Een robuust ontdekkingsplatform voor de identificatie van nieuwe mediatoren van melanoommetastase

Dit protocol beschrijft een reeks technieken binnen een continue workflow die kunnen worden gebruikt voor het beoordelen van de in vivo effecten van kandidaat-regulatoren van melanoommetastase, maar ook van metastase van andere solide maligniteiten. Het belangrijkste voordeel van onze systematische workflow is een verhoogde reproduceerbaarheid van de gegevens dankzij robuuste en gestandaardiseerde in vivo modellen en technieken. Deze pijplijn biedt een pad voor doelontdekking en therapieontwikkeling door kandidaten te testen die zijn afgeleid van Omics-gegevens of in vitro assays in een in vivo setting.

De leercurve die verband houdt met de technieken die in dit protocol worden gepresenteerd, wordt verkort door de verstrekte materialen te gebruiken en de gedetailleerde beschrijving te volgen bij het oefenen van de stappen. Orlando Aristizabal, een onderzoekswetenschapper in The Preclinical Imaging Core en Ran Moubarak, een instructeur in mijn lab, helpen om de procedure te demonstreren. Voor intradermale injecties, verdoven en scheren van een acht tot 10 weken oude muis in een bioveiligheidskast met behoud van aseptische omstandigheden.

Pak vervolgens de huid vast en trek deze naar achteren tegen het traject van de naaldsteek en prik met behulp van een zes millimeter lange, 31 gauge insulinespuitnaald voorzichtig de huid in een acute hoek met de schuine kant naar boven gericht. Injecteer langzaam 30 microliter van de tumorcelsuspensie, totdat een koepelvormig wiel wordt waargenomen. Monitor de progressie van de tumorgroei, gewichtsverlies en algehele gezondheidsstatus.

Neem tijdens deze monitoringsessies metingen met remklauwen en gebruik de lengte- en breedtedimensies van de tumor om het volume te berekenen. Breng voor intracardiale injecties een verdoofde muis over op het verwarmde platform van het echoapparaat. Gebruik vervolgens hypoallergene tape om de muis aan de neuskegel vast te zetten.

Scheer de thorax met een recht scheermesje of een scalpelmesje, gekanteld in een hoek van 30 graden en reinig de huid rond het proceduregebied met 10% povidonjodium. Plaats vervolgens de ultrasone sonde in het midden van de thorax aan de linkerkant van de muis om een horizontaal venster vast te leggen dat is georiënteerd om een dwarsdoorsnede van de linker ventrikel te verkrijgen. Met de lange as van de sonde naar boven gericht, bevestigt u de sonde in een hoek van 50 graden en het verwarmde platform in een hoek van 20 graden en vergrendelt u vervolgens de sonde en het steunframe in de positie.

Terwijl u in de veiligheidskast werkt, trekt u de celsuspensie op in een tuberculinespuit van één milliliter met een naald van 30 gauge één inch. Verwijder alle luchtbellen in de spuit. Vergrendel de spuit in de stereotactische injector.

En dan onder echografische begeleiding, duw de naald door de thoracale wand in de linker ventrikel van het hart en injecteer langzaam 100 tot 250 microliter van de tumorcelsuspensie. Voor gefaseerde overlevingsoperaties plaatst u de verdoofde muis op het verwarmingskussen en reinigt u de huid rond het ingreepgebied met een 10% povidon jodiumoplossing. Nadat u steriele persoonlijke beschermingsmiddelen en handschoenen hebt aangetrokken, legt u een steriel gordijn over het lichaam van het dier.

Snijd vervolgens met behulp van een Iris-schaar of een scalpel de huid in, met behoud van een resectiemarge van vijf tot zeven millimeter vanaf de rand van de tumor. In het geval van intradermale tumoren, reseceer de tumor samen met de omtrekkende huid. Voor subcutane tumoren, ontleed en verwijder de tumor onder de huid.

Sluit na tumorresectie de wond met een nietapparaat van negen millimeter. Voor in vivo beeldvorming dient u d-luciferinesubstraat toe aan de muis door middel van intraperitoneale injectie met een insulinespuit van één milliliter en een naald van 28 gauge, verdooft u de muis en plaatst u deze in een neuskegel in de bioluminescentiebeeldvormingsscanner. Start het instrument door op initialiseren te drukken en stel de belichtingstijd in op automatisch.

Als u een lege afbeelding wilt vastleggen voor het aftrekken op de achtergrond, klikt u op verkrijgen en slaat u de afbeelding op nadat de acquisitiereeks is voltooid. Voor data-analyse en dezelfde in vivo beeldvormingssoftware navigeert u naar de map waarin de afbeeldingen zijn opgeslagen en opent u de afbeeldingen van alle muizen uit één experiment. Stel de eenheden in op uitstraling en zorg ervoor dat het selectievakje dat het individu aangeeft niet is aangevinkt, omdat dit normalisatie van het signaal tussen groepen voorkomt.

Teken vervolgens met behulp van de interessegebied of ROI-tekentool circulaire ROI's voor het hersengebied en rechthoekige ROI's voor het lichaam, sluit de oren en neus in de ROI van de hersenen uit omdat ze de neiging hebben om niet-specifieke luminantie uit te stralen. Om vertekening te minimaliseren, tekent u ROI's op de foto's van de muizen zonder dat het luminescerende signaal eroverheen is gelegd, selecteert u vervolgens de ROI's van meten om het signaal te kwantificeren en exporteert u de gegevens naar een spreadsheet. Analyseer verschillen tussen groepen door de totale luminescerende flux in lichaamsdelen van belang uit te zetten.

Na een NuMA-kleuring met behulp van software, tekent u een ROI om alle NuMA-gekleurde cellen in het orgaanweefsel op te nemen, behalve andere orgaanparenchymen en lege ruimtes. Pas de instellingen aan om de Positieve en NuMA-negatieve cellen te categoriseren met behulp van de juiste positieve en negatieve controles voor elk orgaan. Gebruik een gevestigd softwarealgoritme om het totale aantal NuMA-positieve cellen voor elk monster te kwantificeren.

Bioluminescentie, helder veld, ex vivo fluorescentie en hematoxyline- en eosinekleuringsbeelden illustreren de veelzijdige benadering voor de analyse van kandidaat-geneneffecten op melanoommetastase. Fucosyltransferase-uitschakeling verminderde de gemetastaseerde verspreiding van melanoomcellen. De NuMA-gekleurde longsecties van melanoomcellen die zijn geïnfecteerd met het Linda-virus en met een metastaseonderdrukker die het Linda-virus tot expressie brengt, worden hier weergegeven.

De gemetastaseerde melanoomcellen worden groen gelabeld en het orgaangebied wordt afgebakend door een groene gearceerde lijn. Het handhaven van de juiste spanning in de huid bij het uitvoeren van intradermale injecties, het vermijden van luchtembolie bij het bereiden van spuiten en het verkrijgen van voldoende resectiemarges die de voortbeweging van het dier niet mogen verstoren of vatbaar maken voor wondcomplicaties, helpen het slagingspercentage en de reproduceerbaarheid te verbeteren. Verdere inzet van multiplex beeldvorming om immuunfiltratie, single cell RNA sequencing voor genexpressie analyse en ruimtelijke transcriptomics te onderzoeken zou allemaal complementaire wegen kunnen bieden om intratumorale heterogeniteit te onderzoeken.

De combinatie van technieken die in dit protocol worden beschreven, hielp ons bij het identificeren van nieuwe regulatoren in melanoom hersenmetastase, zoals de rol van melanoom uitgescheiden amyloïde bèta bij het onderdrukken van neuro-inflammatie en het bevorderen van hersenmetastase.