Het bepalen van de rol van maternale tot expressie gebrachte genen in de vroege ontwikkeling met maternale crispants

De rol van veel maternale tot expressie gebrachte genen tijdens de vroege ontwikkeling is momenteel onbekend. Deze maternale CRISPR-techniek maakt de snelle identificatie van maternale effectgenen en hun rol in de ontwikkeling mogelijk. Multiplexing leidt RNA's naar een enkel gen, stelt onderzoekers in staat om nieuwe fenotypen met maternale effecten in een enkele generatie te identificeren.

Dit onderzoek is nuttig om de functie van mRNA-transcripten in de gameten te begrijpen, die nodig zijn voor vroege embryogenese. De sleutel tot deze techniek is om de embryo's vroeg in het stadium van één cel te micro-injecteren en te controleren of de meerderheid van de gids RNA's somatische mutaties in de geïnjecteerde embryo's kunnen maken. Om een gids-RNA-sjabloon te maken voor elk genspecifiek oligonucleotide, analyt naar het constante oligonucleotide en vul de overhangen op met T4 DNA-polymerase.

Nadat de vier gids-RNA-sjablonen zijn samengesteld, zuivert en concentreert u ze samen met behulp van een DNA-opruimings- en concentratorkit. Synthetiseer het sgRNA-mengsel uit de gepoolde guy RNA-sjabloon, met behulp van een in-vitro T7-transcriptiekit, en voer de in-vitro transcriptie uit zoals beschreven in het manuscript. Om de integriteit van het sgRNA te verifiëren, giet je een 1% agarose 0,5 microgram per milliliter, ethidiumbromide Tris-Borate-EDTA-gel.

Plaats de gestolde gel in Tris-Borate-EDTA loopbuffer. Meng één microliter sgRNA-mengsel en één microliter RNA-gellaadbuffer. Laad dit monster in de gel en laat de gel vijf minuten op 100 volt draaien.

Visualiseer de banden met ultraviolet licht. Zet wild type kruisen en zebravis paring dozen. Houd de mannelijke en vrouwelijke vissen in dezelfde tank, maar scheid ze met behulp van een paringsdoosverdeler, of zoals hier afgebeeld, door het vrouwtje in een ei-leggende insert te plaatsen.

Nadat de injectiecocktail is samengesteld, laat u het mannetje en het vrouwtje paren door de paringskastverdeler te verwijderen, of zoals hier afgebeeld, door het mannetje in dezelfde eilegplaats te plaatsen als het vrouwtje. Om de embryo's te synchroniseren, verzamelt u ze na 10 minuten met een plastic zeef en spoelt u ze in een petrischaal met behulp van 1XE3-media. Verwijder 10 tot 15 embryo's en plaats ze in een aparte petrischaal om als niet-geïnjecteerde controles te worden bewaard.

Breng de resterende embryo's over in de injectieplaatputten. Injecteer één nanoliter eiwit sgRNA-oplossing in de zich ontwikkelende blastoschijf van een eencellig embryo. Gebruik een tang om de punt van de verstopte naald te breken en kalibreer de naald opnieuw om een bolus van één nanoliter uit te werpen.

Verzamel de volgende dag na de injectie zes gezond geïnjecteerde embryo's en twee controleembryo's van de niet-geïnjecteerde plaat. Plaats elk embryo afzonderlijk in een enkele put van een PCR-stripbuis en label de bovenkant van de buizen. Ontwerp unieke screeningprimers voor elke gidslocatie om een 100 tot 110 base paired DNA-fragment te versterken dat de CRISPR-Cas9-doellocatie bevat.

Plaats indien mogelijk de doellocatie in het midden van het versterkte fragment, zodat grotere deleties kunnen worden geïdentificeerd. Stel voor elk van de vier richtlocaties acht PCR-reacties van 25 microliter in met behulp van vijf microliter van het bereide enkele embryogenomische DNA en 20 microliter van de PCR-mix, en begeleid specifieke screeningprimersmengsel, om somatische mutaties in de doellocatie te identificeren. Giet een 2,5% agarose, 0,5 microgram per milliliter ethidiumbromide Tris-Borate-EDTA-gel met behulp van kammen die ongeveer 0,625 centimeter brede putten creëren.

Plaats vervolgens de gestolde gel in de elektroforesekamer met Tris-Borate-EDTA-loopbuffer. Voeg vijf microliter 6X ladende kleurstof toe aan het PCR-product. Laad 25 microliter van dit mengsel in de gel en zorg ervoor dat de geïnjecteerde en controlemonsters op dezelfde gelrij draaien.

Nadat alle monsters zijn geladen, voegt u vijf microliter ethidiumbromide per liter Tris-Borate-EDTA-loopbuffer toe aan het positieve uiteinde van de gelbox. Laat de gel op 120 volt draaien totdat het DNA-verbod is verdwenen of het DNA het einde van de rijstrook heeft bereikt. Om de fenotypen met maternale effecten en de embryo's van maternale CRISPR te identificeren, zet u de F0-geïnjecteerde vrouwtjes op tegen mannetjes van het wilde type en controleert u wilde typekruisen in standaard zebravisparingsdozen tijdens de middag voorafgaand aan het experiment.

Plaats de mannelijke en vrouwelijke vissen in dezelfde tank, maar scheid ze met een paringsdoosverdeler of plaats het vrouwtje in een eilegplaats. Laat op de ochtend van het experiment het mannetje en het vrouwtje beginnen met paren door de paringsdoosverdeler te verwijderen of het mannetje in dezelfde ei-leggende insert te plaatsen als het vrouwtje. Verzamel de embryo's elke 10 minuten door de ei-leggende insert in een nieuwe paringstankbodem te verplaatsen die vers systeemwater bevat en label de tank met een tag die het individuele F0-vrouwtje identificeert.

Neem de oude paringstank en giet het water door een T-zeef om de embryo's te verzamelen uit één individuele koppeling van 10 minuten. Observeer onder een ontleedmicroscoop met een transcendente lichtbron de embryo's die elk uur in ontwikkeling zijn, gedurende de eerste zes tot acht uur en dagelijks gedurende de volgende vijf dagen. Verplaats de potentiële maternale CRISPR-embryo's naar een petrischaal die 1XE3-media bevat en test op morfologisch fenotype 24 uur na de bevruchting en levensvatbaarheid, vijf dagen na de bevruchting.

De middag voor het experiment, stel paringsparen van F0-vrouwtjes op door de wilde mannetjes fysiek gescheiden te houden van de vrouwtjes, een paringsdoosverdeler te gebruiken of het vrouwtje in de eierleggende insert te plaatsen. Verwijder op de ochtend van het experiment de fysieke partitie om de paring te starten. Bij het eerste teken van het leggen van eieren, onderbreek het fokken door de mannelijke en F0-vrouwtjes te scheiden en houd elk gescheiden F0-vrouwtje in individuele paringsboxen.

Laat na in-vitrofertilisatie de haploïde embryo's zich ontwikkelen totdat het maternale CRISPR-fenotype wordt waargenomen en plaats die embryo's in een andere petrischaal. Zodra de maternale CRISPR haploïde embryo's zijn geïdentificeerd, laat ze zich ontwikkelen gedurende ten minste zes uur na de bevruchting. Om het genomische DNA uit ten minste 10 maternale CRISPR haploïde embryo's te extraheren, plaatst u een enkel haploïde embryo in een individuele put van een PCR-stripbuis, verwijdert u overtollige E3-media uit de put en voegt u 50 microliter 50 millimolaire natriumhydroxide toe.

Incubeer de embryo's gedurende 20 minuten bij 95 graden Celsius en koel ze af tot vier graden Celsius. Voeg vervolgens vijf microliter van één molair Tris-zoutzuur met pH 7,5 toe en vortex gedurende vijf tot 10 seconden. Om te bepalen welke gidssites indels bevatten, ontwerpt u sequencingprimers om een DNA-fragment te versterken, inclusief alle vier CRISPR / Cas9-doellocaties.

Stel twee 25 microliter PCR-reacties per embryo in, met behulp van vijf microliter van het bereide genomische DNA en de sequencingprimers. Nadat de PCR is voltooid, zuivert en concentreert u de twee monsters met behulp van een DNA-opruimings- en concentratorkit en verzendt u het DNA-fragment naar Sanger-sequencing, met behulp van de voor- en achteruitvolgingsprimers. Gids-RNA's moeten allemaal worden geclusterd met minimale tot geen overlappende regio's tussen gids-RNA's tijdens het genereren van MATERNALE CRISPR.

Als er indels werden gemaakt, moet een uitstrijkje worden waargenomen in de geïnjecteerde monsters op een agarose-gel, maar niet in de niet-geïnjecteerde controle. De maternale CRISPR-methode kan worden gebruikt voor fenocopie van bekende maternale effectmutaties, zoals bont, tmi en aura. Om de genetische laesies te identificeren die bijdragen aan het maternale CRISPR-fenotype, worden UV-behandeld sperma en in-vitrofertilisatie gecombineerd om maternale CRISPR-haploïden te creëren.

De creatie van een haploïde maakt Sanger-sequencing van het maternale allel en identificatie van maternale CRISPR-indels mogelijk. Bij het identificeren van een onmateaal effectfenotype, is het essentieel dat u het bij meerdere F0-vrouwen kunt waarnemen, omdat het de kans vergroot dat het fenotype wordt veroorzaakt door functieverlies, niet door off-target of niet-specifieke effecten. Nadat een fenotype met maternale effecten is geïdentificeerd, kunnen de maternale CRISPR-embryo's worden gebruikt om de effecten op verschillende aspecten van vroege embryogenese te onderzoeken, zoals het sinusskelet of DNA-segregatie.

Hierdoor kunnen onderzoekers de moleculaire oorzaak van het fenotype begrijpen. Deze methode test direct de functie van onbekende moederlijk tot expressie gebrachte genen in een enkele generatie, waardoor ons begrip van processen wordt versneld en tijdens vroege embryogenese wordt gewerkt.