Biologische voorbereiding en mechanische techniek voor het bepalen van visco-elastische eigenschappen van zonulaire vezels
16 december 2021
Het protocol beschrijft een methode voor de studie van extracellulaire matrix visco-elasticiteit en de afhankelijkheid ervan van eiwitsamenstelling of omgevingsfactoren. Het beoogde matrixsysteem is de muiszone. De prestaties van de methode worden aangetoond door het visco-elastische gedrag van wild-type zonulaire vezels te vergelijken met die zonder microfibril-geassocieerd glycoproteïne-1.
Het belang van onze methode ligt in het vermogen om de vraag te beantwoorden, wat zijn de visco-elastische eigenschappen van zonulaire vezels, de vezels die de lens in het oog ophangen? Het grote voordeel van onze techniek is dat het de visco-elastische eigenschappen van de kleine en delicate zonulaire vezels van muizen met en zonder gerichte genmodificaties kan kwantificeren. Mutaties in genen die coderen voor microfibrileiwitten liggen ten grondslag aan verschillende erfelijke syndromale aandoeningen.
Met behulp van onze techniek kunnen we onderzoeken hoe specifieke mutaties de biomechanische eigenschappen van de microfibrillen veranderen. Om te beginnen, na het euthanaseren van de muis, verwijder de ogen met een fijne tang. Steek de punt van een fixatiefaald door de wand van het oog en plaats deze in het midden van de glasvochthumor, zorg ervoor dat de lens niet wordt beschadigd.
Breng het gespietste oog voorzichtig over naar een buis gevuld met 4% paraformaldehyde en fosfaat gebufferde zoutoplossing. Open de klep die de naald verbindt met een gefixeerd reservoir op 25 centimeter boven het monster dat een positieve druk behoudt die overeenkomt met 15 tot 20 millimeter kwik in het oog tijdens de fixatieperiode en laat het monster 's nachts fixeren. Verwijder de volgende dag de fixatiefaald en was het oog gedurende 10 minuten in fosfaat gebufferde zoutoplossing.
Door gebruik te maken van een oogheelkundige chirurgische schaar en een stereomicroscoop, maak een incisie van volledige dikte in de oogwand in de buurt van de oogzenuwkop. Strek de snede naar voren naar de evenaar en vervolgens rond de equatoriale omtrek van het oog terwijl u zorgvuldig de delicate ciliaire processen en bijbehorende zonulaire vezels spaart. Belicht het achterste oppervlak van de lens door de achterkant van de wereldbol te verwijderen.
Verwijder het ontleedde oog met een tang uit de bufferoplossing en leg het op een droogtaakdoekje met het hoornvlies naar beneden gericht. Sleep het hoornvlies voorzichtig over het oppervlak van het doekje om het te drogen. Breng een druppel instantlijm aan op de bodem van een petrischaaltje van 50 millimeter en bevestig het platform eraan.
Leg de schaal op de podiumplaat van de stereomicroscoop zodat de put met de lijm in zicht is. Om het oog in de plateauputten van de petrischaal te plaatsen, voegt u drie microliter instantlijm toe. Plaats hem voorzichtig in de put en stel hem snel zo af dat de achterkant van de lens naar boven gericht is.
Droog de blootgestelde kant van de lens door voorzichtig te deppen met de hoek van een droog doekje. Voor het meten van de zonulaire visco-elastische respons zet u de weegschaal aan, plaatst u de petrischaal op de schaal en start u vervolgens het schaalregistratieprogramma en de camerasoftware. Schakel de servomotorcontroller in.
Start de controllertoepassing op de computer en stel de bewegingsparameters in met stappen van 50 micrometer. Maak 90 graden buiging in een capillaire staaf. Schuif het gebogen capillair in de capillaire sondehouder en draai de bevestigingsschroeven vast.
Voeg aan de capillaire punt een kleine kraal uv-uithardende lijm toe. Beweeg de punt van de capillaire sonde met behulp van de handmatige aanpassingen op de manipulator en plaats deze direct over de bovenkant van de lens. Door visuele inspectie aan de voorkant en het zijaanzicht met behulp van een microscoopcamera, onderzoekt u of het onderste deel van de UV-lijm gecentreerd over de bovenkant van de lens lijkt.
Terwijl u door de camera kijkt, laat u de sondepunt zakken totdat de UV-lijm contact maakt met de lens en 1/3 tot 1/2 van het bovenoppervlak bedekt. Hard de lijm uit met behulp van een directionele bijna zichtbare UV-lichtbron van 380 tot 400 nanometer golflengte en een intensiteit van ongeveer een milliwatt. Voeg PBS-oplossing toe aan de petrischaal totdat het oog bedekt is tot een diepte van ten minste twee millimeter.
Plaats een cilindrische lens voor de microscoop en dicht bij de petrischaal zonder deze aan te raken. Start tegelijkertijd het inloggen in een timerprogramma. Maak een foto van het oog en de sonde met behulp van de camera.
Begin na 60 seconden met een verplaatsing van 50 micrometer. Herhaal elke 60 seconden totdat het experiment is voltooid, zoals aangegeven door het breken van alle zoneuze vezels. Sla de logboekgegevens op na voltooiing van een run en exporteer deze naar een compatibele spreadsheetindeling.
Sla ook de lensfoto's op die tijdens de run zijn verkregen. Importeer de gegevens in een spreadsheet. Interpoleer met behulp van de eerste en de laatste schaalaflezing de afwijking in de achtergrondlezing in de loop van de tijd als gevolg van verdamping en trek vervolgens de geïnterpoleerde achtergrond af van de meting in elk tijdstip.
Na het uitvoeren van de test en het corrigeren voor verdamping, wordt de grafiek van de visco-elastische gegevens omgekeerd. De grootte van de ogenblikkelijke en ontspannen krachten neemt toe met elke stap tot ongeveer 1.000 seconden en daalt dan als de zonulaire vezels beginnen te breken totdat het tijdspunt van 1.500 seconden is bereikt wanneer alle vezels zijn gebroken. Voor deze demonstratie werd ook de visco-elastische respons voor wilde type en MOP-1 deficiënte muizen vergeleken.
Op de begintijd van nul tot 600 seconden lijken de grafieken op elkaar, wat suggereert dat de visco-elastische eigenschappen van de zonulaire vezels niet significant waren veranderd. In de MOP-1 knock-out muis breken de vezels echter voortijdig. Zonulaire vezelbreekkrachten werden verkregen met de pull-up methode voor MOP-1 versus wild type muizen op een maand en een jaar oud stadium.
De resultaten gaven aan dat de sterkte van de vezels toeneemt met de leeftijd voor wilde muizen. Elk accidenteel contact met de petrischaal tijdens deze stappen kan ertoe leiden dat de oogwand verschuift ten opzichte van de ooglens, waardoor de zonulaire vezels mogelijk worden beschadigd. Deze pull-up assay helpt bij het identificeren van eiwitten die bijdragen aan de treksterkte van microfibrillen.
We zullen deze informatie gebruiken om meer realistische modellen van het interieur van zonulaire vezels te bouwen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het bestuderen van de visco-elastische eigenschappen van de extracellulaire matrix, met een specifieke focus op de zonula van de muis. Er wordt belicht hoe de eiwitsamenstelling en omgevingsfactoren deze eigenschappen beïnvloeden, aangetoond door vergelijkingen tussen zonulaire vezels van het wildtype en vezels waarin microfibril-associated glycoprotein-1 ontbreekt.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Biologie
- Biomechanica
Achtergrond
- Zonulaire vezels houden de lens in het oog op zijn plaats.
- Visco-elastische eigenschappen zijn cruciaal voor het begrijpen van het biomechanische gedrag.
- Mutaties in microfibril-eiwitten kunnen leiden tot erfelijke syndromale aandoeningen.
- Het begrijpen van deze eigenschappen kan helpen bij het onderzoeken van genetische effecten op de gezondheid van het oog.
Doel van de studie
- Om de visco-elastische eigenschappen van zonulaire vezels te kwantificeren.
- Om de impact van specifieke genmutaties op deze eigenschappen te beoordelen.
- Om een betrouwbare methode te bieden voor het bestuderen van delicate biologische structuren.
Gebruikte methoden
- Post-euthanasie van muizen om zonulaire vezels te verkrijgen.
- Gebruik van fijne pincetten voor het verwijderen van de ogen.
- Inbrengen van een fixatienaald in het oog voor analyse.
- Vergelijking van vezels van wild-type en genetisch gemodificeerde muizen.
Belangrijkste resultaten
- De methode kwantificeert succesvol visco-elastische eigenschappen.
- Er werden verschillen in eigenschappen waargenomen tussen wild-type en mutante vezels.
- Specifieke mutaties bleken de biomechanische kenmerken te veranderen.
- De techniek is toepasbaar voor verdere genetische studies.
Conclusies
- Deze methode biedt inzicht in de biomechanische eigenschappen van de zonulaire vezels.
- Het kan worden gebruikt om de effecten van genetische modificaties te onderzoeken.
- De bevindingen kunnen bijdragen aan het begrip van syndromale aandoeningen gerelateerd aan het oog.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Deze methode maakt een kwantitatieve beoordeling mogelijk van de visco-elastische eigenschappen in zonulaire vezels, een model-extracellulair matrixsysteem, om te evalueren hoe specifieke eiwitmutaties de biomechanische functie veranderen. Door een gevoelige, reproduceerbare uitlezing van de vezelintegriteit onder gecontroleerde mechanische spanning te bieden, ondersteunt het de validatie van targets in mechanismen van oogziekten en het preklinisch verminderen van risico's bij genetische therapieën. De aanpak biedt een schaalbaar platform voor het onderzoeken van ECM-eiwitrelaties die relevant zijn voor bindweefselstoornissen buiten het oog.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door de samenstelling van zonulaire eiwitten te koppelen aan meetbare veranderingen in het visco-elastische gedrag.
- Operationele waarde: Maakt functionele targetvalidatie mogelijk door directe vergelijking van wild-type en genetisch gemodificeerde vezels onder gestandaardiseerde mechanische belasting.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door eiwitten te identificeren waarvan het verlies correleert met voortijdig vezelfalen onder gedefinieerde verplaatsingsdrempels.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Produceert gevalideerde biologische systemen (zonulaire vezelpreparaten) met kwantificeerbare spanningsoutputs die geschikt zijn voor downstream screening van verbindingen of genetica.
- Reproduceerbaarheid: Gestandaardiseerde protocollen voor fixatie, montage en verplaatsing zorgen voor consistente basismetingen over verschillende experimentele runs.
- Schaalbaarheid: Het ontwerp van het platform maakt parallelle verwerking van meerdere monsters mogelijk met behulp van identieke Petrischaalputjes en capillaire sonde-opstellingen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Modelleert menselijke syndromale aandoeningen die voortkomen uit mutaties in microfibril-eiwitten, wat preklinische evaluatie van genotype-fenotype-relaties mogelijk maakt.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen targetvalidatie in de ontdekkingsfase en preklinische beoordeling door een gemeenschappelijke biomechanische readout te bieden voor zowel wild-type als ziekte-modelsystemen.
- Mechanistische risicoreductie: Verduidelijkt of waargenomen fenotypische veranderingen voortkomen uit een gewijzigde visco-elasticiteit van de ECM in plaats van off-target effecten tijdens de ontwikkeling.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek door biomechanische gegevens in een vroege fase te leveren, die bijdragen aan de betrouwbaarheid van het target en de gereedheid van de assay voor downstream validatie.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing door te kwantificeren hoe genmutaties de draagcapaciteit van zonulaire microfibrillen beïnvloeden.
- Screening: Genereert assay-klare preparaten met kracht-verplaatsingsmetingen die vergelijking mogelijk maken tussen wild-type, heterozygote en homozygote mutante condities.
- Analytica: Levert tijdopgeloste spanningsmetingen waarmee instantane en ontspannen krachtparameters kunnen worden berekend, wat statistische vergelijking tussen genotypen faciliteert.
- Translationeel Onderzoek: Biedt een ziekterelevante systeem voor het evalueren of herstelde eiwitexpressie de visco-elastische profielen terugbrengt naar wild-type baselines.
- Hergebruik in de sector: Vestigt een gestandaardiseerd biomechanisch platform dat toepasbaar is op andere trekkende ECM-systemen (bijv. pezen, ligamenten) met minimale aanpassing van het protocol.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door de bijdrage van specifieke ECM-proteïnen aan de visco-elasticiteit op weefselniveau te isoleren.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, kosteneffectieve metingen met een gevoeligheid die toelaat om leeftijd- en genotype-afhankelijke veranderingen in vezelsterkte te detecteren.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door objectieve biomechanische criteria te bieden voor de prioritering van targets in programma's gericht op bindweefsel.
- Impact op de portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde voortgang mogelijk door de functionele consequentie van genetische modificaties op belastbare ECM-netwerken te kwantificeren.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in oculaire dissectie, microchirurgie en biomechanisch testen onder een microscoop.
- Is afhankelijk van precisie-instrumentarium, waaronder servomotorcontrollers, krachtgevoelige weegschalen en UV-uithardingssystemen voor de bevestiging van de probe aan de lens.
- Vereist gestandaardiseerde fixatie- en montageprocedures om monsterdrift of mechanische artefacten tijdens de spanningsmeting te voorkomen.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij het toepassen van de pull-up techniek op ECM-systemen met een verschillende structurele organisatie of treksterkte.
- Praktische beperkingen omvatten de tijd voor monstervoorbereiding en de noodzaak van gecontroleerde omgevingscondities (bijv. PBS-buffering) om verdampingsartefacten tijdens langdurige runs te minimaliseren.
