Microdissectie en dissociatie van de murine-eileider: individuele segmentidentificatie en eencellige isolatie
4 november 2021
Een methode voor microdissectie van de eileider van de muis die het mogelijk maakt om de afzonderlijke segmenten te verzamelen met behoud van RNA-integriteit wordt gepresenteerd. Bovendien wordt een niet-enzymatische ovductale celdissociatieprocedure beschreven. De methoden zijn geschikt voor latere gen- en eiwitanalyse van de functioneel verschillende eileidersegmenten en gedissocieerde eileidercellen.
Verschillende eileidersegmenten hebben verschillende fysiologische functies en zijn differentieel gevoelig voor pathologische veranderingen. Identificatie van de verschillende segmenten in een zeer kleine eileider bij muizen is een uitdaging, net als de productie van een goede opbrengst van goed gedifferentieerde cellen door weefseldissociatie. In deze video zullen we laten zien hoe we de eileider van de muis kunnen ontkoppelen, de verschillende segmenten kunnen herkennen zodat ze individueel kunnen worden geanalyseerd en ten slotte hoe een relatief hoge opbrengst van gedifferentieerde gedissocieerde cellen kan worden geproduceerd.
Een beter begrip van de omgeving die specifiek is voor het ampulla kan de in-vitrofertilisatietechnieken verbeteren. Door het infundibulum te contrasteren met andere segmenten, kunnen we ook de neiging van het infundibulum voor kwaadaardige transformatie beter begrijpen. De eencellige dissociatieprocedure bevrijdt stromale, evenals epitheelcellen uit de eileider.
Onze methode biedt ook mogelijkheden om immuun-, gladde spier- en epitheelcelbijdragen aan de fysiologie en pathologie van de eileider afzonderlijk te analyseren. Werken onder een dissectiemicroscoop kan in het begin moeilijk zijn. Ik zou adviseren om te oefenen met een grotere buis zoals de baarmoeder om ervoor te zorgen dat je gereedschap geschikt is voor de eileider microdissectie.
Begin met het aanbrengen van een stuk tandwas op een petrischaaltje met lijm en laat het drogen. Ontsmet vervolgens het gerecht met 70% ethanol. Het oppervlak is nu klaar voor dissectie.
Immobiliseer de petrischaal met de tandwas op het koude platform onder een dissectiemicroscoop wanneer deze klaar is voor dissectie. Desinfecteer het ventrale oppervlak van het dier met 70% ethanol. Open vervolgens de buik- en bekkenholte met een steriele dissectieschaar.
Verplaats het maagdarmkanaal naar één kant om de dorsale bihornale baarmoeder te lokaliseren. Volg elke baarmoederhoorn rostrally om elke eileider en eierstok te lokaliseren die zijn gehuld in het baarmoedervetkussen net onder de nier. Verwijder vervolgens beide laterale eileiders met de eierstokken en een deel van de distale baarmoederhoorn die nog steeds met een dissectieschaar is bevestigd.
Snijd elke laterale baarmoederhoorn af met ongeveer één tot twee centimeter van de hoorn nog bevestigd aan de opgerolde eileider en eierstok. Dompel het weefsel onmiddellijk onder in twee milliliter koud dissectiemedium en bevestig het baarmoederweefsel vervolgens op de tandwas met een steriele naald van 25 gauge om weefsel vast te zetten voor dissectie. Reinig en ontleed het ovariële vetkussen en bindweefsel om de eileider duidelijk te visualiseren.
Gebruik een spuit van één milliliter om één tot twee druppels steriele 1% toluïstische blauwe kleurstofoplossing af te geven en incubeer gedurende 30 seconden tot één minuut. Spoel af met koude DPBS en verwijder vervolgens alle vloeistof. Trek de eierstok lichtjes uit de opgerolde eileider.
Snijd bij het bursale membraan in het brede ligament om de eierstok van de eileider te verwijderen zonder het tubale weefsel in gevaar te brengen. Lokaliseer het distale fimboriale uiteinde van de eileider die lateraal naar de baarmoederbuisverbinding wordt gevonden. Trek voorzichtig aan de buis en knip de mesosalpinx weg met een springvorm microschaar om de eileider los te maken.
Snijd de buis om het infundibulaire gebied te produceren. Snijd vervolgens het ampullaire gebied door tussen bocht twee en drie te snijden. Snijd ten slotte het resterende deel naar de baarmoederbuisverbinding die het istmische gebied is.
Vries onmiddellijk de ontlede weefselsegmenten in vloeibare stikstof en voeg vervolgens 200 microliter koud RNA-extractiereagens en een-op-een homogenisatieparelmengsel toe aan het weefsel voor RNA-isolatie. Vanaf het fimboriale gebied snijdt u de buis in de lengterichting door met een springvormschaar en gebruikt u een tang als hefboom om het luminale epitheel bloot te leggen. Hak de opengespleet delen en de resterende eileider in segmenten van ongeveer één tot twee millimeter.
Voeg vervolgens vijf milliliter warme niet-enzymatische dissociatiebuffer toe aan het weefsel en incubeer bij 37 graden Celsius. Fluorescerende en fasecontrastbeelden van een celcluster die positief zijn voor occludin, kernen en geacetyleerde tubuline worden hier getoond. Rood duidt op occludin, blauw op kernen en groen op geacetyleerde tubuline.
De ciliated apicale grens blijft intact gedurende het hele protocol en is bestand tegen verdere vertering naar afzonderlijke cellen. In deze representatieve afbeeldingen worden samengevoegde, rode, blauwe, fasecontrast en groene kanalen weergegeven. Na een korte pronase incubatie zijn de meeste cellen enkelvoudig.
Propidiumjodidekleuring vertoont ongeveer 93% levensvatbaarheid in Brightfield, rood kanaal PI positief en merge. Inzet bij samenvoeging toont een intacte ciliated rand op een enkele gedissocieerde cel. Dergelijke cellen hebben actief kloppende trilharen.
Heel RNA werd beoordeeld op opbrengst en kwaliteit door microvolumespectrofotometer en bioanalysator. De resultaten tonen aan dat deze methode 800 tot 1.200 nanogram RNA per segment oplevert, behalve voor infundibulaire monsters waarbij pooling van twee dieren nodig kan zijn voor een passende opbrengst voor downstream-assays. De gepresenteerde resultaten voor infundibulum zijn samengevoegd van twee dieren, in totaal vier infundibulaire regio's.
Dit protocol bereikt met succes zuiver RNA geanalyseerd met een microvolumespectrofotometer en een bioanalysator. Monsters hebben een absorptieverhouding van 260 bij 280 nanometer tussen 1,8 en 2, typisch voor zuivere RNA-nucleotidesoorten. Bioanalyse van de monsters vertoonde een hoge RNA-integriteit met een beoordeeld RNA-integriteitsgetal boven zeven, geschikt voor downstream-expressie en sequencinganalyse.
Vergeet niet om één tot twee centimeter van de baarmoederhoorn vast te houden om het tubale systeem op het dissectieplatform te bevestigen. Bovendien helpt het gebruik van de toluidineblauwe kleurstof bij het snel losmaken van de eileider. Hoe sneller het loskoppelen, hoe beter het behoud en de minste hoeveelheid RNA-afbraak.
Deze methode is voldoende om RNA van geschikte kwaliteit te verkrijgen voor RNA-sequencing, waardoor individuele segmentsequencing mogelijk is. De celdissociatie is geschikt voor eencellige sequencing of flowcytometrie die een nauwkeuriger segment- en celanalyse mogelijk maakt. De methode zal helpen het veld verder te brengen dan de analyse van de hele buis die verschillen op segment- of enkele celniveau maskeert.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor microdissectie van de eileider van de muis, waardoor het verzamelen van individuele segmenten mogelijk is terwijl de integriteit van het RNA behouden blijft. Daarnaast wordt een niet-enzymatische procedure beschreven voor de dissociatie van eileidercellen, geschikt voor gen- en proteïneanalyse.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschap
- Celbiologie
- Reproductiebiologie
Achtergrond
- Verschillende segmenten van de eileider hebben unieke fysiologische functies.
- Deze segmenten verschillen in hun gevoeligheid voor pathologische veranderingen.
- Het identificeren van segmenten in kleine muiseileiders is uitdagend.
- Het produceren van goed gedifferentieerde cellen via weefseldissociatie is moeilijk.
Doel van de studie
- Om het ontvouwen van de eileider van de muis te demonstreren.
- Om verschillende segmenten van de eileider individueel te identificeren en te analyseren.
- Om het begrip van de omgeving van de ampulla te vergroten ter verbetering van IVF-technieken.
Gebruikte methoden
- Microdissectie van de eileider van de muis.
- Identificatie van verschillende segmenten van de eileider.
- Niet-enzymatische dissociatie van eileidercellen.
- Analyse van stromale en epitheliale cellen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle identificatie van individuele segmenten van de eileider.
- Hoge opbrengst van verkregen gedifferentieerde gedissocieerde cellen.
- Inzichten in de rol van het infundibulum bij maligne transformatie.
- Potentiële verbeteringen in in vitro fertilisatie-technieken.
Conclusies
- De gepresenteerde methoden maken een gedetailleerde analyse van oviductsegmenten mogelijk.
- Inzicht in segmentspecifieke functies kan reproductieonderzoek verbeteren.
- Toekomstige studies kunnen zich richten op de implicaties voor fertiliteitsbehandelingen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Deze methode maakt nauwkeurige moleculaire en cellulaire analyse van de muize eileider mogelijk door technische barrières te overwinnen die worden veroorzaakt door de kleine omvang en complexe anatomie ervan. Het ondersteunt doelwitvalidatie en mechanistische risicoreductie in de voortplantingsbiologie, oncologie en immunologie door segmentspecifieke analyse van fysiologische en pathologische processen mogelijk te maken. De benadering vergroot het voorspellende vertrouwen in preklinische modellen door de RNA-integriteit te behouden en levensvatbare, gedifferentieerde enkelcellen te leveren voor downstream-toepassingen zoals RT-qPCR, RNAseq en flowcytometrie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek mogelijk naar segmentspecifieke fysiologische functies en differentiële gevoeligheid voor pathologische veranderingen, zoals maligne transformatie in het infundibulum.
- Operationele waarde: Levert zuivere RNA-opbrengsten van 800–1,200 ng per segment, wat voldoende is voor RT-qPCR en RNAseq, en betrouwbare workflows voor doelwitvalidatie ondersteunt.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert de voorbereiding van gevalideerde biologische systemen voor downstream-assays door volledig gedifferentieerde eileidcellen te isoleren met intacte gecilieerde randen en een hoge levensvatbaarheid (ongeveer 93%).
- Operationele waarde: Maakt gebruik van een grotendeels niet-enzymatische dissociatiebuffer die de celintegriteit behoudt, wat reproduceerbare single-cell isolatie mogelijk maakt voor flowcytometrie en single-cell RNAseq.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt ziekterevante systeemanalyse door een afzonderlijke evaluatie mogelijk te maken van de bijdragen van immuun-, gladde spier- en epitheelcellen aan de fysiologie en pathologie van de eileider.
- Operationele waarde: Waarborgt continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door segmentopgeloste moleculaire en cellulaire gegevens te verschaffen die zijn afgestemd op embryologische oorsprongen en ratios van epitheelceltypen.
Integratie van pipeline en workflow
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm van vroege biologie tot lead-identificatie door hypothesetesten op het niveau van het oviductsegment mogelijk te maken en mechanistische risicoreductie te ondersteunen via een nauwkeurige voorbereiding van het biologische systeem.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door individuele analyse mogelijk te maken van de vier functionele segmenten van de eileider met verschillende ratio's van epitheelceltypen.
- Screening: Maakt assay-gereedheid mogelijk via gestandaardiseerde dissociatie die levensvatbare, gedifferentieerde cellen oplevert die geschikt zijn voor kwantitatieve analyse in screeningplatforms.
- Analytics: Levert RNA van hoge integriteit (RIN >7) en kwantificeerbare single-cell outputs die vergelijking van condities tussen segmenten en celtypen mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan bij preklinische continuïteit door analyse mogelijk te maken van segmentspecifieke vatbaarheid voor ziekten, zoals precursorlaesies in het infundibulum voor sereuze intraepitheliale carcinomen.
- Enterprise Reuse: Creëert een herbruikbare capaciteit voor eileideronderzoek binnen programma's voor reproductie, fertiliteit, kanker en immunologie, waardoor de afhankelijkheid van analyse van de gehele tube, die verschillen op segmentniveau maskeert, wordt verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid door segmentspecifieke targetvalidatie en vermindering van mechanistische ambiguïteit in complexe weefselsystemen.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid via een gedefinieerd microdissectie- en dissociatieprotocol dat RNA-degradatie minimaliseert.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie en verminderd biologisch risico in een laat stadium door vroegtijdige detectie van segmentspecifieke pathologische gevoeligheden mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering en beslissingen over verdere ontwikkeling op basis van mechanistische inzichten uit individuele segmenten van de eileider en celpopulaties.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in dissectiemicroscopie en weefselverwerking, waarbij initiële oefening op grotere structuren zoals de uterus wordt aanbevolen.
- Vereist instrumentarium waaronder dissectiemicroscopen, veersluitende microscharen, 25-gauge naalden en apparatuur voor RNA-extractie en celanalyse.
- Vereist standaardisatie tussen teams wat betreft de timing van de dissectie, toluidineblauw-kleuring en de verwerking van weefsel in de koude om consistentie tussen gebruikers en experimenten te waarborgen.
- Omvat overwegingen voor aanpassing aan verschillende modelsystemen, aangezien het protocol is geoptimaliseerd voor de afmetingen van de muiseivormige eileider (200–400 μm diameter).
- Omvat praktische beperkingen, zoals de noodzaak om infundibulaire monsters van twee dieren te poolen om een voldoende RNA-opbrengst te verkrijgen voor downstream-assays.
