Name: Onderzoek naar hartmetabolisme in het geïsoleerde geperfuseerde muizenhart met hyperpolarisatie 1-13 C pyruvaat en 13C / 31P NMR-spectroscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 56 s
Description: Leer hoe je hartmetabolisme bestudeert in geïsoleerde geperfuseerde muizenharten met hyperpolariseerde [1-13C]pyruvaat en 13C/31P NMR-spectroscopie. Deze methode kwantificeert LDH- en PDH-activiteit en cardiale energetica in real-time.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit project ontving financiering van de Israel Science Foundation onder subsidieovereenkomst nr. 1379/18; de Jabotinsky-beurs van het Israëlische ministerie van Wetenschap en Technologie voor toegepaste en technische wetenschappen voor directe promovendi nr. 3-15892 voor DS; en het Horizon 2020-onderzoeks- en innovatieprogramma van de Europese Unie onder subsidieovereenkomst nr. 858149 (AlternativesToGd).

De gezamenlijke ethische commissie (IACUC) van de Hebreeuwse Universiteit en het Hadassah Medical Center keurden het studieprotocol voor dierenwelzijn goed (MD-19-15827-1).
1. Krebs-Henseleit buffervoorbereiding
<ol><li>Maak een dag voor het experiment een aangepaste versie van de Krebs-Henseleit-buffer (KHB)26. Los in eerste instantie 118 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 0,5 mM pyruvaat, 1,2 mM MgSO 4, 25 mM NaHCO3 en 1,2 mM KH 2 PO4 op in dubbel gedestilleerd H2O.</li>
	<li>Blaas dit mengsel met 95%/5% O 2/CO 2 gedurende 20 minuten en voeg vervolgens 1,2 mM CaCl2 toe.</li>
	<li>Stel de pH van de buffer in op 7,4 met HCl of NaOH.</li>
	<li>Voeg op de dag van het experiment 10 mM glucose en 72 U/L insuline toe aan de KHB bereid in stap 1.2. OPMERKING: Insuline wordt toegevoegd aan de perfusiebuffer zoals beschreven in het werk van Kolwicz et al.26 en in overeenstemming met eerdere studies die melden dat insuline de contractiele functieverhoogt 27 en de intensiteit van het hyperpolarized [13C] bicarbonaatsignaal 28.</li>
</ol>2. Voorbereiding van het perfusiesysteem
<ol><li>Bewaar een reservoir van 200 ml KHB in een waterbad bij 40 °C en bel met 95%/5% O 2/CO2 bij een stroomsnelheid van 4 l/min gedurende 1 uur voorafgaand aan hartperfusie. Houd de buffer gedurende het hele experiment continu borrelend met dit gasmengsel.<ol><li>Stel eerst het waterbad in op 40 °C. Plaats het KHB-reservoir. Gebruik een peristaltische pomp (zie materiaaltabel) en verlengbuizen van medische kwaliteit om de KHB tussen het bufferreservoir en de 10 mm NMR-buis te recirculeren met een constant debiet van 7,5 ml / min.</li>
		<li>Sluit drie platina uitgeharde siliconenbuizen (3 mm i.d.) aan op de pomp (één instroombuis en twee uitstroombuizen voor de KH-buffer). Plaats de uitstroom- en instroomleidingen in de verwarmde KH-buffer. Steek vervolgens de zuurstofleiding in de verwarmde KH-buffer.</li>
		<li>Gebruik dunne polyetheretherketon (PEEK, zie tabel met materialen) lijnen voor de buffer en het hypergepolariseerde middel om van en naar de NMR-buis in de boring van de spectrometer te stromen.</li>
	</ol></li>
	<li>Zorg ervoor dat de temperatuur op 37-37,5 °C wordt gehouden. Volg de onderstaande stappen.</li>
	<li>Wikkel de instroomleiding (van het bufferreservoir naar de NMR-buis) met een verwarmingstape die is ingesteld op 42 °C.</li>
	<li>Verwarm de NMR-buis in de spectrometer met een warme luchtstroom die wordt geregeld door de spectrometer.</li>
	<li>Gebruik een NMR-compatibele temperatuursensor (zie materiaaltabel) om de temperatuur in de NMR-buis te meten. De temperatuur wordt ingesteld op 37-37,5 °C.</li>
</ol>3. Kalibratie en voorbereiding van de NMR-spectrometer voor acquisitie
<ol><li>Plaats op de dag van het experiment een standaardmonster van 13 C dat 1,4-dioxaan (materiaaltabel) bevat in de spectrometer en stem de NMR-sonde af en match deze voor 13C. Verkrijg vervolgens een spectrum met het thermisch evenwichtssignaal van 1,4-dioxaan met een nutatiehoek van 90°.</li>
	<li>Vervang nu het 13C-standaardmonster met een 31 P-standaardmonster (materiaaltabel), dat 105 mM ATP bevat in D2O. Stem af en match de NMR-sonde voor 31P. OPMERKING: Een spectrum dat de fosfaatsignalen van het thermisch evenwicht weergeeft, wordt verkregen met een nutatiehoek van 50°.</li>
	<li>Plaats de instroomleiding, de uitstroomleiding en de temperatuurvoeler in een NMR-buis van 10 mm en steek de buis vervolgens in de magnetische boring. Stel de verwarmingsband in op 42 °C.</li>
	<li>Verkrijg een 31P NMR-spectrum van de circulerende KH-buffer om gedurende 30 minuten in dat experiment te worden gebruikt, met een nutatiehoek van 50 ° en een TR van 1,1 s (1.640 acquisities).</li>
</ol>4. Diervoorbereiding, chirurgische procedure en perfusie van het hart in de NMR-buis
<ol><li>Verdoof een mannelijke HSD:ICR (CD-1) muis met 3,3% isofluraan in kamerlucht (Materiaalopgave) bij 340 ml/min gedurende 5 minuten met behulp van een gasanesthesiesysteem (Materiaaltafel) in een inductiekamer.</li>
	<li>Gebruik nasale anesthesie voor het onderhoud van algemene anesthesie met 2,9% isofluraan. OPMERKING: Er wordt voor gezorgd dat pijn en ongemak voor het dier tot een minimum worden beperkt.</li>
	<li>Bevestig de ledematen van het dier met tape, zorg voor een negatieve pedaalpijnreflex en injecteer vervolgens 300 IE natriumheparine intraperitoneaal.</li>
	<li>Maak de borstwand en buik van de muis grondig nat met 70% alcohol om reinheid te garanderen en haarbesmetting of obstructie tijdens de chirurgische ingreep te voorkomen.</li>
	<li>Knip 1 minuut na de heparine-injectie de huid en spieren van de buikholte af met een kleine schaar.</li>
	<li>Plaats de kleine hemostat-locking muggenklem met gebogen kaak tussen het xiphoid-proces en de borsthuid om de borstkas op te tillen en het middenrif bloot te leggen. Prik en snijd de rechterkwab van het middenrif.</li>
	<li>Snijd de borst over de middellijn, trek je terug naar de zijkanten en verwijder vervolgens.</li>
	<li>Injecteer de linker ventrikel van het hart met 200 IE natriumheparine om bloedstolling te voorkomen. Injecteer vervolgens 0,1 ml ijskoude 0,5 mol/L KCl om een hartstilstand te krijgen, zoals eerder beschreven25. Een hartstilstand is essentieel om het hart te kunnen cannuleren.</li>
	<li>Identificeer de thymus en verwijder deze met een schaar om de aorta bloot te leggen. Verwijder resterend ribbenkastweefsel.</li>
	<li>Identificeer de aortaboog en gebruik een gebogen tang om een losse knoop met een 3-0 zijden hechtdraad (Table of Materials) rond de opgaande aorta te plaatsen. Injecteer 3 ml KHB in de linker ventrikel om bloedstolsels uit de aorta te verwijderen.</li>
	<li>Gebruik een gebogen tang om het hart inferieur in te trekken voor een betere visualisatie van de opstijgende aorta.</li>
	<li>Voer cannulatie in situ uit met een intraveneuze katheter van 22 G (materiaaltabel). Breng cyanoacrylaatlijm aan in het gecannuleerde gebied en voer vervolgens dubbele hechtdraadbinding uit. Injecteer extra KH-buffer in het hart en controleer of deze door de cannulatiebuis stroomt.</li>
	<li>Verwijder de gebogen tang. Koppel het hart los van de omringende ingewanden en doordrenk het retrograde met ijskoude KHB (4 °C) via de intraveneuze katheter.</li>
	<li>Verbind het hart met de instroomlijn van het perfusiesysteem via de intraveneuze katheter. Bij het begin van de perfusie met warme buffer (37-37,5 °C) bij 7,5 ml / min begint het hart spontaan te kloppen.</li>
	<li>Bevestig de NMR-buis met het kloppende hart, de uitstroomlijnen en de temperatuursonde en steek deze in de boring van de spectrometer, zodat het hart zich in het midden van de NMR-sonde bevindt.</li>
</ol>5. Het verzamelen van gegevens voor cardiale energetica en pH
<ol><li>Verkrijg 31P spectra gedurende ongeveer 1 uur met een fliphoek van 50 ° en een TR van 1,1 s.</li>
</ol>6. DNP-spinpolarisatie en -oplossing
<ol><li>Bereid een 28,5 mg formulering van [1-13C] pyruvaat. Deze formulering bestaat uit 11,1 mM tot 14,0 mM OX063 radicaal in het nette zuur.</li>
	<li>Bereid 4 ml oplosmiddel. Het oplosmedium bestaat uit TRIS-fosfaatbuffer, die 11,2 mM NaH 2 PO 4, 38,8 mM Na 2 HPO4, 33 mM TRIS en2mM HCl bevat. Deze mediumsamenstelling wordt zodanig aangepast dat bij toevoeging van 28,5 mg [1-13C] pyruvinezuurformulering aan 4 ml van deze buffer (in de oplosfase), de pH van de resulterende oplossing 7,4 zal zijn.</li>
	<li>Voer spinpolarisatie en snelle oplossing uit in een ontbindings-DNP (dDNP) spinpolarisatieapparaat volgens de instructies van de fabrikant (materiaaltabel). Breng microgolfbestraling aan met een frequentie van 94,110 GHz voor de polarisatie van de [1-13C] pyruvinezuurformulering bij 1,45 K tot 1,55 K gedurende ongeveer 1,5 uur.</li>
	<li>Meng snel de 4 ml hypergepolariseerd medium van het dDNP-apparaat met een goed geoxygeneerde oplossing die het hypergepolariseerde oplosmedium aanvult om een samenstelling te verkrijgen die nauw aansluit bij het perfusiemedium. OPMERKING: Het uiteindelijke volume van het medium dat het hart doordrenkt tijdens de hyperpolarisatie-injecties met 14 mM hyperpolarized [1-13C] pyruvaat is 26 ml. De uiteindelijke samenstelling van het geïnjecteerde medium (na mengen) bevat 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgSO 4, 70 mM NaCl, 25 mM NaHCO3, 1,2 mM KH 2 PO4, 10 mM glucose, 1,2 mM CaCl2en 72 U/L insuline.</li>
	<li>Dien het hyperpolarized [1-13C]pyruvaatbevattende medium toe aan het geïsoleerde hart met behulp van een continue stroomopstelling29. OPMERKING: Dit wordt gedaan om ervoor te zorgen dat de hartperfusie op geen enkel moment tijdens het experiment wordt verstoord en dat het hyperpolariseerde medium wordt toegediend met een bekende snelheid en voor een bekende duur.</li>
</ol>7. Hyperpolarized 13C spectroscopie
<ol><li>Verkrijg hyperpolarized 13C-gegevens met behulp van productselectieve verzadigings-excitatiepulsen 15 door 2,5 ms kardinale sinus (Sinc) pulsen toe te passen, zoals eerder beschreven15,16. Prikkel selectief [1-13 C]lactaat en [13C]bicarbonaat achtereenvolgens met intervallen van 6 s om een interval van 12s voor elke metaboliet te verkrijgen.</li>
	<li>Voor [1-13 C]lactaatdetectie centreert u de selectieve Sinc-puls op de [1-13 C]pyruvaathydraatfrequentie (179,4 ppm), wat resulteert in een signaalintensiteitsverhouding (lac) van 0,113 voor de C 1-signalen van [1-13 C]pyruvaat tot [1-13C]lactaat.</li>
	<li>Voor [13 C]bicarbonaatdetectie centreert u de selectieve Sinc-puls op 157,7 ppm, wat neerwaarts 214 Hz is van het [13C]bicarbonaatsignaal (161,1 ppm); dit resulteert in een signaalintensiteitsverhouding (bic) van 0,139 voor het C 1-signaal van [1-13C]pyruvaat tot [13C]bicarbonaat.</li>
</ol>8. Bepaling van het natte gewicht en volume van het weefsel
<ol><li>Maak aan het einde van het experiment het hart los van het perfusiesysteem en droog het voorzichtig af met tissuepapier. Weeg vervolgens het hart om het natte gewicht van het weefsel te verkrijgen.</li>
	<li>Bepaal het volume van het hart met behulp van een dichtheidsfactor van 1,05 g/cm3, zoals eerder bepaald voor het muizenhart30.</li>
</ol>9. Kwantificering van het ATP-gehalte
<ol><li>Integreer het γ-ATP-signaal van een enkele acquisitie van het ATP-standaardmonster en een 30 minuten acquisitie (TR van 1,1 s en 1.640 acquisities) van het geïsoleerde hart.</li>
	<li>Kwantificeer het ATP-gehalte van het hart door de integraal van het γ-ATP-signaal van het hart te vergelijken met die van de standaard (Tabel van Materialen), waar deze laatste een bekende concentratie heeft (105 mM), en corrigeer voor het aantal acquisities en ontspanningseffecten.</li>
</ol>10. Het oplossen van het Pi-signaal van het hart
OPMERKING: Om de pH van het weefsel te evalueren, is het eerst nodig om het Pi-signaal van het hart te deconvolveren van dat van het totale Pi-signaal (Pit). Dit wordt gedaan door het signaal van de KHB Pi (PiKH) weg te laten van dat van de Pit.
<ol><li>In een 31P-spectrum van KHB dat een enkel Pi-signaal toont (PiKH, Figuur 1A), past u het PiKH-signaal aan op een Lorentzian-functie met behulp van Excel (Table of Materials).</li>
	<li>Het volume dat zichtbaar is voor de NMR-sonde (Vp, 1,375 ml), bevat meer KHB wanneer de monsterbuis het hart niet bevat. Om voor dit vuleffect te corrigeren, berekent u het verzwakte buffersignaal (Pib) met behulp van Eq. 1A. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq01.jpg" style="margin: auto;">Eq. 1A waarbij Vh het volume van het hart is, zoals bepaald in stap 8.</li>
	<li>Trek dit signaal af van de Pit volgens Eq. 1B om het Pi-signaal te verkrijgen dat uitsluitend afkomstig is van het doordrenkte hart (Pih, figuur 1B). <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq02.jpg" style="margin: auto;">Eq. 1B</li>
</ol>11. Multiparametrische pH-analyse
<ol><li>Voer de conversie uit van de chemische verschuivingsverdeling van het Pih-signaal naar de pH met betrekking tot de chemische verschuiving van PCr met behulp van Eq. 231. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq03.jpg" style="margin: auto;">Eq. 2 waarbij Δδ het chemische verschuivingsverschil is, pKa 6,72, δ vrije base 5,69 en δ vrij zuur 3,27 is, zoals eerder beschreven31.</li>
	<li>Corrigeer de resulterende pH-verdelingscurve voor de niet-lineariteit tussen de Pih chemische verschuivingsschaal en de pH-schaal volgens Lutz et al.32. Een typische pH-verdeling die uit deze berekening voortvloeit, is weergegeven in figuur 1C.</li>
	<li>Analyseer de pH-verdeling van het weefsel met een multiparametrische benadering met behulp van zeven statistische parameters volgens het werk van Lutz et al. 32. Vier van deze parameters worden hier gepresenteerd, aangezien zij de meest beschrijvende van de weefsel-pH lijken te zijn: 1) globale maximale pH; 2) gewogen gemiddelde pH; 3) gewogen mediane pH; en 4) scheefheid van de pH-plot (figuur 1C).</li>
</ol>12. Berekening van de LDH- en PDH-activiteiten
OPMERKING: De productiesnelheden van de hyperpolariseerde metabolieten [1-13 C]lactaat en [13C]bicarbonaat worden gebruikt om respectievelijk de LDH- en PDH-activiteiten te berekenen. In de productselectieve verzadigings-excitatiebenadering15 worden alleen nieuw gesynthetiseerde hyperpolariseerde metabolieten gedetecteerd door elke selectieve excitatie.
<ol><li>Gebruik het hyperpolarized [1-13C]pyruvaatsignaal als referentie om het overeenkomstige metabolietproductieniveau te bepalen.<ol><li>Tijdens de perfusie met het hypergepolariseerde medium neemt de [1-13 C]pyruvaatconcentratie in de NMR-buis toe (wash-in), vervolgens plateaus (bij een maximale concentratie van 14mM) en neemt vervolgens af (wash-out).</li>
		<li>Om de tijdstippen te identificeren waarop de pyruvaatconcentratie een constant niveau (plateau) bereikte, corrigeert u het [1-13C] pyruvaatsignaal voor signaalverval als gevolg van T1-relaxatie en RF-pulsatie met behulp van de effectieve relaxatieconstante, Teff.</li>
		<li>Definieer voor elke injectie de Teff op basis van zijn vermogen om de [1-13C]pyruvaatvervalcurve te corrigeren om deze stromingsdynamiek weer te geven (Eq.3). <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq04.jpg" style="margin: auto;">Eq. 3 waar <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq05.jpg" style="margin: auto;"> het [1-13 C]pyruvaatsignaal is dat werd verkregen tijdens de [13C]bicarbonaatacquisitie. De gemiddeldeT-eff in de hierin beschreven experimenten bleek 35,8 s ± 2,3 s (n = 5 harten) te zijn.</li>
		<li>Selecteer de gegevenspunten waarin de concentratie binnen 10% van het maximaal gecorrigeerde [1-13C] pyruvaatsignaal ligt voor verdere analyse.</li>
	</ol></li>
	<li>Gebruik de overeenkomstige gegevens van [1-13 C]lactaat- en [13C]bicarbonaatproductie voor de in stap 12.1geselecteerde tijdstippen voor de berekening van de metabolietproductiesnelheden met behulp van Eq. 4A en Eq. 4B, op voorwaarde dat de SNR van het metabolietsignaal groter is dan 2 (drempel voor analyse). Een typisch voorbeeld van een dergelijke selectie van tijdspunten wordt weergegeven in figuur 2B (gemarkeerd temporeel venster).</li>
	<li>Bereken de productiesnelheden van elk van de geselecteerde gegevenspunten met behulp van Eq. 4A en Eq. 4B: <img alt="Equation 17" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq17.jpg" style="margin: auto;">Eq. 4A <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq06.jpg" style="margin: auto;">Eq. 4B waarbij <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq07.jpg" style="margin: auto;"> en zijn de productiesnelheden van respectievelijk [1-13C]lactaat of [13 C]bicarbonaat op elk tijdstip. en zijn factoren die de relatieve excitatie van respectievelijk [1-13 C]pyruvaat en <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq08.jpg" style="margin: auto;"> de producten [1-13 C]lactaat of [13C]bicarbonaat vertegenwoordigen. <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq09.jpg" style="margin: auto;"> <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq10.jpg" style="margin: auto;"> Deze factoren werden eerder bepaald op respectievelijk 0,113 en 0,13929. Vp is het volume dat wordt gedetecteerd door de NMR-sonde (1,375 ml), TR geeft het tijdsinterval aan tussen twee opeenvolgende productselectieve verzadigingsexcitaties (12 s voor elk product), <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq11.jpg" style="margin: auto;"> en zijn de signalen van respectievelijk [1-13C]lactaat en [13 C]bicarbonaat, en en zijn de signalen van [1-13 C]pyruvaat die werden verkregen tijdens het [1-13 C]lactaat en <img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq13.jpg" style="margin: auto;"> <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq12.jpg" style="margin: auto;"> <img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq14.jpg" style="margin: auto;"> [13 C]bicarbonaat excitaties, respectievelijk. [Pyr] is de [1-13C]pyruvaatconcentratie, die 14 mM was tijdens de plateaufase.<ol><li>Bepaal de snelheid voor elk punt en vervolgens het gemiddelde per hypergepolariseerde injectie.</li>
	</ol></li>
</ol>

Er zijn geen onthullingen.

We demonstreren een experimentele opstelling die is ontworpen om hyperpolarized [1-13C] pyruvaatmetabolisme, weefsel-energetica en pH te onderzoeken in een geïsoleerd muizenhartmodel.
De kritieke stappen binnen het protocol zijn als volgt: 1) ervoor zorgen dat de pH van de buffer 7,4 is; 2) ervoor zorgen dat alle componenten van de buffer worden opgenomen; 3) het vermijden van bloedstolling in de hartvaten door heparine-injecties; 4) het vermijden van ischemische schade aan het hart...

Veranderingen in het hartmetabolisme zijn geassocieerd met een verscheidenheid aan cardiomyopathieën en vormen vaak de basis van de onderliggende pathofysiologische mechanismen1. Er zijn echter tal van obstakels voor het bestuderen van het metabolisme in levende weefsels, omdat de meeste biochemische testen de homogenisatie van het weefsel en de cellyse en / of radioactieve tracering vereisen. Daarom is er een dringende behoefte aan nieuwe hulpmiddelen om het myocardiale metabolisme in levende weefsels te onderzoeken. Magnetische resonantie (MR) van hyperpolariseerde 13C-gelabelde substraten maakt real-time metingen van het metabolisme in levende weefsels2 mogelijk, zonder het gebruik van ioniserende straling, door de MR-signaal-ruis (SNR) -verhouding van de gelabelde plaats (en) met verschillende ordes van grootte3 te verhogen. Hier beschrijven we een experimentele opstelling, een acquisitiebenadering en een analytische benadering voor het bestuderen van het snelle metabolisme in het geïsoleerde muizenhart en, parallel daaraan, presenterende indicatoren van algemene weefselenergetica en zuurgraad. De cardiale pH is een waardevolle indicator, omdat de zuur-base balans wordt verstoord in de vroege stadia van hartaandoeningen en aandoeningen zoals myocardiale ischemie, onaangepaste hypertrofie en hartfalen6.
Hyperpolarized [1-13 C]lactaat en [13 C]bicarbonaat productie uit hyperpolarized [1-13C]pyruvaat helpt bij het bepalen van de productiesnelheden van lactaatdehydrogenase (LDH) en pyruvaatdehydrogenase (PDH). De meeste eerdere studies uitgevoerd met behulp van hyperpolariseerde substraten in het geïsoleerde knaagdierhart gebruikten ofwel complexe kinetische modellen om de enzymatische activiteit van LDH en PDH af te leiden, of rapporteerden de signaalintensiteitsverhoudingen van het hyperpolariseerde product naar een substraat zonder de werkelijke enzymactiviteitssnelheden 2,4,5,6,7,8,9,10 te berekenen, 11,12,13,14. Hier gebruikten we de productselectieve verzadigings-excitatiebenadering 15, die het mogelijk maakt om de enzymactiviteit op een modelvrije manier te monitoren15,16. Op deze manier werden de absolute enzymatische snelheden (d.w.z. het aantal mol geproduceerd product per tijdseenheid) bepaald. 31 P-spectroscopie werd gebruikt om de signalen van anorganisch fosfaat (Pi), fosfocreatine (PCr) en adenosinetrifosfaat (ATP) te observeren. Een multiparametrische analyse werd gebruikt om de pH-verdeling van het hart te karakteriseren, zoals aangetoond door de heterogene chemische verschuiving in het Pi-signaal van het weefsel.
Het retrograde doordrenkte muizenhart (Langendorffhart)17,18,19 is een ex vivo model voor het intacte kloppende hart. In dit model worden de levensvatbaarheid van het hart en de pH gedurende ten minste 80 min20 behouden en heeft het potentieel voor herstel aangetoond na een langdurig ischemisch letsel21,22. Niettemin kan onbedoelde variabiliteit tijdens microchirurgie leiden tot variabiliteit in de levensvatbaarheid van het weefsel over de harten. Eerdere studies hebben gerapporteerd over de verslechtering van dit hart in de loop van de tijd19; Er is bijvoorbeeld een vermindering van de contractiele functie van 5% -10% per uur waargenomen18. Van het adenosinetrifosfaat (ATP) signaal is eerder aangetoond dat het rapporteert over de myocardiale energetische status en levensvatbaarheid23. Hier merkten we op dat het doordrenkte hart af en toe onbedoelde variabiliteit in levensvatbaarheidsniveaus kan vertonen, zoals aangetoond door het ATP-gehalte, ondanks het feit dat we een ononderbroken perfusie en zuurstoftoevoer hadden. We tonen hier aan dat het normaliseren van de LDH- en PDH-snelheden naar het ATP-gehalte van het hart de interhartvariabiliteit in deze snelheden vermindert.
In het volgende protocol beschrijven we de chirurgische procedure die wordt gebruikt voor hartcannulatie, isolatie en daaruit voortvloeiende perfusie in de NMR-spectrometer. Van belang is dat andere chirurgische benaderingen gericht op het isoleren en perfuseren van het muizenhart zijn beschreven vóór24,25.
De methodologieën die worden gebruikt voor het verkrijgen van gegevens met betrekking tot enzymatische snelheden in het kloppende hart (met behulp van 13 C-spectroscopie en hyperpolarisatie [1-13C] pyruvaat) en de levensvatbaarheid en zuurgraad van het hart (met behulp van 31P NMR-spectroscopie) worden ook beschreven. Ten slotte worden de analysemethoden voor het bepalen van metabole enzymactiviteiten en de levensvatbaarheid en zuurgraad van weefsel uitgelegd.

<table><tbody><tr><td>Uitrusting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HyperSense DNP Polariser</td><td>Oxford Instruments</td><td>52-ZNP91000</td><td>HyperSense, 3.35 T, preclinical dissolution-DNP hyperpolarizer</td></tr><tr><td>NMR spectrometer&nbsp;</td><td>RS2D</td><td></td><td>NMR Cube, 5.8 T, uitgerust met een 10 mm breedbandsonde</td></tr><tr><td>Peristaltische pomp&nbsp;</td><td>Cole-Parmer</td><td>07554-95</td><td></td></tr><tr><td>Temperatuursonde</td><td>Osensa</td><td>FTX-100-LUX+</td><td>NMR-compatibele temperatuur sonde</td></tr><tr><td>Somnosuite laag-flow anesthesie systeem</td><td>Kent Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lijnen, slangen, hechtdraad</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Platinakuur siliconen slangen</td><td>Cole-Parmer</td><td>HV-96119-16</td><td>L/S 16 I.D. 3.1 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Dunne polyether ether ketone (PEEK) lijnen</td><td>Upchurch Scientific</td><td></td><td>id. 0.040&rdquo;</td></tr><tr><td>Intraveneuze katheter&nbsp;</td><td>BD Medical</td><td>381323</td><td>22 G</td></tr><tr><td>Zijde hechtdraad</td><td>Ethicon</td><td>W577H</td><td>Draadmikt van 3-0</td></tr><tr><td>Chemie en farmaceutische producten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>[1-13C]pyruvinezuur</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>CLM-8077-1</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21074</td><td>CAS: 10043-52-4</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td>CAS: 50-99-77</td></tr><tr><td>Heparine natrium</td><td>Rotexmedica</td><td>HEP5A0130C0160</td><td></td></tr><tr><td>Zoutzuur 37%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td><td>CAS: 7647-01-0</td></tr><tr><td>Insulin aspart (NovoLog)</td><td>Novo Nordisk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isofluraan</td><td>Terrel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793612</td><td>CAS: 7487-88-9</td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504</td><td>CAS: 7447-40-7</td></tr><tr><td>Kaliumfosfaat monobasisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td>CAS: 7778-77-0</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonaat</td><td>Gadot Group</td><td></td><td>CAS: 144-55-8</td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td>CAS: 7647-14-5</td></tr><tr><td>Natriumhydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>655104</td><td>CAS: 1310-73-2</td></tr><tr><td>Natriumfosfaat dibasisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td>CAS: 7558-79-4</td></tr><tr><td>Natriumfosfaat monobasisch dihydraat</td><td>Merck</td><td>6345</td><td>CAS: 13472-35-0</td></tr><tr><td>TRIS (biotechnologie kwaliteit)</td><td>Amresco</td><td>0826</td><td>CAS: 77-86-1</td></tr><tr><td>Trityl radicaal OX063</td><td>GE Healthcare AS</td><td>NC100136</td><td>OX063</td></tr><tr><td>NMR standaarden</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>13C standaard monster</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-72A</td><td>40% p-dioxaan in benzeen-D6</td></tr><tr><td>31P standaard monster</td><td>In house gemaakt</td><td></td><td>105 mM ATP en 120 mM fenylfosfonzuur in D2O</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel 2016</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MNova</td><td>Mestrelab Research</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

onderzoek naar hartmetabolisme in het geïsoleerde geperfuseerde muizenhart met hyperpolarisatie [1-13 c] pyruvaat en 13c / 31p nmr-spectroscopie

Investigating Cardiac Metabolism in the Isolated Perfused Mouse Heart with Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate and 13C/31P NMR Spectroscopy

Metabolisme is de basis van belangrijke processen in het cellulaire leven. Het karakteriseren van hoe metabole netwerken functioneren in levende weefsels biedt cruciale informatie voor het begrijpen van het mechanisme van ziekten en het ontwerpen van behandelingen. In dit werk beschrijven we procedures en methodologieën voor het bestuderen van in-cell metabole activiteit in een retrograde geperfuseerd muizenhart in real-time. Het hart werd geïsoleerd in situ, in combinatie met een hartstilstand om de myocardiale ischemie te minimaliseren en werd geperfundeerd in een nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectrometer. Terwijl in de spectrometer en onder continue perfusie, hyperpolarized [1-13C] pyruvaat werd toegediend aan het hart, en de daaropvolgende hyperpolarized [1-13 C] lactaat en [13C] bicarbonaat productiesnelheden dienden om, in real-time, de snelheden van lactaatdehydrogenase en pyruvaatdehydrogenase productie te bepalen. Deze metabole activiteit van hyperpolarized [1-13C] pyruvaat werd gekwantificeerd met NMR-spectroscopie op een modelvrije manier met behulp van de productselectieve verzadiging-excitatie-acquisitiebenadering. 31 P-spectroscopie werd toegepast tussen de hyperpolarisatie-acquisities om de cardiale energetica en pH te controleren. Dit systeem is uniek nuttig voor het bestuderen van metabole activiteit in het gezonde en zieke muizenhart.

De 31P-spectra die zijn geregistreerd van een muizenhart doordrenkt met KHB en van de buffer alleen zijn weergegeven in figuur 1A. De signalen van α-, β- en γ-ATP, PCr en Pi werden waargenomen in het hart. Het Pi-signaal bestond uit twee hoofdcomponenten: in het hogere veld (linkerkant van het signaal) was het Pi-signaal vooral te wijten aan de KHB bij een pH van 7,4; in het onderste veld (rechterkant van het signaal) was het Pi-signaal breder en minder homogeen door de zuurdere o...

We beschrijven een experimentele opstelling voor het toedienen van hyperpolarized 13C-gelabelde metabolieten in continue perfusiemodus aan een geïsoleerd geperfuseerd muizenhart. Een speciale 13C-NMR-acquisitiebenadering maakte de kwantificering van metabole enzymactiviteit in realtime mogelijk, en een multiparametrische 31P-NMR-analyse maakte de bepaling van het atp-gehalte en de pH van het weefsel mogelijk.

Onderzoek naar hartmetabolisme in het geïsoleerde geperfuseerde muizenhart met hyperpolarisatie [1-13 C] pyruvaat en 13C / 31P NMR-spectroscopie

Metabolism is the basis of important processes in cellular life. Characterizing how metabolic networks function in living tissues provides crucial ...

Hi.In deze video leert u hoe u hyperpolarized MR-studies van het doordrenkte muizenhart kunt uitvoeren. David Shaul, een MD / PhD-student in het lab, zal je door de verschillende technieken en procedures leiden. Vandaag leren we een protocol voor het bestuderen van hyperpolarized koolstof-13 pyruvaatmetabolisme, gecombineerd met 31P NMR-spectroscopie.Pyruvaat metabolisme staat op het kruispunt van aeroob en anaeroob metabolisme. En als zodanig is het van grote waarde voor het bestuderen van verschillende aandoeningen van het hart. Dus laten we beginnen.Het muizenhart is geïsoleerd en doordrenkt met Krebs-Hensleit-buffer, in een NMR-buis van 10 millimeter. Het hart wordt vervolgens ingebracht in de NMR-spectrometer. Daar wordt een 31P-spectrum geregistreerd om cardiale energetica en pH te observeren, door de resonanties van adenosinetrifosfaat, fosfocreatine en anorganisch fosfaat te observeren.Ondertussen is een pyruvaatmonster dat is gelabeld met koolstof-13 in de eerste positie hyperpolariseerd. En nadat het is opgelost, wordt het in het hart geïnjecteerd om lactaat, anorganische stoffen en pyruvaat in realtime te kunnen meten. Bereid een dag voor het experiment 400 milliliter ge

investigating-cardiac-metabolism-isolated-perfused-mouse-heart-with

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Langendorff-mode geïsoleerde perfusie hart, in combinatie...

De beoordeling van de hartfunctie en Energetica in geïsoleerde Mouse Hearts gebruik 31 P NMR-spectroscopie

Een dynamische multicompartiment-fantoom wordt gebruikt om bepaalde biologie van belang te simuleren voor metabolische studies met behulp van hypergepolariseerde magneetresonantie-agentia.

Gebruik van een Multi-compartiment Dynamic enkel enzym Phantom voor Studies van gehyperpolariseerd Magnetic Resonance Agents

Het volgende protocol beschrijft de voorbereiding en het gebruik van buffers voor de kwantitatieve meting van de snelheid van glucose en vetzuuroxidatie in het geïsoleerde werkende rattenhart. De methoden die worden gebruikt voor monsteranalyse en gegevensinterpretatie worden ook besproken.

Methoden voor de bepaling van de prijs van glucose en vetzuuroxidatie in het geïsoleerde hart Working Rat

Dynamische nucleaire polarisatie met daaropvolgende oplossing van het monster heeft real-time studies van metabolisme in biologische systemen mogelijk gemaakt. Gehyperpolariseerd [1-13C]pyruvaat werd gebruikt om lactate dehydrogenase-activiteit te bestuderen in een prostaatcarcinoom-cellijn in vitro.

hypergepolariseerde 13 C Metabolic magnetische resonantie spectroscopie en beeldvorming

Hier introduceren we een methode voor het gebruik van een intra-ventrikel optische katheter in geperfundeerd harten om Absorptie spectroscopie uit te voeren over de hart muur. De verkregen gegevens bieden robuuste informatie over de zuurstofspanning van het weefsel, evenals substraat gebruik en membraanpotentiaal gelijktijdig met cardiale prestatie maatregelen in deze alomtegenwoordige voorbereiding.

Intra-cardiale side-afvuren licht katheter voor het monitoren van cellulaire metabolisme met behulp van Transmural extinctie spectroscopie van Geperfectiongebruikt zoogdieren harten

We presenteren een protocol voor het meten van de magnetische veld afhankelijkheid van de spin-Lattice ontspannings tijd van 13C-verrijkte verbindingen, hypergepolariseerd door middel van dynamische nucleaire polarisatie, met behulp van snelle veld-fietste relaxometrie. Concreet hebben we dit aangetoond met [1-13C] Pyruvate, maar het protocol kan worden uitgebreid naar andere hypergepolariseerde substraten.

Meten van de spin-Lattice ontspanning magnetische veld afhankelijkheid van Hypergepolariseerde [1-13C] Pyruvate

Dit protocol integreert een op maat gemaakt bioreactorsysteem met gehyperpolariseerde ¹³C NMR-spectroscopie om het real-time pyruvaatmetabolisme in levende cellen te meten, waardoor de reproduceerbaarheid en kinetische nauwkeurigheid voor metabole studies en toepassingen voor het screenen van geneesmiddelen worden verbeterd.

Real-time metabole detectie in levende cellen met behulp van gehyperpolariseerde 13C NMR

Dit artikel beschrijft een hoge temporele en ruimtelijke resolutie techniek om optisch image actie potentiaal beweging op het oppervlak van de Langendorff-geperfuseerde rattenharten met behulp van een potentiometrische kleurstof (di-8-ANEPPS).

Optisch in kaart brengen van Langendorff-geperfuseerde Rat Hearts

Het volgende protocol schetst het proces van isoleren, ventileren en instrumenteren muis longen stabiel of pulsatiele pulmonale vasculaire druk-flow relaties maatregel om de effecten van de bloedstroom, luchtstroom, luchtweg veranderingen en vasculaire veranderingen op rechter ventrikel afterload kwantificeren.

Karakterisering van de geïsoleerde, geventileerde en Instrumented Mouse Lung geperfuseerd met pulsatiele flow

Elektronen paramagnetische resonantie (EPR) spectroscopie werd gebruikt om stikstofoxide te detecteren van runderen aorta endotheelcellen en superoxide radicaal anion van menselijke neutrofielen met behulp van ijzer (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamaat, Fe...

Detectie van stikstofoxide en superoxide radicaal anion door Electron Paramagnetische Resonantie Spectroscopie van cellen met behulp van Spin Traps

Leer hoe je hartmetabolisme bestudeert in geïsoleerde geperfuseerde muizenharten met hyperpolariseerde [1-13C]pyruvaat en 13C/31P NMR-spectroscopie. Deze methode kwantificeert LDH- en PDH-activiteit en cardiale energetica in real-time.

Onderzoek naar hartmetabolisme in het geïsoleerde geperfuseerde muizenhart met hyperpolarisatie 1-13 C pyruvaat en 13C / 31P NMR-spectroscopie (Video) | JoVE Journal

Onderzoek naar hartmetabolisme in het geïsoleerde geperfuseerde muizenhart met hyperpolarisatie [1-13 C] pyruvaat en ¹³C / ³¹P NMR-spectroscopie

Meer video's verkennen