Name: Steekwondletselmodel van het volwassen optische tectum met behulp van zebravissen en medaka voor de vergelijkende analyse van regeneratieve capaciteit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Leer het steekwondletselmodel voor het volwassen optische tectum bij zebravissen en medaka om regeneratieve capaciteit te vergelijken. Deze methode helpt onderzoekers neurale regeneratie te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door JSPS KAKENHI Grant Number 18K14824 en 21K15195 en een interne subsidie van AIST, Japan.

Alle experimentele protocollen werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van het National Institute of Advanced Industrial Science and Technology. Zebravis en medaka werden onderhouden volgens standaardprocedures28.
1. Steekwondletsel in het volwassen optische tectum
<ol><li>Bereid een 0,4% (w / v) tricaïne-stamoplossing voor anesthesie. Los voor een stamoplossing van 100 ml 400 mg tricaïnemethaansulfonaat (zie materiaaltabel) op in 90 ml gedestilleerd water en stel de pH in op 7,0 met behulp van 1 M Tris HCl-buffer (pH 9,0). Zodra de pH is aangepast, voegt u water tot 100 ml toe, maakt u vervolgens de juiste aliquots en bewaart u deze bij -20 °C.</li>
	<li>Om de volwassen zebravis of medaka te verdoven, bereidt u een tricaïne-oplossing van 0,02 % (m/v) door de 0,4 % tricaïne-stamoplossing te verdunnen met visfaciliteitswater.</li>
	<li>Verdoof de vis met 0,02% tricaïne-oplossing; Ze worden verdoofd wanneer ze niet bewegen of reageren op aanraking (1-2 min).</li>
	<li>Plaats de verdoofde vis op een piepschuimen bakje (zie materiaaltabel) en bevestig de vis rechtop tussen twee naalden van 30 G die verticaal in het piepschuim zijn gestoken.</li>
	<li>Houd het vissenlichaam vast om te voorkomen dat de vissenkop beweegt en steek verticaal een naald van 30 G door de schedel in het mediale gebied van een van de optische tectumhelften (figuur 1A, B). De insteekdiepte is ~0,75 mm, bijna gelijk aan de helft van de lengte van de 30 G schuine kant. Deze inbrengdiepte veroorzaakt hersenletsel bij zebravissen en medaka vanwege de vergelijkbare lichaamsgrootte van deze vissen. OPMERKING: Medaka heeft schubben op de schedel. Krab en verwijder de schubben met de naald van 30 G om het steekwondletsel efficiënt en nauwkeurig op te wekken (figuur 1C).</li>
	<li>Breng de gewonde vissen over in een aquarium met vers visfaciliteitswater en verplaats de tank naar het viskweeksysteem zodra ze volledig zijn hersteld van de anesthesie. OPMERKING: Vissen zullen zich herstellen en binnen een paar minuten vrij beginnen te bewegen.</li>
	<li>Voor afstammingsanalyse na het letsel bereidt u vers visfaciliteitswater dat 5 mM bromodeoxyuridine (BrdU) bevat (zie tabel met materialen) en incubeert u de vis vervolgens met deze 5 mM BrdU-oplossing gedurende een vooraf bepaalde hoeveelheid tijd13,19 (zoals bepaald door een experimenteel ontwerp). Ontleed vervolgens deze vissen volgens stap 2 en evalueer brdU-opname en cellijnidentiteit indien van toepassing. OPMERKING: Deze stap is een optionele stap voor analyse van de celafstamming. Om BrdU-signalen te detecteren, voert u het ophalen van antigeen uit zoals weergegeven in stap 4.3.</li>
</ol>2. Hersendissectie
<ol><li>Bereid 0,02% tricaïne-oplossing, een piepschuimen bakje voor dissectie en een spuit van 10 ml met fosfaatgebufferde zoutoplossing (1x PBS) met een verlengbuis en 30 G naalden (zie materiaaltabel) voor intracardiale perfusie.</li>
	<li>Verdoof de gewonde vis op geselecteerde tijdstippen.</li>
	<li>Leg papieren handdoeken op de piepschuimen bak en leg de verdoofde vis op de papieren handdoekjes.</li>
	<li>Houd het vissenlichaam op zijn plaats door verticaal twee naalden van 30 G aan weerszijden van de anaalvin in te brengen (figuur 2A).</li>
	<li>Maak een ventrale incisie van de anus naar het hart (figuur 2B) en houd het hart zichtbaar door nog eens twee naalden van 30 G aan elke kant van dit orgaan in te brengen (figuur 2C). OPMERKING: Het hart is bedekt met de zilverachtige epitheellaag van de hypodermis in zowel zebravis als medaka (figuur 2C).</li>
	<li>Verwijder voorzichtig de zilveren epitheellaag met de punt van de tang (figuur 2D).</li>
	<li>Steek de naald van 30 G in de ventrikel, houd de schuine kant omhoog en maak een incisie in het atrium met behulp van de tang (figuur 2E). Druk voorzichtig op de spuit om de 1x PBS in te drukken en bevestig dat het atrium het bloed heeft gespoeld. OPMERKING: Om te voorkomen dat de naald de ventrikel binnendringt, steekt u de naald voorzichtig in op de diepte van de halve schuine kant en past u vervolgens de inbrengdiepte aan. Als de perfusie goed is gedaan, worden kieuwen wit (figuur 2F, G).</li>
	<li>Stop de perfusie nadat het bloed is afgevoerd en de kieuwen wit worden.</li>
	<li>Verwijder de naalden die het vislichaam op zijn plaats bevestigen en bevestig de vis met de ventrale kant naar beneden (figuur 2H). Knip het ruggenmerg door en verwijder de schedel van het optische tectum en telencephalon (figuur 2I). Snijd vervolgens de oogzenuwen door en ontleed de hersenen zorgvuldig. OPMERKING: Pas op voor de oogzenuwen tijdens de dissectie omdat de zenuwen verbonden zijn met het tectum. Wanneer de oogzenuw wordt getrokken, kan het optische tectum worden losgemaakt van de hersenen. Als de bloedverwijdering niet volledig is, zien de hersenen er lichtroze uit (de rechterhersenhelft in figuur 2J).</li>
	<li>Breng de hersenen over in buisjes van 1,5 ml met 1 ml 4% paraformaldehyde in 1x PBS en fixeer ze 's nachts bij 4 °C.</li>
</ol>3. Bereiding van bevroren secties
<ol><li>Was de vaste hersenen drie keer in 1x PBS gedurende elk 5 minuten.</li>
	<li>Om de hersenen te cryoprotecteren, brengt u ze over in buisjes van 1,5 ml met 1 ml 30% (w / v) sucrose in 1x PBS en incubeert u ze een nacht bij 4 °C. Bereid de inbeddingsverbinding (2:1 mengsel van OCT-verbinding en 30% sucrose, zie materiaaltabel) door 30 ml OCT en 15 ml 30% sacharose te combineren. Bewaar dit bij 4 °C. OPMERKING: Om de bubbels uit de gemengde verbinding te verwijderen, centrifugeert u de buizen van 50 ml gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur op 10.000 x g of plaatst u de buizen een nacht rechtop.</li>
	<li>Incubeer een aluminium blok 's nachts bij -80 °C om de cryomold te koelen (zie Materiaaltabel) onmiddellijk nadat de ontleedde hersenen zijn ingebed in de cryomold met de inbeddingsverbinding. OPMERKING: Vloeibare stikstof kan ook worden gebruikt om het aluminium blok te koelen. In dat geval moet het aluminiumblok in een piepschuimen doos worden geplaatst die is gevuld met voldoende vloeibare stikstof om het aluminiumblok vlak voor inbedding te bedekken. Nadat u de sublimatie van vloeibare stikstof hebt bevestigd, plaatst u de cryomold op het voorgekoelde aluminiumblok. Het is beter om te bevestigen hoeveel cryomolds tegelijkertijd op het aluminium blok kunnen worden geplaatst. Het is raadzaam om vloeibare stikstof of een extra voorgekoeld blok te gebruiken om voldoende ruimte te bieden om alle monsters snel te koelen.</li>
	<li>Doe het voorgekoelde aluminium blok in een piepschuimen doos. Gebruik een piepschuimen doos met een deksel om te voorkomen dat het aluminium blok opwarmt.</li>
	<li>Voor coronale secties sluit u de hersenen in een cryomold in en past u de oriëntatie aan met behulp van een tang onder de microscoop (figuur 3A).</li>
	<li>Plaats de cryomold op het voorgekoelde aluminium blok in de piepschuimdoos en laat de OCT-verbinding bevriezen (figuur 3B). Wanneer de OCT-verbinding begint te bevriezen, wordt deze wit.</li>
	<li>Breng een kleine cirkel van OCT-verbinding aan op een monsterschijf en monteer het cryoblok om het cryoblok aan de monsterschijf te bevestigen.</li>
	<li>Plaats de monsterschijf in de cryostaat en vries de OCT-verbinding volledig in.</li>
	<li>Plaats de monsterschijf op de monsterkop in de cryostaat.</li>
	<li>Stel de oriëntatie van het cryoblok in en trim de OCT om eventuele extra gebieden te verwijderen. OPMERKING: Pas de oriëntatie van het snijvlak aan tijdens het snijden van het telencephalon. Het mes is uitgerust met een cryostaat. Het is mogelijk om de oriëntatie van het snijvlak aan te passen door de hoek van de monsterkop te veranderen.</li>
	<li>Snijd 14 μm dikke seriële secties door het hele optische tectum met behulp van een cryostaat. Bewaar de dia's bij -25 °C. OPMERKING: Langdurige opslag moet bij -80 °C zijn.</li>
</ol>4. Fluorescerende immunostaining
<ol><li>Droog glas schuift gedurende 30 minuten in een schuifrek bij kamertemperatuur (RT). Was dia's in 1x PBS gedurende 30 min bij RT. Als immunostaining met anti-PCNA- of BrdU-antilichamen moet worden uitgevoerd, gaat u verder met stap 4.2 of stap 4.3.</li>
	<li>Bereid 500 ml natriumcitraat van 10 mM in een bekerglas van 500 ml en verwarm de citraatbuffer tot 85 °C op een magnetische roerder met hete plaat, plaats de dia's vervolgens in een schuifkleuringsrek en incubeer het rek in de citraatbuffer bij 85 °C gedurende 30 minuten. Om koken te voorkomen, houdt u de temperatuur rond de 85 °C. Na het ophalen van antigeen, was de dia's drie keer in 0,1% Triton in 1x PBS (PBSTr), waarbij elke wasbeurt 5 minuten duurde bij RT. OPMERKING: Deze stap is een optionele stap voor het prolifereren van het ophalen van celkernantigeen (PCNA).</li>
	<li>Bereid een 2 N HCl-oplossing door 12 N HCl in gedestilleerd water te verdunnen. Teken met behulp van een vloeistofblokker (zie materiaaltabel) een lijn als een hydrofobe barrière om de 2 N HCl-oplossing rond de secties te houden.<ol><li>Plaats de dia's op immunokleurbakken en breng 200-300 μL van de 2N HCl-oplossing aan. Incubeer de trays op 37 °C gedurende 30 min. Na het ophalen van antigeen, driemaal wassen in 0,1 % PBSTr waarbij elke wasbeurt 5 minuten bij RT duurt. OPMERKING: Deze stap is een optionele stap voor het ophalen van BrdU-antigeen.</li>
	</ol></li>
	<li>Absorbeer en verwijder de resterende oplossing met keukenpapier. Gebruik vervolgens een vloeistofblokker om een hydrofobe barrière te tekenen om de antilichaamoplossing zo nodig rond de secties te houden.</li>
	<li>Plaats de dia's op trays en breng 200-300 μL blokkeeroplossing, 3% (v/v) paardenserum in PBSTr) aan op elke dia en incuber de dia's gedurende 1 uur bij RT.</li>
	<li>Was de secties met PBSTr gedurende 5 minuten bij RT en herhaal dit drie keer.</li>
	<li>Bereid de primaire antilichamen (zie tabel met materialen) met behulp van de blokkerende oplossing (200-300 μl antilichaamoplossing voor elke dia). Verwijder de resterende PBSTr met keukenpapier en plaats de dia's op de immunostaining-trays. Breng de primaire antilichaamoplossing aan op elke dia en incubeer trays 's nachts bij 4 °C.</li>
	<li>Was de secties met PBSTr gedurende 5 minuten bij RT en herhaal dit drie keer.</li>
	<li>Bereid fluorescerende secundaire antilichaamoplossing (zie materiaaltabel) met behulp van de blokkeringsbuffer (1:500). Verwijder de resterende PBSTr met keukenpapier en plaats de dia's op de immunostaining-trays. Breng de secundaire antilichaamoplossing aan op elke schuif- en schaduwbakken met aluminiumfolie. Incubeer gedurende 1-2 uur bij RT.</li>
	<li>Was de secties met PBSTr gedurende 5 minuten bij RT drie keer zonder ze bloot te stellen aan licht.</li>
	<li>Bereid de Hoechst-oplossing (1:500 verdunning in 1x PBS, zie materiaaltabel) voor nucleaire kleuring. Verwijder de resterende PBSTr met keukenpapier en plaats de dia's op de immunostaining-trays. Breng de Hoechst-oplossing aan op elke dia en bedek de trays met aluminiumfolie. Incubeer gedurende 30 minuten bij RT.</li>
	<li>Was de secties met 1x PBS gedurende 10 minuten bij RT zonder ze bloot te stellen aan licht.</li>
	<li>Absorbeer en verwijder de resterende 1x PBS met keukenpapier en monteer de secties op dia's met behulp van een in water oplosbaar montagemedium (zie materiaaltabel) voor fluorescerende immunokleuring. Plaats langzaam een coverslip van 24 x 45 mm op de secties. Bewaren bij 4 °C, zonder de dia's bloot te stellen aan licht.</li>
	<li>Observeer en beeld de secties onder fluorescerende microscopie of confocale microscopie.</li>
</ol>

<ol><li>Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+regrowth+after+spinal+cord+transection+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish.</a> Journal of Comparative Neurology. 377 (4), 577-595 (1997).</li>
<li>Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+retinal+stem+cells+and+their+niches+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish.</a> BMC Developmental Biology. 6, 36(2006).</li>
<li>März, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strähle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+response+following+stab+injury+in+the+adult+zebrafish+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon.</a> Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).</li>
<li>Kang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+tissue+repair+by+regeneration+enhancer+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modulation of tissue repair by regeneration enhancer elements.</a> Nature. 532 (7598), 201-206 (2016).</li>
<li>Simões, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+directly+contribute+collagen+to+scar+formation+during+zebrafish+heart+regeneration+and+mouse+heart+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Macrophages directly contribute collagen to scar formation during zebrafish heart regeneration and mouse heart repair.</a> Nature Communications. 11 (1), 600(2020).</li>
<li>Hoang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulatory+networks+controlling+vertebrate+retinal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration.</a> Science. 370 (6519), (2020).</li>
<li>Alunni, A., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+view+of+regenerative+neurogenesis+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates.</a> Development. 143 (5), 741-753 (2016).</li>
<li>Diotel, N., Lübke, L., Strähle, U., Rastegar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+and+distinct+features+of+adult+neurogenesis+and+regeneration+in+the+telencephalon+of+zebrafish+and+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Common and distinct features of adult neurogenesis and regeneration in the telencephalon of zebrafish and mammals.</a> Frontiers in Neuroscience. 14, 568930(2020).</li>
<li>Labusch, M., Mancini, L., Morizet, D., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+and+divergent+features+of+adult+neurogenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Conserved and divergent features of adult neurogenesis in zebrafish.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 525(2020).</li>
<li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+reparative+phenotypes+between+zebrafish+and+medaka+after+cardiac+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Differential reparative phenotypes between zebrafish and medaka after cardiac injury.</a> Developmental Dynamics. 243 (9), 1106-1115 (2014).</li>
<li>Lai, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+analyses+in+zebrafish+and+medaka+reveal+that+harnessing+the+immune+response+promotes+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Reciprocal analyses in zebrafish and medaka reveal that harnessing the immune response promotes cardiac regeneration.</a> eLife. 6, 25605(2017).</li>
<li>Lust, K., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+the+regenerative+potential+of+M%C3%BCller+glia+cells+in+a+regeneration-deficient+retina%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Activating the regenerative potential of Müller glia cells in a regeneration-deficient retina.</a> eLife. 7, 32319(2018).</li>
<li>Shimizu, Y., Kawasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regenerative+capacity+of+the+optic+tectum+of+adult+medaka+and+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential regenerative capacity of the optic tectum of adult medaka and zebrafish.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 686755(2021).</li>
<li>Adolf, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+and+acquired+features+of+adult+neurogenesis+in+the+zebrafish+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon.</a> Developmental Biology. 295 (1), 278-293 (2006).</li>
<li>Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+and+neurogenesis+in+the+adult+zebrafish+brain%3A+origin%2C+proliferation+dynamics%2C+migration+and+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate.</a> Developmental Biology. 295 (1), 263-277 (2006).</li>
<li>Alunni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+neural+stem+cells+in+the+medaka+optic+tectum+proliferation+zones%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Evidence for neural stem cells in the medaka optic tectum proliferation zones.</a> Developmental Neurobiology. 70 (10), 693-713 (2010).</li>
<li>Kuroyanagi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+zones+in+adult+medaka+%28Oryzias+latipes%29+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Proliferation zones in adult medaka (Oryzias latipes) brain.</a> Brain Research. 1323, 33-40 (2010).</li>
<li>Ito, Y., Tanaka, H., Okamoto, H., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+neural+stem+cells+and+their+progeny+in+the+adult+zebrafish+optic+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum.</a> Developmental Biology. 342 (1), 26-38 (2010).</li>
<li>Shimizu, Y., Ueda, Y., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+regulates+proliferation+and+differentiation+of+radial+glia+in+regenerative+processes+after+stab+injury+in+the+optic+tectum+of+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling regulates proliferation and differentiation of radial glia in regenerative processes after stab injury in the optic tectum of adult zebrafish.</a> Glia. 66 (7), 1382-1394 (2018).</li>
<li>Ueda, Y., Shimizu, Y., Shimizu, N., Ishitani, T., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+sonic+hedgehog+and+notch+signaling+in+regenerative+neurogenesis+in+adult+zebrafish+optic+tectum+after+stab+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Involvement of sonic hedgehog and notch signaling in regenerative neurogenesis in adult zebrafish optic tectum after stab injury.</a> Journal of Comparative Neurology. 526 (15), 2360-2372 (2018).</li>
<li>Kiyooka, M., Shimizu, Y., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+inhibition+promotes+regenerative+neurogenesis+after+stab+wound+injury+in+the+adult+zebrafish+optic+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase inhibition promotes regenerative neurogenesis after stab wound injury in the adult zebrafish optic tectum.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 529 (2), 366-371 (2020).</li>
<li>Shimizu, Y., Kawasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetyltransferase+EP300+regulates+the+proliferation+and+differentiation+of+neural+stem+cells+during+adult+neurogenesis+and+regenerative+neurogenesis+in+the+zebrafish+optic+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Histone acetyltransferase EP300 regulates the proliferation and differentiation of neural stem cells during adult neurogenesis and regenerative neurogenesis in the zebrafish optic tectum.</a> Neuroscience Letters. 756, 135978(2021).</li>
<li>Shimizu, Y., Kiyooka, M., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analyses+reveal+IL6%2FStat3+signaling+involvement+in+radial+glia+proliferation+after+stab+wound+injury+in+the+adult+zebrafish+optic+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analyses reveal IL6/Stat3 signaling involvement in radial glia proliferation after stab wound injury in the adult zebrafish optic tectum.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 668408(2021).</li>
<li>Lindsey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midbrain+tectal+stem+cells+display+diverse+regenerative+capacities+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Midbrain tectal stem cells display diverse regenerative capacities in zebrafish.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4420(2019).</li>
<li>Yu, S., He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+cell-cycle+entry+and+cell-state-dependent+fate+outputs+of+injury-reactivated+tectal+radial+glia+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Stochastic cell-cycle entry and cell-state-dependent fate outputs of injury-reactivated tectal radial glia in zebrafish.</a> eLife. 8, 48660(2019).</li>
<li>Bisese, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acute+transcriptome+response+of+the+midbrain%2Fdiencephalon+to+injury+in+the+adult+mummichog+%28Fundulus+heteroclitus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain%22%5BJournal%5D)">The acute transcriptome response of the midbrain/diencephalon to injury in the adult mummichog (Fundulus heteroclitus).</a> Molecular Brain. 12 (1), 119(2019).</li>
<li>Schmidt, R., Beil, T., Strähle, U., Rastegar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stab+wound+injury+of+the+zebrafish+adult+telencephalon%3A+a+method+to+investigate+vertebrate+brain+neurogenesis+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Stab wound injury of the zebrafish adult telencephalon: a method to investigate vertebrate brain neurogenesis and regeneration.</a> Journal of Visualized Experiments. (4), e51753(2014).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29+5th+ed%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio) 5th ed</a>. , University of Oregon Press. (2007).</li>
<li>Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+of+neuroepithelial-like+and+radial+glia-like+progenitor+cells+in+cerebellar+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration.</a> Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).</li>
<li>Curado, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+targeted+cell+ablation+in+zebrafish%3A+a+new+tool+for+regeneration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies.</a> Developmental Dynamics. 236 (4), 1025-1035 (2007).</li>
<li>Shimizu, Y., Ito, Y., Tanaka, H., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radial+glial+cell-specific+ablation+in+the+adult+zebrafish+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Radial glial cell-specific ablation in the adult zebrafish brain.</a> Genesis. 53 (7), 431-439 (2015).</li>
<li>Godoy, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+neurons+regenerate+following+chemogenetic+ablation+in+the+olfactory+bulb+of+adult+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic neurons regenerate following chemogenetic ablation in the olfactory bulb of adult zebrafish (Danio rerio).</a> Scientific Reports. 10 (1), 12825(2020).</li>
<li>Sawahata, M., Izumi, Y., Akaike, A., Kume, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+brain+ischemia-reperfusion+model+induced+by+hypoxia-reoxygenation+using+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Bulletin%22%5BJournal%5D)">In vivo brain ischemia-reperfusion model induced by hypoxia-reoxygenation using zebrafish larvae.</a> Brain Research Bulletin. 173, 45-52 (2021).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier wordt een reeks methoden beschreven die kunnen worden gebruikt om steekwondletsels in het optische tectum te induceren met behulp van een naald om de evaluatie van RGC-proliferatie en differentiatie na hersenletsel te vergemakkelijken. Naaldgemedieerde steekwonden zijn een eenvoudige, efficiënt geïmplementeerde methode die op veel experimentele monsters kan worden toegepast met behulp van een standaardset gereedschappen. Steekwondletselmodellen voor verschillende regio's van het zebravisbrein zijn ontwikkeld <sup cl...

Zebravissen (Danio rerio) hebben een verhoogd vermogen om hun centrale zenuwstelsel (CZS) te regenereren in vergelijking met andere zoogdieren 1,2,3. Onlangs, om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan deze verhoogde regeneratieve capaciteit beter te begrijpen, zijn vergelijkende analyses van weefselregeneratie met behulp van next-generation sequencing-technologie uitgevoerd 4,5,6. De hersenstructuren bij zebravissen en tetrapoden zijn heel verschillend 7,8,9. Dit betekent dat verschillende hersenletselmodellen met behulp van kleine vissen met vergelijkbare hersenstructuren en biologische kenmerken zijn ontwikkeld om het onderzoek naar de onderliggende moleculaire mechanismen die bijdragen aan deze verhoogde regeneratieve capaciteit te vergemakkelijken.
Bovendien is medaka (Oryzias latipes) een populair proefdier met een lage capaciteit voor hart- en neuronale regeneratie10,11,12,13 in vergelijking met zebravissen. Zebravissen en medaka hebben vergelijkbare hersenstructuren en niches voor volwassen neurale stamcellen (NSC's)14,15,16,17. Bij zebravissen en medaka omvat het optische tectum twee soorten NSC's, neuro-epitheliale-achtige stamcellen en radiale gliacellen (RGC's)15,18. Een steekwondletsel voor het optische tectum van volwassen zebravissen werd eerder ontwikkeld en dit model werd gebruikt om de moleculaire mechanismen te onderzoeken die de hersenregeneratie bij deze dieren reguleren 19,20,21,22,23. Dit jongvolwassen zebravis steekwond letsel model geïnduceerde regeneratieve neurogenese van RGCs 19,24,25. Dit steekwondletsel in het optische tectum is een robuuste en reproduceerbare methode 13,19,20,21,22,23,24,25. Toen hetzelfde letselmodel werd toegepast op volwassen medaka, werd de lage neurogene capaciteit van RGC's in medaka optisch tectum onthuld via de vergelijkende analyse van RGC-proliferatie en differentiatie na letsel13.
Steekwondletselmodellen in het optische tectum zijn ook ontwikkeld in mummichog-modellen26, maar details van het tectumletsel zijn niet goed gedocumenteerd in vergelijking met telencefalisch letsel27. Het steekwondletsel in het optische tectum met behulp van zebravissen en medaka maakt het mogelijk om de differentiële cellulaire responsen en genexpressie tussen soorten met differentieel regeneratief vermogen te onderzoeken. Dit protocol beschrijft hoe een steekwondletsel in het optische tectum moet worden uitgevoerd met behulp van een injectienaald. Deze methode kan worden toegepast op kleine vissen zoals zebravissen en medaka. De processen voor monstervoorbereiding voor histologische analyse en cellulaire proliferatie- en differentiatieanalyse met behulp van fluorescerende immunohistochemie en cryosecties worden hier uitgelegd.

<table><tbody><tr><td>10 mL-spuit</td><td>TERUMO</td><td>SS-10ESZ</td><td></td></tr><tr><td>1M Tris-HCl (pH 9.0)</td><td>NIPPON GENE</td><td>314-90381</td><td></td></tr><tr><td>30 G naald</td><td>Dentronics</td><td>HS-2739A</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyde Fosfaat Buffer Oplossing</td><td>Wako</td><td>163-20145</td><td></td></tr><tr><td>Aluminium blok</td><td></td><td></td><td>115 x 80 x 37 mm (B x D x H) is voldoende om 6 cryomolds in te vriezen</td></tr><tr><td>Anti-BLBP</td><td>Millipore</td><td>ABN14</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Anti-BrdU</td><td>Abcam</td><td>ab1893</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Anti-HuC</td><td>Invitrogen</td><td>A21271</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Anti-PCNA</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-56</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Brmodeoxyuridine</td><td>Wako</td><td>023-15563</td><td></td></tr><tr><td>Confocale microscoop C1 plus</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryomold</td><td>Sakura Finetek Japan</td><td>4565</td><td>10 x 10 x 5 mm (B x D x H)</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM1960</td><td></td></tr><tr><td>Danio rerio WT stammen RW</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Verlengingsbuis</td><td>TERUMO</td><td>SF-ET3520</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount (TM) Waterige Montage Medium, voor gebruik met fluorescerende kleurstof-gekleurde weefsels</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>F4680-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Pincet</td><td>DUMONT</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Geit anti-Muis IgG (H+L) Hoog Geadsorbeerd Secundair Antilichaam, Alexa Fluor Plus 488</td><td>Invitrogen</td><td>A32723</td><td></td></tr><tr><td>Geit anti-Konijn IgG (H+L) Hoog Geadsorbeerd Secundair Antilichaam, Alexa Fluor 546</td><td>Invitrogen</td><td>A11035</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 oplossing</td><td>Dojindo</td><td>23491-52-3</td><td></td></tr><tr><td>Zoutzuur</td><td>Wako</td><td>080-01066</td><td></td></tr><tr><td>Incuberingskamer voor 10 slides Donker Oranje</td><td>COSMO BIO CO., LTD.</td><td>10DO</td><td></td></tr><tr><td>MAS coat glijdend glas</td><td>Matsunami glass</td><td>MAS-01</td><td></td></tr><tr><td>Micro dekglas</td><td>Matsunami glass</td><td>C024451</td><td></td></tr><tr><td>Microscopie</td><td>Nikon</td><td>SMZ745T</td><td></td></tr><tr><td>Normale paard serum blokkeringsoplossing</td><td>VECTOR LABATORIES</td><td>S-2000-20</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T Verbinding</td><td>Sakura Finetek Japan</td><td>83-1824</td><td></td></tr><tr><td>Oryzias latipes WT stammen Cab</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAP Pen Super-Liquid Blocker</td><td>DAIDO SANGYO</td><td>PAP-S</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat Buffered Saline (PBS) Tabletten, pH 7.4</td><td>TaKaRa</td><td>T9181</td><td></td></tr><tr><td>Styrofoam lade</td><td></td><td></td><td>100 x 100 x 10 mm (B x D x H) Styrofoam plaat is beschikbaar als lade</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Wako</td><td>196-00015</td><td>30 % (w/v) Sucrose in PBS</td></tr><tr><td>Tricaine (MS-222)</td><td>nacarai tesque</td><td>14805-24</td><td></td></tr><tr><td>Trisodium Citraat Dihydraat</td><td>Wako</td><td>191-01785</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Wako</td><td>04605-250</td><td></td></tr></tbody></table>

steekwondletselmodel van het volwassen optische tectum met behulp van zebravissen en medaka voor de vergelijkende analyse van regeneratieve capaciteit

Stab Wound Injury Model of the Adult Optic Tectum Using Zebrafish and Medaka for the Comparative Analysis of Regenerative Capacity

Terwijl zebravissen een superieur vermogen hebben om hun centrale zenuwstelsel (CZS) te regenereren, heeft medaka een lager CZS-regeneratief vermogen. Een hersenletselmodel werd ontwikkeld in het volwassen optische tectum van zebravissen en medaka en vergelijkende histologische en moleculaire analyses werden uitgevoerd om de moleculaire mechanismen op te helderen die de hoge regeneratieve capaciteit van dit weefsel bij deze vissoorten reguleren. Hier wordt een steekwondletselmodel gepresenteerd voor het volwassen optische tectum met behulp van een naald en histologische analyses voor proliferatie en differentiatie van de neurale stamcellen (NSC's). Een naald werd handmatig ingebracht in het centrale gebied van het optische tectum, en vervolgens werden de vissen intracardiaal doordrenkt en hun hersenen werden ontleed. Deze weefsels werden vervolgens gecryosectie en geëvalueerd met behulp van immunostaining tegen de juiste NSC-proliferatie- en differentiatiemarkers. Dit tectumletselmodel biedt robuuste en reproduceerbare resultaten in zowel zebravissen als medaka, waardoor NSC-responsen na letsel kunnen worden vergeleken. Deze methode is beschikbaar voor kleine teleosts, waaronder zebravissen, medaka en Afrikaanse killivissen, en stelt ons in staat om hun regeneratieve capaciteit te vergelijken en unieke moleculaire mechanismen te onderzoeken.

Steekwondletsel in het optische tectum met behulp van naaldinbrenging in de rechterhersenhelft (figuur 1, figuur 4A en figuur 5A) induceert verschillende cellulaire reacties, waaronder radiale gliacelproliferatie (RGC) en het genereren van pasgeboren neuronen. Evenzo werden verouderde populaties van zebravissen en medaka gebruikt om eventuele verouderingseffecten in de regeneratieve respons tegen te gaan. Vervolgens werd fluorescere...

Een mechanisch hersenletselmodel bij de volwassen zebravis wordt beschreven om de moleculaire mechanismen te onderzoeken die hun hoge regeneratieve capaciteit reguleren. De methode legt uit om een steekwondletsel te creëren in het optische tectum van meerdere soorten kleine vissen om de regeneratieve reacties te evalueren met behulp van fluorescerende immunostaining.

Steekwondletselmodel van het volwassen optische tectum met behulp van zebravissen en medaka voor de vergelijkende analyse van regeneratieve capaciteit

While zebrafish have a superior capacity to regenerate their central nervous system (CNS), medaka has a lower CNS regenerative capacity. A brain injury ...

Steekwondletsel is een mechanische letselmethode die niet-specifieke celablatie induceert. Deze methode vergemakkelijkt de evaluatie van RGC-proliferatie en differentiatie na hersenletsel. Naaldgemedieerd steekwondletsel is een eenvoudige, efficiënt geïmplementeerde methode om hersenletsel op te wekken.Deze methode kan op veel experimentele monsters worden toegepast met behulp van een standaardset gereedschappen. Het regeneratieve vermogen van zebravissen werd geïllustreerd met behulp van het steekwondletselmodel. Nieuwe inzichten in moleculaire mechanismen die neuronale regeneratie reguleren, dragen bij aan regeneratieve therapie in het centrale zenuwstelsel.Begin met het plaatsen van een verdoofde volwassen zebravis of medaka op een piepschuimen bakje. Bevestig de vis rechtop tussen twee naalden van 30 gauge die verticaal in het piepschuim zijn gestoken. Houd het vissenlichaam vast om te voorkomen dat de vissenkop beweegt en steek vervolgens verticaal een naald van 30 gauge door de schedel in het mediale gebied van een van de optische tectumbollen.Breng vervolgens de gewonde vis over in een aquarium met vers visfaciliteitswater. Zodra de vissen volledig zijn hersteld van de anest

stab-wound-injury-model-adult-optic-tectum-using-zebrafish-medaka-for

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

This video demonstrates a procedure to induce retinal degeneration in adult zebrafish using laser injury. The laser targets photoreceptor cells in the retina, triggering cell death and a degenerative process. This damage activates Müller glia (MG) cells, leading to their dedifferentiation into stem cell progenitors that aid in retinal regeneration.

Modeling Retinal Degeneration and Regeneration in Zebrafish Using a Focal Laser Injury

Na spinale doorsnijding, volwassen zebravissen hebben functioneel herstel van zes weken na het letsel. Om te profiteren van larvale transparantie en sneller herstel nemen, presenteren we een methode voor het doorsnijden van de larvale ruggenmerg. Na doorsnijding, zien we zintuiglijke herstel vanaf 2 dagen na het letsel, en C-bocht beweging door 3 dagen na het letsel.

Spinal Cord doorsnijding in het larvale zebravis

Om licht te werpen op de cellulaire en moleculaire mechanismen van neurogenese en regeneratie bij volwassen zebravissen, ontwikkelden we een protocol voor invasieve chirurgie dat mechanische verwondingen veroorzaakt in het volwassen telencephalon van de zebravis en daaropvolgend bewaken van veranderingen in de 'gestoken' hemisfeer door middel van immunohistochemie of in situ hybridisatie.

Steekwond Letsel van de zebravis Adult Telencephalon: Een methode om Onderzoek gewervelde Brain Neurogenese and Regeneration

Hier presenteren we een betrouwbare methode om regeneratie van volwassen nieren te bestuderen door acute nierbeschadiging te induceren door gentamicine-injectie. We tonen aan dat de schade afhankelijk is van de gentamicine-dosering en de omgevingstemperatuur door middel van in situ hybridisatie om lhx1a+ zich ontwikkelende nieuwe nephronen te labelen.

Nier Regeneratie in Adult zebravis door Gentamicin geïnduceerd letsel

Dit artikel beschrijft een methode voor het creëren van een mechanische vaatbeschadiging bij zebravisembryo's. Dit verwondingsmodel biedt een platform voor het bestuderen van hemostasis, verwondingsgerelateerde ontsteking en wondgenezing in een organisme dat bij uitstek geschikt is voor real-time microscopie.

Mechanische vatverwonding in zebravis embryo&#39;s

Zebravis netvlies regeneratie is meestal onderzocht met behulp van vaste netvliezen. Echter, dynamische processen zoals interkinetic nucleaire migratie optreden tijdens de regeneratieve respons en vereisen voor live-cell imaging om de onderliggende mechanismen te onderzoeken. We beschrijven hier de cultuur en beeldvorming voorwaarden te controleren Interkinetic Nuclear Migratie (INM) in real-time met behulp van multiphoton microscopie.

Cultuur van volwassen transgene zebravis Retina Explantaten voor Live-cell imaging van Multiphoton Microscopy

De zebravis is een populaire diermodel te bestuderen van de mechanismen van Retina degeneratie/regeneratie in gewervelden. Dit protocol beschrijft een methode om gelokaliseerde letsel verstoren het buitenste netvlies met minimale schade aan het innerlijke netvlies veroorzaken. Vervolgens controleren we in vivo de retinale morfologie en de reactie hierop van Müller, glia hele netvlies regeneratie.

Müller Glia cel activatie in een Laser-geïnduceerde Retina degeneratie en regeneratie Model in de zebravis

Hier beschrijven we 3 volwassen zebrafish letsel modellen en hun gecombineerd gebruik met immunosuppressieve medicamenteuze behandeling. Wij bieden begeleiding over de beeldvorming van het herstel van de weefsels en bot mineralisatie daarin opsporen.

Volwassen Zebrafish letsel modellen te bestuderen van de effecten van prednisolon in het herstel van botweefsel

We hebben het Marmarou-gewichtsverliesmodel voor volwassen zebravissen aangepast om een breed scala aan pathologieën te onderzoeken na traumatisch hersenletsel met stompe kracht (TBI) en de mechanismen die ten grondslag liggen aan de daaropvolgende neuronale regeneratie. Dit Botte kracht TBI-model is schaalbaar, induceert een milde, matige of ernstige TBI en vat heterogeniteit van letsel samen die wordt waargenomen bij menselijke TBI.

Een schaalbaar model om de effecten van blunt-force letsel bij volwassen zebravissen te bestuderen

Het artikel legt uit hoe de ogen chirurgisch kunnen worden verwijderd van levende zebravislarven als de eerste stap om te onderzoeken hoe retinale input de groei en ontwikkeling van het optische tectum beïnvloedt. Daarnaast biedt het artikel informatie over larvale anesthesie, fixatie en hersendissectie, gevolgd door immunohistochemie en confocale beeldvorming.

Oogverwijdering bij levende zebravislarven om innervatie-afhankelijke groei en ontwikkeling van het visuele systeem te onderzoeken

Dit protocol richt zich op het beschadigen van het oculaire oppervlak van zebravissen door middel van slijtage om de daaropvolgende wondsluiting op cellulair niveau te beoordelen. Deze benadering maakt gebruik van een oculaire braam om het hoornvliesepitheel gedeeltelijk te verwijderen en maakt gebruik van scanning elektronenmicroscopie om veranderingen in de celmorfologie tijdens wondsluiting te volgen.

Zebrafish Corneal Wound Healing: van abrasie tot wond closure imaging analyse

Leer het steekwondletselmodel voor het volwassen optische tectum bij zebravissen en medaka om regeneratieve capaciteit te vergelijken. Deze methode helpt onderzoekers neurale regeneratie te bestuderen.

Steekwondletselmodel van het volwassen optische tectum met behulp van zebravissen en medaka voor de vergelijkende analyse van regeneratieve capaciteit (Video) | JoVE Journal

Steekwondletselmodel van het volwassen optische tectum met behulp van zebravissen en medaka voor de vergelijkende analyse van regeneratieve capaciteit

Meer video's verkennen