulfoneerde, geglucuronideerde en gemethyleerde vormen) door UPLC-MS en UPLC-MS / MS geïdentificeerd; een groot deel van de bacteriële metabolieten is echter niet gemeld vanwege het ontbreken van databases die hun volledige informatie bevatten16. De identificatie van metabolieten wordt bemoeilijkt door de kosten en commerciële beschikbaarheid van metabolietnormen. Daarom kan de beste strategie ongerichte of semi-gerichte MS/MS-metabolietanalyse zijn, die afhankelijk is van het gebruik van moleculaire kenmerkinformatie (m/z, exacte mono-isotoopische massa, isotopische distributie en fragmentatiepatroon) om de chemische identiteit te bepalen en deze vergelijkt met vrij beschikbare online databases die polyfenolmetabolieten bevatten die in biofluïden zijn geïdentificeerd na de consumptie van polypolyfenol-richts12 . De belangrijkste databases die worden gebruikt in UPLC-MS /MS-studies voor de identificatie van fenolverbindingen en hun metabolieten zijn de Human Metabolome Database (HMDB), LipidBlast Library, METLIN Library en andere aanvullende databases, zoals PubChem, ChemSpider en Phenol Explorer17.
In deze studie werd een semi-gerichte UPLC-MS/MS-methode ontwikkeld om de plasmamonsters te analyseren van de groep ouderen die betrokken waren bij de RSF-bevattende muffin- en drankconsumptiestudie7. Gegevens uit verschillende gratis online databases van plasmametabolieten werden verzameld en geïntegreerd in een gespecialiseerde database. Deze database kan automatisch worden geopend door de software van de apparatuur om de polyfenolische metabolieten in de vijf plasmamonsters voor en na de 30-daagse voedingsinterventie te identificeren. Dit wordt gedaan om de belangrijkste fenolverbindingen of hun metabolieten te identificeren die worden geabsorbeerd uit de speciaal geformuleerde functionele voedingsmiddelen die zijn ontworpen voor de preventie van sarcopenie.

<table><tbody><tr><td>Acetonitrile</td><td>Tedia</td><td>Al1129-001</td><td>LC Mass spectrometry</td></tr><tr><td>Autosampler</td><td>Agilent Technologies</td><td>G4226A</td><td>1290 Infinity series</td></tr><tr><td>C18 reverse phase column</td><td>Agilent Technologies</td><td>959757-902</td><td>Zorbax Eclipse plus C18 2.1x50 mm, 1.8 &mu;m; Rapid resolution HD</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5452000018</td><td>Mini Spin; Rotor F-45-12-11</td></tr><tr><td>Column compartment with thermostat</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1316C</td><td>1290 Infinity series</td></tr><tr><td>Diode Array Detector (UV-Vis)</td><td>Agilent Technologies</td><td>G4212B</td><td>1260 Infinity series</td></tr><tr><td>Electrospray ionnization source</td><td>Agilent Technologies</td><td>G3251B</td><td>Dual sprayer ESI source</td></tr><tr><td>Formic acid</td><td>J.T. Baker</td><td>0128-02</td><td>Baker reagent, ACS</td></tr><tr><td>Mass Hunter Data Acquisition</td><td>Agilent Technologies</td><td>G3338AA</td><td></td></tr><tr><td>Mass Hunter Personal Compound Datbase and Library Manager</td><td>Agilent Technologies</td><td>G3338AA</td><td></td></tr><tr><td>Mass Hunter Qualitative Analysis</td><td>Agilent Technologies</td><td>G3338AA</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tube</td><td>Brand</td><td>BR780546</td><td>Microcentrifuge tube, 2 mL with lid</td></tr><tr><td>Pure ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023-1L</td><td>200 proof, for molecular biology</td></tr><tr><td>Q-TOF LC/MS</td><td>Agilent Technologies</td><td>G6530B</td><td>6530 Accurate Mass</td></tr><tr><td>Quaternary pump</td><td>Agilent Technologies</td><td>G4204A</td><td>1290 Infinity series</td></tr><tr><td>Syringe filter</td><td>Thermo Scientific</td><td>44514-NN</td><td>17 mm, 0.45 &mu;m, nylon membrane</td></tr><tr><td>Thermostat</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1330B</td><td>1290 Infinity series</td></tr><tr><td>Vial</td><td>Agilent Technologies</td><td>8010-0199</td><td>Amber, PFTE red silicone 2 mL with screw top and blue caps</td></tr><tr><td>Vial insert</td><td>Agilent Technologies</td><td>5183-2089</td><td>Vial insert 200 &mu;L for 2mL standard opening, conical</td></tr><tr><td>Water</td><td>Tedia</td><td>WL2212-001</td><td>LC Mass spectrometry</td></tr></tbody></table>

semi-gerichte ultra-high-performance chromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie analyse van fenolische metabolieten in plasma van oudere volwassenen

Semi-Targeted Ultra-High-Performance Chromatography Coupled to Mass Spectrometry Analysis of Phenolic Metabolites in Plasma of Elderly Adults

Een groep van 23 ouderen kreeg functionele maaltijden (een drankje en een muffin) speciaal samengesteld voor de preventie van sarcopenie (leeftijdsgebonden verlies van spiermassa). Plasmamonsters werden genomen aan het begin van de interventie en na 30 dagen na het nuttigen van de functionele maaltijden. Een semi-gerichte ultra-high-performance chromatografie in combinatie met tandemmassa (UPLC-MS/MS) analyse werd uitgevoerd om fenolverbindingen en hun metabolieten te identificeren. Plasma-eiwitten werden neergeslagen met ethanol en de monsters werden geconcentreerd en geresuspendeerd in de mobiele fase (1:1 acetonitril: water) voor injectie in het UPLC-MS/MS-instrument. Scheiding werd uitgevoerd met een C18 omgekeerde fase kolom, en verbindingen werden geïdentificeerd met behulp van hun experimentele massa, isotopische verdeling en fragmentpatroon. Samengestelde factoren van belang werden vergeleken met die van databanken en de interne semi-gerichte bibliotheek. Voorlopige resultaten toonden aan dat de belangrijkste metabolieten die na de interventie werden geïdentificeerd fenylazijnzuur, glycitine, 3-hydroxyfenylvalerinezuur en gomisine M2 waren.

Het stapsgewijze proces voor de identificatie van fenolische metabolieten door middel van de semi-gerichte UPLC-MS/MS-analyse, in negatieve modus, van plasmamonsters is weergegeven in figuur 2. Eerst werd het totale ionchromatogram (TIC) van het plasmafenolenextract (verkregen na eiwitprecipitatie van het totale plasmamonster) verkregen via de kwalitatieve software van het instrument. Vervolgens werd het geëxtraheerde ionchromatogram gebruikt en werden de exacte massa e...

Het doel van dit protocol is om fenolische metabolieten in plasma te detecteren met behulp van een semi-gerichte chromatografie-massaspectrometriemethode.

Semi-gerichte ultra-high-performance chromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie analyse van fenolische metabolieten in plasma van oudere volwassenen

A group of 23 elderly persons was given functional meals (a beverage and a muffin) specially formulated for the prevention of sarcopenia (age-related loss ...

Het doel van dit protocol is om fenolische metabolieten in plasma te detecteren door middel van een semi-gerichte UPLC-MS/MS-methode. Plasma-eiwitten werden neergeslagen met ethanol en monsters geconcentreerd en opnieuw gesuspendeerd in de mobiele fase, voorafgaand aan injectie in de UPLC-apparatuur. Verbindingen werden geïdentificeerd met behulp van een semi-gerichte bibliotheek die in het laboratorium was samengesteld, met behulp van PCDL-manager voor metabolomica, software en verschillende gratis online databases.We implementeerden een voedingsinterventie met een muffin en drank geformuleerd met brosimum alicastrum zaadmeel. Aan het einde van de interventie waren de voedings- en sarcopenische status van de deelnemers verbeterd en was het totale fenolgehalte van plasma verhoogd. Maar we moeten identificeren welke fenolverbindingen zijn geabsorbeerd en het positieve effect hebben bijgedragen.Identificatie en kwantificering van de fenolverbindingen die worden geabsorbeerd na consumptie van voedingsmiddelen die rijk zijn aan deze antioxidanten is een moeilijke taak, maar noodzakelijk, als men de biologische activiteit van deze fytochemicaliën wil aantonen. De biologische beschikbaarheid van de meeste fenolcomponenten is laag, bovendien komt minder dan 5% van hen binnen zonder structurele transformatie in plasma. De meeste ondergaan verschillende biotransformaties, zoals methylatie, sulfonatie of glucuronidering.Een breed scala aan studies identificeerde de meest voorkomende metabolieten in biofluïden door UPLC-MS en UPLC-MS/MS. Een groot deel van de bacteriemetaboliet wordt echter niet gemeld aan het ontbreken van databases die hun volledige informatie bevatten. De identificatie van metabolieten wordt bemoeilijkt door de kosten en commerciële beschikbaarheid van metabolietnormen.Daarom kan de beste strategie een ongerichte of semi-gerichte MS/MS-metabolietanalyse zijn. Deze analyse is gebaseerd op het gebruik van moleculaire kenmerkinformatie, massa-tot-ladingsverhouding mono-isotopische exacte massa, isotopische verdeling en fragmentatiepatroon. Om de chemische identiteit te bepalen en te vergelijken met gratis beschikbare online databases die polyfenolmetabolieten bevatten die zijn geïdentificeerd in biovloeistoffen na consumptie van polyfenolrijke diëten.In de huidige studie hebben we een semi-gerichte UPLC-MS/MS-methode ontwikkeld om de plasmamonsters te analyseren van een groep ouderen die betrokken zijn bij een voedingsinterventie. Bewaar plasmamonsters bij min 80 graden Celsius tot de analyse. Ontdooi plasmamonsters bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten of bij 37 graden Celsius gedurende vijf minuten.Plaats 200 microliter plasmamonster in een microbuisje van twee millimeter en meng met 1000 microliter zuivere ethanol. Vortex plasmamonster gedurende 30 seconden. Centrifugeer monster bij 6, 580 centrifugale kracht gedurende vijf minuten.Verzamel na het centrifugeren het supernatant met een micropipette of Pasteur pipet en plaats het in een nieuwe microbuis. Reserveer het supernatant. Meng een pellet met 1000 microliter pure ethanol, vertex gedurende 30 seconden en centrifugeer vervolgens onder dezelfde omstandigheden.Verzamel het supernatant en meng met het eerste supernatant. Verwijder ethanol uit het monster met zuivere stikstof bij 135 psi. Houd de naald op een centimeter afstand van de bovenkant van de microbuis om monsterverlies te voorkomen en spoel totdat een monster droog is.Resuspend droge monsters in 100 microliter van een één is tot één mengsel van acetonitril met water. Filter door een 45 micro nylon spuitmembraan rechtstreeks in een HPLC injectieflacon micro-insert Injecteer drie microliter monster op UPLC uitgerust met een C 18 omgekeerde fase kolom. Stel de autosamplertemperatuur in op 20 Graden Celsius en de kolomthermostaat op 25 Graden Celsius.Injecteer elk monster in drievoud. Gebruik 0,1% mierenzuur in water als oplosmiddel A en 100% acetonitril als oplosmiddel B.Stel het debiet in op 0,4 millimeter per minuut en een gradiëntprogramma als volgt, nul tot één minuut 10% B, één tot vier minuten 30% B, vier tot zes minuten 38% B, zes tot acht minuten 60% B, acht tot 8,5 minuten 60% B, 8,5 tot negen minuten 10%B. Stel de massaspectrometer in negatieve modus ionisatie in.Gebruik stikstof als drooggas bij 300 graden Celsius en debiet bij 13 liter per minuut. Stel de vernevelingsdruk in op 30 psi. Stel een capillaire spanning in op 4.000 volt, fragmentorspanning op 175 volt en Skimmerspanning op 65 volt.Scan de massa's tussen 100 en 1100 m/z en scan voor de massaspectrometrie massa's tussen 50 en 1000 m/z. Stel gegevensverzameling in de auto MS/MS-modus in. Gebruik de volgende referentiemassa, 119.036 en 966.0007.Zoek naar fenolverbindingen, fenolische metabolieten en andere verbindingen die van belang zijn in de wetenschappelijke literatuur. Open de databasebeheersoftware die is opgenomen in het UPLC-systeem. Selecteer bestand en selecteer vervolgens nieuwe samengestelde persoonlijke databasebibliotheek, PCDL.Selecteer vervolgens, maak nieuwe PCDL. Selecteer het type PCDL LC/MS metabolomics. Stel de naam in voor PCDL.Selecteer vervolgens maken. Selecteer pcdl op de werkbalk en vervolgens de optie Bewerken toestaan. Klik vervolgens op de knop Verbindingen zoeken.Verbindingen kunnen op twee manieren aan de persoonlijke bibliotheek worden toegevoegd, eerst door ze te kopiëren uit de algemene bibliotheek van het instrument. Open hiervoor de bestaande instrumentendatabase die tot nu toe in het gegevensbeheer is opgenomen. Klik op de knop verbindingen zoeken.Voer in de optie Voor één zoekopdracht de samengestelde zoekcriteria in om de samengestelde factor van interesse te vinden. Selecteer in de tabel met samengestelde resultaten de samengestelde factor van belang. Als u meer dan één samengestelde compound wilt selecteren, klikt u op de eerste samengestelde compound, houdt u CTRL ingedrukt en klikt u vervolgens op elke interessante samenstelling.Klik vervolgens met de rechtermuisknop op alle gemarkeerde verbindingen en selecteer Toevoegen aan PCDL. Zoek en selecteer in het nieuwe venster het gespecialiseerde persoonlijke databasebestand. Markeer het vakje met spectra voor verbinding indien aanwezig.Klik op de knop Toevoegen. Selecteer in het nieuwe dialoogvenster Ja om de nieuwe toegevoegde verbindingen te controleren. Selecteer Nee om te blijven zoeken naar meer interessante samenstellingen.Ten tweede kunnen nieuwe verbindingen handmatig worden toegevoegd als ze niet beschikbaar zijn in de algemene bibliotheek van het instrument. Hiervoor open, de gespecialiseerde persoonlijke database. Eenmaal geopend, selecteert u PCDL en vervolgens de optie Bewerken toestaan.Selecteer de optie Compounds bewerken. Klik op de knop Nieuw toevoegen. Vul in het bovenste gedeelte van het venster de informatie van de nieuwe verbinding in.Vul de formule, naam, IUPAC-naam, CAS-nummer, Chemspider-ID en andere id's in. Met behulp van informatie die beschikbaar is in de gratis online bibliotheken, Chemspider, PubChem en Phenol Explorer om de informatie van de nieuwe compound van belang in te vullen. Als u klaar bent, klikt u op de knop Opslaan als nieuw om de nieuwe samengestelde informatie op te slaan in de gespecialiseerde persoonlijke database.Herhaal het proces met alle interessante verbindingen om de gespecialiseerde persoonlijke database te voltooien. Gebruik de kwalitatieve managersoftware van het instrument om fenolverbindingen en fenolische metabolieten te identificeren. Open het voorbeeldbestand.Selecteer in het chromatogrampaneel Definieer chromatogrammen en extraheer het totale ionchromatogram TIC, geëxtraheerd ion-chromatogram van MS EIC en EIC van MS/MS. Selecteer de optie chromatogram integreren. Selecteer in het deelvenster Verbindingen zoeken de optie Opties voor zoeken op formule.Selecteer in het nieuwe venster formulebron en vervolgens de optie database-slashbibliotheek. Zoek de persoonlijke database die eerder is gemaakt en klik op openen. Selecteer de optie voor het matchen van formules en stel een massamatchtolerantie in van vijf delen per miljoen ppm.Selecteer de optie negatieve ionen en selecteer alleen het dialoogvenster min H. Markeer in de optie Resultaten de extract EIC, extraheer opgeschoond spectrum, extraheer onbewerkt spectrum en neem gestructureerde dialoogvensters op. Selecteer de optie voor resultaatfilters.En markeer dan waarschuwen als de score is, stel dan de scorematch in op 80%Dan markeer niet als de score is en stel de score in op 75%Klik vervolgens op de zoekverbindingen per formule om verbindingen van belang in de steekproef te identificeren. Het stapsgewijze proces voor de identificatie van fenolische metabolieten door middel van de semi-gerichte UPLC MS/MS-analyse van plasmamonsters wordt weergegeven in de volgende figuur. Eerst werd het totale ion-chromatogram verkregen met behulp van een zelfgecreëerde PCDL-database die 645 fenolverbindingen en hun metabolieten bevatte, verkregen uit gratis online databases.Vervolgens werden het geëxtraheerde ion-chromatogram en fragmentatiepatroon, of de ionen met minder dan vijf ppm massa, matchtolerantie verkregen. Ten slotte werd de isotopische verdeling van de gedetecteerde pieken vergeleken met die van de theoretische verbindingen. Uit deze analyse werden in totaal 25 fenolische verbindingen en metabolieten geïdentificeerd in de plasmamonsters.Om de effectiviteit van de ontwerpmethode bij de identificatie van de absorberende fenolverbindingen of hun metabolieten te evalueren, werden vijf monsters van de studiedeelnemers die vóór en na de 30-daagse interventie werden verkregen, geanalyseerd. De relatieve abundantie van elke verbinding werd berekend door het gebied onder de curve na behandeling te delen door AUC vóór de behandeling. Tabel vier toont de lijst van 12 fenolverbindingen die een toename van het plasma vertoonden na de 30 dagen durende consumptie van het brosimum alicastrummeel bevattende voedingsmiddelen.Fenylazijnzuur was alleen metaboliet die consistent in hogere concentratie werd gevonden na de behandeling. Glycitine, een geglycosyleerd isoflavon en drie hydroxyfenylvalerinezuur namen toe in drie van de vijf monsters, maar namen af in de andere twee. Gomisin M2, een lignan, werd pas na de voedingsinterventie in drie van de vijf monsters gedetecteerd.De andere fenolverbindingen en metabolieten werden slechts in één monster aangetroffen en pas na de behandeling. De methode die in dit artikel is ontwikkeld, laat zien dat het in de meeste delen goed geschikt was voor het doel waarvoor het was gemaakt. Het monster per behandeling was eenvoudig en effectief.UPLC-scheiding en semi-gerichte MS/MS-identificatie van fenolmetabolieten werden bereikt.

semi-targeted-ultra-high-performance-chromatography-coupled-to-mass

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Non-gerichte metabolietprofilering door ultra-prestatie vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie (UPLC-MS) is een krachtige techniek om metabolisme te onderzoeken. Dit artikel schetst een typische werkstroom die wordt gebruikt voor non-gerichte metabolietprofilering van serum, inclusief monsterorganisatie en -voorbereiding, dataverwerving, data-analyse, kwaliteitscontrole en metabolietidentificatie.

Large Scale Niet-gerichte metaboloom profilering van Serum door Ultra Performance Liquid Chromatography-massaspectrometrie (UPLC-MS)

Ongerichte metabolomics biedt een hypothese genererende momentopname van een metabool profiel. Dit protocol zal de extractie en analyse van metabolieten uit cellen, serum of weefsel tonen. Een reeks van metabolieten worden onderzocht met behulp van vloeistof-vloeistof fase-extractie, microflow UltraPerformance vloeistofchromatografie / hoge-resolutie massaspectrometrie (UPLC-HRMS) gekoppeld aan differentiële analyse software.

Ongerichte Metabolomics uit biologische grondstoffen gebruiken UltraPerformance Liquid Chromatography-hoge resolutie massaspectrometrie (UPLC-HRMS)

Metaboliet profilering is waardevol geweest in de studie van het metabolisme in gezondheid en ziekte. Gebruik te maken van de normale fasen vloeistofchromatografie gekoppeld aan een hoge resolutie massaspectrometrie met polariteit schakelen en een snelle duty cycle, beschrijven we een protocol bij de polaire metabole samenstelling van biologisch materiaal met een hoge gevoeligheid, nauwkeurigheid en resolutie te analyseren.

Een strategie voor de gevoelige, Large Scale Quantitative Metabolomics

De betrouwbaarheid van de resultaten in metabolomics experimenten afhankelijk van de effectiviteit en de reproduceerbaarheid van de monstervoorbereiding. Beschreven is een strenge en diepgaande methode die extractie van metabolieten van biologische vloeistoffen maakt met de mogelijkheid om later te analyseren tot duizenden verbindingen, of gewoon de verbinding klassen van belang.

Multi-step Voorbereiding Techniek om meerdere Metabolite Compound Klassen voor In-diepte en Informatieve Metabolomic Analyse Recover

Hier beschrijven we een hoge gegevensdoorvoer methode voor uitgebreide drug surveillance waarmee voor de betere resolutie en detectie van grote panelen van drugs van misbruik en hun metabolieten, met kwaliteitscontrole op basis van multisegment injectie-capillair elektroforese-massaspectrometrie.

High-throughput en uitgebreide Drug Surveillance met behulp van spectrometrie van de massa van het Multisegment injectie-capillaire elektroforese

Een methode voor de ongerichte analyse van tarwekorrels metabolieten en lipiden wordt gepresenteerd. Het protocol omvat een acetonitril metabolietextractiemethode en omgekeerde fase vloeistofchromatografie-massaspectrometriemethodologie, met acquisitie in positieve en negatieve elektrospray ionisatiemodi.

Ongerichte vloeibare chromatografie-massaspectrometrie-gebaseerde metabolomics analyse van tarwekorrel

Fenolzuren zijn belangrijke fytochemicaliën die aanwezig zijn in volle granen. Ze bezitten bioactieve eigenschappen zoals antioxiderende beschermende functies. Dit werk was gericht op het rapporteren over een gegeneraliseerde methode voor de HPLC-identificatie, schatting van het totale fenolgehalte en bepaling van de antioxidantcapaciteit van fenolzuren in granen en peulvruchten.

Een gegeneraliseerde methode voor het bepalen van de vrij oplosbare fenolzuursamenstelling en antioxidantcapaciteit van granen en peulvruchten

Dit protocol beschrijft de workflow voor metabole etikettering van senescente en niet-delende cellen met gepulste SILAC, ongerichte massaspectrometrie-analyse en een gestroomlijnde berekening van eiwithalfwaardetijden.

Meting van eiwitomloopsnelheden in senescente en niet-delende gekweekte cellen met metabole etikettering en massaspectrometrie

We beschrijven een algemeen protocol dat massaspectrometrie-analyse met hoge resolutie en moleculaire docking integreert in onderzoek naar traditionele Chinese geneeskunde.

Tandem-massaspectrometrie met hoge resolutie voor het bestuderen van chemische bestanddelen van Gynura bicolor DC

Conformationele flexibiliteit speelt een cruciale rol in de eiwit-functie. Hierin beschrijven we het gebruik van tijdsopgeloste electrospray ionisatie massaspectrometrie gekoppeld met waterstof deuterium ruil voor het sonderen van de snelle structurele veranderingen die functie rijden besteld en ontvouwen eiwitten.

Tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium Exchange Massaspectrometrie voor het bestuderen van Protein Structure en Dynamics

Leer een semi-gerichte UPLC-MS/MS-methode om fenolische metabolieten in plasma van oudere volwassenen te detecteren. Deze techniek helpt onderzoekers om de effecten van voedingsinterventies op gezondheid te analyseren.

Semi-gerichte ultra-high-performance chromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie analyse van fenolische metabolieten in plasma van oudere volwassenen (Video) | JoVE Journal

Semi-gerichte ultra-high-performance chromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie analyse van fenolische metabolieten in plasma van oudere volwassenen

Meer video's verkennen