Kip recombinante ledematen test om morfogenese, patroonvorming en vroege stappen in celdifferentiatie te begrijpen

Recombinante ledematen zijn een krachtig model voor een studie in het proces van celdifferentiatie en krachtvorming onder invloed van embryonale signalen in een in vivo omgeving. Deze test maakt meerdere variaties mogelijk die potentiële toepassingen mogelijk maken zonder beperkt te zijn tot ontwikkelingsbiologie van kippenledematen. Het kan worden toegepast op andere stam of voorloper van andere organismen.

Om te beginnen, verwijder eieren uit de incubator na drie en een halve dag, wattenstaafje met 70% ethanol en laat ze aan de lucht drogen. Identificeer en lokaliseer vervolgens de zich ontwikkelende embryo's door het ei te candellen en de bloedvaten te observeren. Gooi eieren weg die geen embryo hebben.

Tik op het stompe uiteinde van de eierschaal met het uiteinde van een stompe tang om een raam te openen en verwijder ongeveer een vierkante centimeter van de schaal met behulp van de tang. Breng de eieren vervolgens over naar een plastic of kartonnen houder. Leg de eitjes één voor één onder de stereomicroscoop.

Identificeer het luchtmembraan en verwijder het door een klein gaatje in het gebied zonder vaten te kiezen. Trek dit gebied eruit met behulp van een fijne chirurgische tang en verwijder stukjes eierschaal in contact met het embryo. Scheur de vruchtzak open met een fijne chirurgische tang.

Verwijder het embryo voorzichtig uit het ei met een stompe tang en breng het over in een steriel petrischaaltje met ijskoude 1x PBS. Was de embryo's eenmaal in ijskoude 1x PBS en trek eventuele resterende membranen onder de stereomicroscoop terug. Zoek vervolgens de achterste knoppen.

Knip elke achterpootknop in de lengterichting en snijd zeer dicht bij de embryoflank met een fijne chirurgische tang. Het onderhouden van de embryo's in 1x PBS. Breng vervolgens de ledemaatknoppen over in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter met een plastic transferpipet.

Vervang vervolgens de PBS door 500 microliter 0,5% trypsine-oplossing. Incubeer de ledemaatknoppen in een thermoblok gedurende zeven minuten bij 37 graden Celsius. Vervang vervolgens de trypsine-oplossing door 500 microliter van twee milligram per milliliter collagenase type vier in HBSS en incubeer het nog eens acht minuten in het thermoblok.

Verwijder zoveel mogelijk collagenase en vervang het door één milliliter koude hoge glucose DMEM met 10% FBS om de enzymen te inactiveren. Pipetteer het mengsel voorzichtig ongeveer 10 keer. Filtreer de suspensie die de cellen bevat met een celzeef van 70 micrometer om de ectodermen achter te laten.

Pipetteer de suspensie opnieuw ongeveer vijf tot 10 keer en centrifugeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur op 200 maal g. Gooi dan het supernatant weg. Was het overtollige collagenase met één milliliter media, centrifugeer vervolgens de suspensie en gooi het medium voorzichtig weg.

Voeg vervolgens 1,5 milliliter media toe zonder de cellen te storen en incubeer ze gedurende één tot 1,5 uur bij 37 graden Celsius in een thermoblok, waardoor de cellen een compacte pellet kunnen vormen. Na het verkrijgen van de achterste ledemaatknoppen, breng ze over in een lege microcentrifugebuis met een plastic pipet. Verwijder overtollige 1x PBS en vervang deze door 500 microliter 0,5% trypsine in steriele 1x PBS.

Incubeer het mengsel gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius in een thermoblok. Breng de trypsine-oplossing met de ledemaatknoppen over in een steriel petrischaaltje. Verwijder vervolgens zoveel mogelijk van de overtollige trypsine en overspoel de petrischaal met ijskoude 1x PBS met 10% FBS totdat alle ledemaatknoppen bedekt zijn.

Identificeer de ledemaatknoppen onder de stereomicroscoop. Identificeer vervolgens het ectoderm als een enigszins losstaand transparant membraan van de mesodermale cellen van de ledematen. Maak het ectoderm los en scheid het met een tang die het meest proximale uiteinde van de ledemaatknop vasthoudt met een fijne chirurgische tang.

Neem de mesodermale pellet uit de vorige stappen en gooi ongeveer 600 microliter van het medium weg. Maak vervolgens de pellet voorzichtig los met een pipetpunt zonder deze te breken. Draai de buis ondersteboven om de pellet over te brengen in de petrischaal met de lege ectodermen.

Snijd een klein stukje van de pellet met een fijne chirurgische tang en plaats deze zo dicht mogelijk bij het ectoderm. Open het ectoderm met de chirurgische tang en plaats de pellet zo strak mogelijk in de ectodermale hal. Open de vruchtzak bij de voorpoot om de rechterflank van het embryo bloot te leggen.

Geleid door de voorpootpositie, voer wondkrabben uit met een wolfraamnaald tot de lengte van twee tot drie somites, waarbij het mesoderm enigszins wordt beschadigd totdat het bloedt. Breng de recombinante ledematen individueel over in het kuikenembryo en plaats de basis over een somietwond. Bevestig de recombinante ledemaat correct met twee stukken palladiumdraad.

Lijn de basis van de recombinante ledemaat uit met de wond. Sluit het raam af met tape en breng het ei terug naar de broedmachine. Bij succesvolle implantatie werd de recombinante ledemaat waargenomen als een uitstulping die stevig was bevestigd aan de mesodermale wand van het donorembryo.

Integendeel, de recombinante ledemaat werd losgemaakt van de mesodermale wand of vertoonde een ruwe morfologie wanneer de levensvatbaarheid van de cel of het transplantaat faalde. Alcische blauwe kleuring demonstreerde skeletelementen in een zesdaagse kip, kip recombinant ledemaat. Voordat het Alcische blauw werd opgeruimd, werden afbeeldingen in ethanol verkregen voor morfologische en kwantitatieve metingen.

H & E bevlekte of niet-gekleurde ledematen werden gesneden om weefsels en cellen te observeren. Deze techniek kan limb organoïden in vivo ontwikkelen en celdifferentiatie of morfogenetisch proces bestuderen door de stamcellen uit verschillende bronnen of soorten te gebruiken.