Optogenetica gebruiken om neuroplasticiteit om te keren en cocaïne zoeken bij ratten te remmen

Dit protocol is belangrijk omdat het nieuwe vooruitgang in optogenetische technieken en een preklinisch model van middelenmisbruik gebruikt om plasticiteit in neurale circuits die verantwoordelijk zijn voor het bevorderen van terugval om te keren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het circuitspecifieke manipulatie van synaptische activiteit in een wakker dier mogelijk maakt, wat langdurige remmende effecten heeft op toekomstig cue-gemotiveerd cocaïnezoekgedrag. Deze methode kan worden gebruikt in vele andere systemen en circuits om specifiek gedragsrelevante neuroplasticiteit te manipuleren.

Begin met de voorbereidingen voor de operatie door een 26 gauge roestvrijstalen injectiecanule aan te sluiten op een Hamilton-spuit gevuld met één microliter geconcentreerde AAV-oplossing. Scheer na het verdoven van het dier het operatiegebied en smeer de ogen om uitdroging te voorkomen zoals beschreven in het tekstmanuscript. Injecteer vervolgens in de rat een lichaamsgewichtvolume van het pijnstillende carprofen subcutaan door de huid van de bovenrug en injecteer vijf milliliter lactatie Ringer's-oplossing subcutaan door de huid van de onderrug.

Voer vervolgens de intraveneuze katheterimplantatie uit. Onmiddellijk na katheterimplantatie, veilig rat in een stereotaxisch frame om adeno-geassocieerde virale injecties uit te voeren. Injecteer een bolus van lidocaïne subcutaan door de huid boven de schedel om het gebied lokaal te verdoven en maak vervolgens een incisie van 0,5 millimeter van de voorkant naar de achterkant van de schedel.

Verwijder bovenliggend weefsel om het oppervlak van de schedel bloot te leggen. Egaliseer het hoofd van de rat langs de voorste achterste as en nul stereotaxische coördinaten naar bregma, gebruik vervolgens een dremel-gereedschap uitgerust met een kleine boor om drie kleine gaten door de schedel te boren en monteer roestvrijstalen schroeven op hun plaats met een schroevendraaier. Boor voor de injectie van AAV bilaterale gaten op basis van de coördinaten van de Rattenhersenatlas"voor de mediale geniculate nucleus of MGN.

De gebruikte coördinaten ten opzichte van bregma zijn minus 5,4 millimeter op de voorste achterste as, plus drie millimeter op de mediale laterale as en minus 6,6 millimeter op de dorsale ventrale as. Verlaag de injectiecanule langzaam met ongeveer vier millimeter per minuut, totdat de canule goed in de MGN is geplaatst, en injecteer geconcentreerde AAV-oplossing met een snelheid van 0,1 microliter per minuut. Nadat de infusies zijn voltooid, laat u de injectiecanule vijf minuten op zijn plaats om diffusie van het virus weg van de canule mogelijk te maken en trekt u vervolgens langzaam de canule uit de hersenen op.

Ga vervolgens verder met de implantatie van optische vezels gericht op mediale geniculate nucleus laterale amygdala-terminals. Gebruik een dremel-gereedschap om bilaterale gaten te boren boven de laterale amygdala, op coördinaten zoals uitgelegd in het manuscript. Gebruik een tang om de ferrule van het optische vezelimplantaat vast te pakken en bevestig de ferrule aan de stereotaxische adapters op zijn plaats.

Verlaag langzaam vezels met een snelheid van twee millimeter per minuut totdat de punt van de vezel in het dorsale deel van de LA zit. Bevestig ferrules op de huid, eerst met behulp van een dunne laag Loctite instant lijm, gevolgd door tandcement. Zodra tandcement voldoende is opgedroogd, bedekt u ferrules met ferrulehulzen en stofdeksels. Na chirurgische ingrepen huisvest u de rat individueel en spoelt u de katheters dagelijks met een zoutoplossing die vijf milligram per milliliter gentamicine en 30 USP-eenheden per milliliter heparine bevat.

24 uur voor de start van gedragsexperimenten beperkt voedsel ratten tot 90% van hun vrije voedingsgewicht. Plaats de rat in een operante kamer om dagelijks trainingssessies van een uur te ondergaan voor zelftoediening van twee milligram per milliliter cocaïne, onder een vaste verhouding één schema van versterking. Laat de rat in de kamer met een hendel drukken.

Een druk op de aangewezen actieve hefboom resulteert in een cocaïne-infusie met een dosis van één milligram per kilogram en een presentatie van tien seconden van een samengestelde licht- en toonkeu. Een druk op de aangewezen inactieve hendel heeft geen geprogrammeerde effecten. Ga door met de zelftoedieningsexperimenten gedurende ten minste 10 dagen, totdat de rat met succes ten minste acht infusies per dag verdient gedurende drie opeenvolgende dagen.

Het niet bereiken van acquisitiecriteria op dag 20, resulteert in uitsluiting van het onderzoek. Nadat met succes aan de verwervingscriteria is voldaan, onderwerpt u de rat gedurende zes tot 10 dagen aan instrumentele uitstervingssessies van een uur door ratten vrijelijk te laten persen in operante kamers. Ga dagelijks door met instrumenteel uitsterven totdat er gemiddeld maximaal 25 hefboomdrukken gedurende twee opeenvolgende dagen plaatsvinden.

Voor optogenetische inductie van langdurige depressie of LTD, sluit u patchkabels aan op een blauwe laserdiode van 473 nanometer via een roterende verbinding die boven een schone, standaard knaagdierhuiskooi hangt. Schakel de laser in volgens de gebruiksaanwijzing en sluit de laser aan op een pulsgenerator. Pas de instellingen aan om de rat de 900 lichtpulsen te geven op twee microseconden, op één hertz.

Meet de lichtopbrengst via het patchsnoer met behulp van een lichtsensor en pas de laserintensiteit aan zodat de lichtopbrengst door de patchkabel ongeveer vijf tot zeven milliwatt is. Plaats de rat in de schone kooi en verwijder stofdeksels en ferrulehulzen die de ferrules blootleggen. Sluit vervolgens de patchkabels bilateraal aan op elke ferrule.

Als ze goed zijn ingesteld, kunnen knaagdieren vrij rond de kooi bewegen tijdens optogenetische stimulatie. Nadat u de rat drie minuten de omgeving hebt laten verkennen, schakelt u de pulsgenerator in om optogenetische stimulatie te starten. Laat de rat na langdurige depressie-inductie drie minuten in de kooi blijven voordat u hem terug in de thuiskooi plaatst.

Plaats de rat 24 uur na in vivo optogenetische stimulatie terug in de operante conditioneringskamers om een standaard cue-geïnduceerde herstelsessie van een uur te ondergaan om cocaïnezoekgedrag te beoordelen. Een druk op de actieve hendel resulteert in een tien seconden durende presentatie van de licht- en toonkeu. Geef ten minste een week na de eerste test een tweede herplaatsingstest om te bepalen of inductie van optogenetische LTD resulteert in een langdurige onderdrukking van cocaïne zoeken.

In de representatieve analyse worden de verwerving en het uitsterven van zelftoediening van cocaïne getoond. Cocaïne-infusies en actieve hefboomresponsen namen toe tijdens de acquisitie, met weinig inactieve hefboomresponsen. Tijdens zelftoediening van cocaïne nam het aantal actieve reacties geleidelijk toe gedurende elke acquisitiedag voordat het in de tweede week stabiliseerde.

Op de eerste dag van het uitsterven en de eerste boost in het indrukken van de hefboom werd waargenomen, gevolgd door een afname van de respons op beide hendels. Na instrumentele uitsterving, herintroductie van cues herstelde cocaïne zoeken vertegenwoordigd door een toename van het aantal actieve hefboomresponsen. Optical LTD veroorzaakte een aanzienlijke vermindering van actieve hendeldrukken ten opzichte van bedieningselementen.

Zeven dagen later werden ratten opnieuw getest. Dieren die eerder MGN-LA LTD ondergingen, hadden een significant verminderde actieve hendeldruk in vergelijking met controles, waaruit bleek dat optische LTD op lange termijn een afname van cocaïne zoeken produceerde. Ex vivo elektrofysiologische opnames toonden een afname van de amplitude van optisch opgewekte exciterende postsynaptische stroom in LA-neuronen, na optische LTD.

Bovendien werd de stijgingshelling van exciterende postsynaptische potentialen verminderd door ex vivo optische stimulatie in de neuronen, van dieren die schijnstimulatie hadden, maar niet in neuronen van dieren die in vivo optische LTD hadden. De plaatsing van optische vezelimplantaten en virale expressie werden histologisch geverifieerd in de laterale amygdala en MGN. Om cocaïnezoekgedrag met succes te verminderen, is het van cruciaal belang om een goede lichtopbrengst te bereiken via de optische vezelimplantaten en om aanhoudende, laagfrequente stimulatie te gebruiken om langdurige depressie te bevorderen.

Na deze procedure kunnen neurale opnametechnieken worden gebruikt om veranderingen in neurale activiteit te bepalen en kunnen andere gedragstests van cocaïnezoekend of ander aangeleerd gedrag worden uitgevoerd.