Name: Efficiënte en schaalbare productie van volledige menselijke huntingtinevarianten in zoogdiercellen met behulp van een transiënt expressiesysteem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-10T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Leer een schaalbaar protocol voor de productie van volledige huntingtinevarianten in HEK293-cellen met behulp van transiënte expressie en anti-FLAG-affiniteitschromatografie. Deze methode garandeert meer dan 95% zuiverheid.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We bedanken het Department of Pharmaceutical Sciences, The State University of New York in Buffalo, voor het uitvoeren van MS-analyse van HTT. Dit werk was een samenwerking met de CHDI Foundation. We bedanken in het bijzonder Elizabeth M. Doherty; Ignacio Munoz-Sanjuan; Douglas Macdonald, CHDI Stichting; en Rory Curtis, Curia, voor hun onschatbare inbreng tijdens de voorbereiding van dit manuscript. We zijn ook Michele Luche, Mithra Mahmoudi en Stephanie Fox dankbaar voor hun steun aan deze onderzoeksinspanning.

<ol><li>Walker, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Huntington's disease.</a> Lancet. 369 (9557), 218-228 (2007).</li>
<li>McColgan, P., Tabrizi, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntington%27s+disease%3A+a+clinical+review%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Huntington's disease: a clinical review.</a> European Journal of Neurology. 25 (1), 24-34 (2018).</li>
<li>Duyao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trinucleotide+repeat+length+instability+and+age+of+onset+in+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Trinucleotide repeat length instability and age of onset in Huntington's disease.</a> Nature Genetics. 4 (4), 387-392 (1993).</li>
<li>MacDonald, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+gene+containing+a+trinucleotide+repeat+that+is+expanded+and+unstable+on+Huntington%27s+disease+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes.</a> Cell. 72 (6), 971-983 (1993).</li>
<li>Nasir, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+Huntington%27s+disease+gene+results+in+embryonic+lethality+and+behavioral+and+morphological+changes+in+heterozygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the Huntington's disease gene results in embryonic lethality and behavioral and morphological changes in heterozygotes.</a> Cell. 81 (5), 811-823 (1995).</li>
<li>Dragatsis, I., Levine, M. S., Zeitlin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+Hdh+in+the+brain+and+testis+results+in+progressive+neurodegeneration+and+sterility+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Inactivation of Hdh in the brain and testis results in progressive neurodegeneration and sterility in mice.</a> Nature Genetics. 26 (3), 300-306 (2000).</li>
<li>Anne, S. L., Saudou, F., Humbert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+huntingtin+by+cyclin-dependent+kinase+5+is+induced+by+DNA+damage+and+regulates+wild-type+and+mutant+huntingtin+toxicity+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of huntingtin by cyclin-dependent kinase 5 is induced by DNA damage and regulates wild-type and mutant huntingtin toxicity in neurons.</a> Journal of Neuroscience. 27 (27), 7318-7328 (2007).</li>
<li>Dietrich, P., Johnson, I. M., Alli, S., Dragatsis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+huntingtin+in+the+adult+mouse+leads+to+progressive+behavioral+deficits%2C+bilateral+thalamic+calcification%2C+and+altered+brain+iron+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Elimination of huntingtin in the adult mouse leads to progressive behavioral deficits, bilateral thalamic calcification, and altered brain iron homeostasis.</a> PLoS Genetics. 13 (7), 1006846(2017).</li>
<li>Dragatsis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+early+embryonic+deletion+of+huntingtin+from+pyramidal+neurons+on+the+development+and+long-term+survival+of+neurons+in+cerebral+cortex+and+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Effect of early embryonic deletion of huntingtin from pyramidal neurons on the development and long-term survival of neurons in cerebral cortex and striatum.</a> Neurobiology of Disease. 111, 102-117 (2018).</li>
<li>Benn, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+modulates+transcription%2C+occupies+gene+promoters+in+vivo%2C+and+binds+directly+to+DNA+in+a+polyglutamine-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Huntingtin modulates transcription, occupies gene promoters in vivo, and binds directly to DNA in a polyglutamine-dependent manner.</a> Journal of Neuroscience. 28 (42), 10720-10733 (2008).</li>
<li>Saudou, F., Humbert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+huntingtin%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The biology of huntingtin.</a> Neuron. 89 (5), 910-926 (2016).</li>
<li>Davies, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+neuronal+intranuclear+inclusions+underlies+the+neurological+dysfunction+in+mice+transgenic+for+the+HD+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Formation of neuronal intranuclear inclusions underlies the neurological dysfunction in mice transgenic for the HD mutation.</a> Cell. 90 (3), 537-548 (1997).</li>
<li>DiFiglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+of+huntingtin+in+neuronal+intranuclear+inclusions+and+dystrophic+neurites+in+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain.</a> Science. 277 (5334), 1990-1993 (1997).</li>
<li>Gutekunst, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+and+neuropil+aggregates+in+Huntington%27s+disease%3A+Relationship+to+neuropathology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Nuclear and neuropil aggregates in Huntington's disease: Relationship to neuropathology.</a> Journal of Neuroscience. 19 (7), 2522-2534 (1999).</li>
<li>Hodgson, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+YAC+mouse+model+for+Huntington%27s+disease+with+full-length+mutant+huntingtin%2C+cytoplasmic+toxicity%2C+and+selective+striatal+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A YAC mouse model for Huntington's disease with full-length mutant huntingtin, cytoplasmic toxicity, and selective striatal neurodegeneration.</a> Neuron. 23 (1), 181-192 (1999).</li>
<li>Hoffner, G., Djian, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyglutamine+aggregation+in+Huntington+disease%3A+does+structure+determine+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Polyglutamine aggregation in Huntington disease: does structure determine toxicity.</a> Molecular Neurobiology. 52 (3), 1297-1314 (2015).</li>
<li>Waldvogel, H. J., Kim, E. H., Tippett, L. J., Vonsattel, J. P. G., Faull, R. L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuropathology+of+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Behavioral+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">The neuropathology of Huntington's disease.</a> Current Topics in Behavioral Neurosciences. 22, 33-80 (2014).</li>
<li>Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta+conformation+of+polyglutamine+track+revealed+by+a+crystal+structure+of+huntingtin+N-terminal+region+with+insertion+of+three+histidine+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Beta conformation of polyglutamine track revealed by a crystal structure of huntingtin N-terminal region with insertion of three histidine residues.</a> Prion. 7 (3), 221-228 (2013).</li>
<li>Hoop, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+exon+1+fibrils+feature+an+interdigitated+%CE%B2-hairpin-based+polyglutamine+core%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Huntingtin exon 1 fibrils feature an interdigitated β-hairpin-based polyglutamine core.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 1546-1551 (2016).</li>
<li>Vieweg, S., Ansaloni, A., Wang, Z. M., Warner, J. B., Lashuel, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intein-based+strategy+for+the+production+of+tag-free+huntingtin+exon+1+proteins+enables+new+insights+into+the+polyglutamine+dependence+of+Httex1+aggregation+and+fibril+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An intein-based strategy for the production of tag-free huntingtin exon 1 proteins enables new insights into the polyglutamine dependence of Httex1 aggregation and fibril formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (23), 12074-12086 (2016).</li>
<li>Seong, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+facilitates+polycomb+repressive+complex+2%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Huntingtin facilitates polycomb repressive complex 2.</a> Human Molecular Genetics. 19 (4), 573-583 (2009).</li>
<li>Li, W., Serpell, L. C., Carter, W. J., Rubinsztein, D. C., Huntington, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+characterization+of+full-length+human+huntingtin%2C+an+elongated+HEAT+repeat+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Expression and characterization of full-length human huntingtin, an elongated HEAT repeat protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (23), 15916-15922 (2006).</li>
<li>Vijayvargia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin%27s+spherical+solenoid+structure+enables+polyglutamine+tract-dependent+modulation+of+its+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Huntingtin's spherical solenoid structure enables polyglutamine tract-dependent modulation of its structure and function.</a> eLife. 5, 11184(2016).</li>
<li>Huang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+production+in+human+cells+and+biochemical+characterization+of+full-length+normal+and+mutant+huntingtin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Scalable production in human cells and biochemical characterization of full-length normal and mutant huntingtin.</a> PLoS ONE. 10 (3), 0121055(2015).</li>
<li>Guo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cryo-electron+microscopy+structure+of+huntingtin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The cryo-electron microscopy structure of huntingtin.</a> Nature. 555 (7694), 117-120 (2018).</li>
<li>Harding, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+characterization+of+mutant+and+wildtype+huntingtin+proteins+produced+from+a+toolkit+of+scalable+eukaryotic+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Design and characterization of mutant and wildtype huntingtin proteins produced from a toolkit of scalable eukaryotic expression systems.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (17), 6986-7001 (2019).</li>
<li>Harding, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HAP40+orchestrates+huntingtin+structure+for+1+differential+interaction+with+polyglutamine+2+expanded+exon+1%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">HAP40 orchestrates huntingtin structure for 1 differential interaction with polyglutamine 2 expanded exon 1.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Huang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+polyQ+expansion+does+not+alter+the+conformation+of+the+Huntingtin-HAP40+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Pathological polyQ expansion does not alter the conformation of the Huntingtin-HAP40 complex.</a> Structure. 29 (8), 804-809 (2021).</li>
<li>Colin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+phosphorylation+acts+as+a+molecular+switch+for+anterograde%2Fretrograde+transport+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Huntingtin phosphorylation acts as a molecular switch for anterograde/retrograde transport in neurons.</a> EMBO Journal. 27 (15), 2124-2134 (2008).</li>
<li>Thompson, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IKK+phosphorylates+Huntingtin+and+targets+it+for+degradation+by+the+proteasome+and+lysosome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">IKK phosphorylates Huntingtin and targets it for degradation by the proteasome and lysosome.</a> Journal of Cell Biology. 187 (7), 1083-1099 (2009).</li>
<li>Ratovitski, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modifications+%28PTMs%29%2C+identified+on+endogenous+Huntingtin%2C+cluster+within+proteolytic+domains+between+HEAT+repeats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Post-translational modifications (PTMs), identified on endogenous Huntingtin, cluster within proteolytic domains between HEAT repeats.</a> Journal of Proteome Research. 16 (8), 2692-2708 (2017).</li>
<li>Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+defined+methodology+for+reliable+quantification+of+western+blot+data%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A defined methodology for reliable quantification of western blot data.</a> Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).</li>
<li>Tarazona, M. P., Saiz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+SEC%2FMALS+experimental+procedures+and+theoretical+analysis+for+studying+the+solution+properties+of+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Biophysical+Methods%22%5BJournal%5D)">Combination of SEC/MALS experimental procedures and theoretical analysis for studying the solution properties of macromolecules.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 56 (1-3), 95-116 (2003).</li>
<li>Folta-Stogniew, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomeric+states+of+proteins+determined+by+size-exclusion+chromatography+coupled+with+light+scattering%2C+absorbance%2C+and+refractive+index+detectors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Oligomeric states of proteins determined by size-exclusion chromatography coupled with light scattering, absorbance, and refractive index detectors.</a> Methods in Molecular Biology. 328, Clifton, N.J. 97-112 (2006).</li>
<li>McMeekin, T. L., Wilensky, M., Groves, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refractive+indices+of+proteins+in+relation+to+amino+acid+composition+and+specific+volume%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Refractive indices of proteins in relation to amino acid composition and specific volume.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 7 (2), 151-156 (1962).</li>
<li>Atwal, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+has+a+membrane+association+signal+that+can+modulate+huntingtin+aggregation%2C+nuclear+entry+and+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Huntingtin has a membrane association signal that can modulate huntingtin aggregation, nuclear entry and toxicity.</a> Human Molecular Genetics. 16 (21), 2600-2615 (2007).</li>
<li>Kegel-Gleason, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+interactions+with+membrane+phospholipids%3A+Strategic+targets+for+therapeutic+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Huntington%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Huntingtin interactions with membrane phospholipids: Strategic targets for therapeutic intervention.</a> Journal of Huntington's Disease. 2 (3), 239-250 (2013).</li>
<li>Michalek, M., Salnikov, E. S., Werten, S., Bechinger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+interactions+of+the+amphipathic+amino+terminus+of+huntingtin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Membrane interactions of the amphipathic amino terminus of huntingtin.</a> Biochemistry. 52 (5), 847-858 (2013).</li>
<li>Wittig, I., Braun, H. P., Schägger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nature Protocols. 1 (1), 418-428 (2006).</li>
<li>Nissley, D. A., O'Brien, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+co-translational+processing+plays+a+role+in+huntington%27s+pathogenesis-A+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Altered co-translational processing plays a role in huntington's pathogenesis-A hypothesis.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, 54(2016).</li>
<li>Kumar, N., Gammell, P., Clynes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+control+strategies+to+improve+productivity+and+survival+during+CHO+based+production+culture%3A+A+summary+of+recent+methods+employed+and+the+effects+of+proliferation+control+in+product+secreting+CHO+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Proliferation control strategies to improve productivity and survival during CHO based production culture: A summary of recent methods employed and the effects of proliferation control in product secreting CHO cell lines.</a> Cytotechnology. 53 (1-3), 33-46 (2007).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben met de inhoud van dit artikel.

We beschrijven hier een transiënte transfectie-, expressie- en zuiveringsmethode om meerdere FL HTT-eiwitconstructen te genereren met geschikte zuiverheid en homogeniteit voor gebruik als normen voor immunoassay en MS-testontwikkeling, controles voor western blot-analyse en voor structuurfunctiestudies. Deze transiënte expressiemethode is schaalbaar en veelzijdig en stelt de gebruiker in staat om hoeveelheden FL HTT-varianten met een lage milligram efficiënter te genereren dan met behulp van stabiele cellijnen of virusgebaseerde methoden die eerder zijn beschreven 21,22,23,24. Routinematig kan 2-5 mg sterk gezuiverde FL HTT worden gegenereerd uit een eiwitproductie op schaal 2 L in minder dan een week met behulp van de transiënte expressiemethode zodra het plasmide is geconstrueerd, met een typische opbrengst van 1-2,5 mg FL HTT per liter celcultuur.
De hier beschreven transiënte expressiemethode overwint vele obstakels in stabiele cellijnexpressie, zoals de lange tijd die nodig is om cellijnen vast te stellen en moeilijkheden bij opslag en onderhoud van stabiele cellijnen. PEI is ook relatief goedkoop in vergelijking met andere transfectiereagentia op de markt, waardoor grootschalige transfectie economisch haalbaar is. Er zijn ook beperkingen in het protocol: transfectie-efficiëntie hangt grotendeels af van de kwaliteit van de plasmiden, optimale celgroei en hoe goed PEI wordt opgeslagen en bereid. Operators moeten speciale zorg besteden aan en kwaliteitscontroles uitvoeren in die kritieke stappen om een drastische daling van de eiwitopbrengst te voorkomen. Anti-FLAG hars die in het protocol wordt gebruikt, is ook relatief duur en vertoont een verminderde vangst van FL HTT na verschillende zuiveringen en regeneraties. Sommige onderzoekers vinden het misschien praktischer om over te schakelen naar een andere tag om een robuustere regeneratie van de affiniteitshars mogelijk te maken.
Verschillende cellijnen en expressiecondities werden getest om FL HTT-expressieniveaus te optimaliseren. HEK293-cellen werden gekozen voor de expressie van FL HTT vanwege de hoge expressie van eiwit en het gebruiksgemak in een suspensiecultuurformaat, waardoor de methode geschikt is voor grootschalige expressie in shakers of bioreactoren. Een hoger FL HTT-eiwitexpressieniveau kan worden bereikt bij lagere kweektemperaturen zoals 32 °C in plaats van de gebruikelijke temperatuur van 37 °C. Het is mogelijk dat de lagere temperatuur de eiwitsynthese vertraagt en een correcte vouwing van FL HTT40 bevordert. Dit fenomeen is echter niet specifiek voor FL HTT of de geteste cellijnen. De verlaagde posttransfectietemperatuur is op grote schaal gebruikt bij farmaceutische eiwitexpressie in CHO-cellen. Hoewel het mechanisme niet volledig wordt begrepen, wordt gedacht dat lage temperaturen de celcyclus in de G1-fase stoppen en cellulaire energie omleiden naar eiwitproductie41.
Htt over de volledige lengte gezuiverd uit zoogdiercellen co-elutes met de chaperonne Hsp7024, en Mg-ATP wasstappen kunnen het Hsp70-eiwit verwijderen. Interessant is dat co-geëlueerde Hsp70 niet wordt waargenomen in FL HTT gezuiverd van een insectencelexpressiesysteem 21,22,23. Dit kan een verschil weerspiegelen in de PTM's van FL HTT of heat shock eiwitreacties op de overexpressie van FL HTT in zoogdier- en insectencellen. Zodra het recombinante eiwit is ontdaan van Hsp70, zijn niet-ionische detergentia zoals CHAPS of DDM nodig om de monomere vorm van FL HTT te stabiliseren.
De oligomerisatietoestanden van FL HTT-varianten werden geanalyseerd met behulp van Blue Native PAGE en SEC-MALS. Een kleine fractie van dimerische en hogere orde oligomere HTT was aanwezig wanneer geanalyseerd door Blue Native PAGE of SEC-MALS. Van belang is dat hoger geordende oligomeren gevormd door FL HTT niet lijken te correleren met polyQ-lengte, en zelfs de Exon1-deletiemutant vertoont een vergelijkbare oligomeer-dimer-monomeerverhouding. De werkelijke verschillen in oligomeergehalte tussen deze constructen zijn waarschijnlijk te wijten aan kleine verschillen in de productie en behandeling van elke batch. In tegenstelling tot aggregaten en fibrillen gevormd door HTT Exon1 40,41, bleven de hoger geordende oligomeren van FL HTT oplosbaar en konden ze worden geanalyseerd door SEC en Native PAGE.
Gezuiverde monomere FL HTT is slechts relatief stabiel. Langdurige opslag bij 4 °C, korte incubaties bij kamertemperatuur of concentraties > 1 mg/ml zullen allemaal monomere FL HTT omzetten in dimerische en hoger geordende oligomere vormen, ook al is er onder die omstandigheden geen zichtbare neerslag waargenomen. Gezuiverde monomere FL HTT gehandhaafd op ≤1 mg / ml bleef relatief stabiel bij -80 ° C in opslagbuffer (50 mM Tris, pH 8,0, 500 mM NaCl, 5% v / v glycerol, 0,5% w / v CHAPS en 5 mM DTT) zoals eerder beschreven24. Tot 6 vries-dooicycli van FL HTT bereid en op deze manier opgeslagen veroorzaakten geen zichtbare neerslag van het eiwit, hoewel een lichte verschuiving naar een hogere oligomere toestand werd waargenomen door SEC-MALS (aanvullende figuur S2). Monsters werden ook geanalyseerd door SDS PAGE na herhaalde vries-dooicycli. Er werden geen zichtbare neerslagen waargenomen; sds-PAGE (supplemental figure S3) heeft geen aggregaten of aanvullende afbraakproducten gezien. De stabiliteit op lange termijn van gezuiverde FL HTT wordt nog onderzocht. Bij gebrek aan sluitende langetermijngegevens raden we aan om gezuiverde FL HTT bij -80 °C niet langer dan 6 maanden te bewaren.
Hoogwaardige, recombinante FL HTT-eiwitvarianten en de methoden om ze te produceren zijn zeer gewild bij de ZvH-onderzoeksgemeenschap. Deze eiwitten worden gebruikt als immunoassay- en MS-analytische normen, in structurele studies en voor de ontwikkeling van nieuwe FL HTT-specifieke testen. De grootschalige transiënte expressiemethoden die hier worden beschreven, hebben consequent milligramhoeveelheden FL HTT-varianten geproduceerd met >95% zuiverheid, wat essentiële hulpmiddelen biedt voor HTT-studies. De productie van tientallen milligrammen sterk gezuiverde FL HTT polyQ-varianten en andere mutanten ter ondersteuning van ZvH-onderzoek is routine geworden.

De ziekte van Huntington (ZvH) is een zeldzame neurodegeneratieve ziekte die voornamelijk wordt gekenmerkt door onstabiele en onvrijwillige motorische beweging, evenals cognitieve en psychiatrische veranderingen, zoals persoonlijkheidsveranderingen en apathie 1,2. De ZvH is geassocieerd met een uitbreiding van het CAG-herhalingskanaal in exon 1 van het huntingtinegen (HTT) tot meer dan 35 herhalingen, waarbij een hoger aantal CAG-herhalingen correleert met een eerder begin van de ziekte 3,4. Het translationele product van HTT, het huntingtine-eiwit (HTT), is betrokken bij neuronale levensvatbaarheid en hersenontwikkeling 5,6,7,8,9.
HTT is een steigereiwit waarvan wordt gemeld dat het deelneemt aan een breed scala aan cellulaire processen, blaasjestransport, celdeling, ciliogenese en autofagie10,11. De moleculaire pathogenese van de ZvH is echter niet helemaal duidelijk en de identificatie van belangrijke eiwitinterverstoren die de pathologische impact van polyQ-geëxpandeerde mHTT bemiddelen, ontbreekt. Sommige onderzoeken suggereren een winst van toxische functie van mHTT aangedreven door de oligomerisatie neiging van het uitgebreide HTT-eiwit, aangezien HTT-aggregaten zijn geïdentificeerd in neuronen en glia bij ZvH-patiënten en diermodellen van de ziekte 12,13,14,15,16,17 . Om het onderzoek naar de functie en structuur van FL HTT- en mHTT-varianten te stimuleren en onderzoekers te voorzien van hoogwaardige eiwitstandaarden voor de ontwikkeling van assays, is een robuuste en schaalbare toevoer van homogeen recombinant eiwit nodig.
Vanwege de grootte (aa 1-3.144, nummering op basis van polyQ-lengte Q23), proteolytische instabiliteit en neiging tot aggregeren, is FL HTT moeilijk tot expressie te brengen en te isoleren als een oplosbaar eiwit. Voorheen werd het exon 1-gebied (aa 2-90) van HTT op grote schaal tot expressie gebracht en gezuiverd met behulp van verschillende tags die de oplosbaarheid van het eiwit in Escherichia coli 18,19,20 kunnen verhogen. FL HTT werd voor het eerst tot expressie gebracht en gezuiverd in een insectencelexpressiesysteem met behulp van baculovirus 21,22, en lage resolutie 30 Å elektronenmicroscopie (EM) structuren van chemisch verknoopte FL Q23-HTT en Q78-HTT werden gemeld23. Het onderzoek naar de HTT-structuur werd verder gevorderd toen de productie van FL Q17, Q46 en Q128-HTT met native posttranslationele modificaties (PTM's) werd bereikt in menselijke cellen met behulp van stabiele cellijnen of adenovirusexpressiesystemen24. Deze studies suggereren dat hoewel gezuiverde HTT voornamelijk bestaat in de monomere toestand, het ook de neiging heeft om oligomeren en aggregaten van hoge orde te vormen.
Analytische ultracentrifugatie van FL Q128-HTT, met een sterk geëxpandeerd polyQ-gebied, bood meer oligomere en geaggregeerde fracties dan het eiwit met het niet-geëxpandeerde polyQ-gebied24. Met behulp van een stabiele cellijn is een strategie met succes aangepast om FL HTT te stabiliseren door co-expressie met de interactiepartner HAP40. Een cryo-EM structuur van het FL HTT en HAP40 complex is opgelost met een gemiddelde 4 Å resolutie met behulp van het gezuiverde eiwit complex (PDB:6EZ8)25. Deze co-expressiestrategie is met succes aangepast aan een baculovirussysteem en een reeks hoogwaardige HTT-varianten met verschillende polyQ-lengtes zijn tot expressie gebracht en gezuiverd uit insectencellen26. Sindsdien werden meer cryo-EM structuren van het complex van HTT met variabele polyQ lengtes en HAP40 en hogere resolutie structuren opgelost en gedeponeerd in de Protein Data Base27,28 (PDB: 7DXK, 7DXH, 6X9O).
We hebben een transfectie- en expressiemethode in HEK293-cellen geoptimaliseerd, met behulp van polyethylenimine (PEI), voor snelle transiënte expressie van FL HTT. Als proof-of-principle werden FL HTT-varianten met 23 glutamines (FL Q23-HTT) eerst gezuiverd en gekarakteriseerd met behulp van een wijziging van een eerder beschreven zuiveringsmethode24. Deze transiënte transfectiemethode is handig, zeer efficiënt en schaalbaar; het kan gezuiverde HTT produceren met opbrengsten van 1-2 mg / L, vergelijkbaar met de stabiele cellijnmethode gerapporteerd24. Omdat het eiwit wordt geproduceerd in een menselijke cellijn, heeft de htt-geproduceerde meer kans op inheemse menselijke PTM's wanneer het wordt onderworpen aan massaspectrometrie proteomics-analyse 11,29,30,31. Milligramhoeveelheden van de FL Q48-HTT, FL Q73-HTT en exon1-verwijderde (ΔExon1-HTT) varianten van FL HTT werden geproduceerd, wat aantoont dat de transiënte expressiemethode vooral nuttig is bij het snel produceren van alternatieve varianten van HTT zonder afhankelijk te zijn van de tijdrovende inspanning die nodig is om stabiele cellijnen voor productie vast te stellen.
Het volgende protocol is een voorbeeld van de standaardmethode die in het laboratorium van deze auteurs wordt gebruikt voor celkweek, transfectie, eiwitzuivering en postzuivering van eiwitkarakterisering om FL Q23-HTT te produceren uit een 2 L celcultuur. Het protocol kan worden opgeschaald naar grotere culturen of worden aangepast om andere HTT-varianten te zuiveren. Tot 10 L celculturen van FL HTT en verschillende site- of truncation mutaties van HTT en HTT homologen zijn met succes uitgevoerd in het laboratorium met behulp van hetzelfde protocol. Gezuiverde FL HTT bevat een hoog percentage monomeren, samen met dimeren en oligomeren van hogere orde. Hetzelfde geaggregeerde profiel wordt waargenomen bij de geproduceerde varianten (Q23, Q48, Q73 en verwijderde Exon1). Omdat aggregatie kan optreden wanneer niet de juiste zorg wordt besteed, werd een formulerings- en vries-dooistabiliteitsstudie uitgevoerd om de beste omstandigheden voor eiwitverwerking te identificeren. Methoden, zoals Blue Native PAGE en SEC/MALS-RI, worden ook beschreven om het HTT-oligomeergehalte te analyseren als onderdeel van het kwaliteitscontroleproces. Om de ZvH-onderzoeksgemeenschap ten goede te komen, worden plasmiden en HTT-eiwitten die in deze studie worden beschreven ook gedeponeerd in de ZvH Community Repository van het Coriell Institute (www.coriell.org/1/CHDI).

<table><tbody><tr><td>100 kDa concentrator-Amicon</td><td>Millipore</td><td>UFC910096</td><td>Protocol Section Number-6.2.4</td></tr><tr><td>20x blue native PAGE running buffer</td><td>Invitrogen</td><td>BN2001</td><td>Protocol Section Number-8.1</td></tr><tr><td>20x TBS</td><td>Thermo Fisher</td><td>PI28358</td><td>Protocol Section Number-5.1</td></tr><tr><td>4x blue native PAGE sample buffer</td><td>Invitrogen</td><td>BN2003</td><td>Protocol Section Number-8.3</td></tr><tr><td>4x LDS loading buffer</td><td>Invitrogen</td><td>NP0007</td><td>Protocol Section Number-5.3</td></tr><tr><td>5 L Erlenmeyer flasks</td><td>Corning</td><td>431685</td><td>Protocol Section Number-4.2</td></tr><tr><td>Agarose gel extraction kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Protocol Section Number-2.2</td></tr><tr><td>Anti-clumping agent</td><td>Thermo Fisher</td><td>0010057AE</td><td>Protocol Section Number-4.8</td></tr><tr><td>anti-FLAG M2 affinity gel</td><td>Sigma</td><td>A2220</td><td>Protocol Section Number-6.1.1</td></tr><tr><td>anti-FLAG M2</td><td>Sigma</td><td>F3165</td><td>Protocol Section Number-5.7</td></tr><tr><td>Anti foam-Excell anti foam</td><td>Sigma</td><td>59920C-1B</td><td>Protocol Section Number-4.8</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A6419</td><td>Protocol Section Number-6.1.4.4</td></tr><tr><td>BEH 450 SEC</td><td>Waters</td><td>186006851</td><td>2.5 &micro;m x 4.6 mm x 150 mm Protocol Section Number-7.3</td></tr><tr><td>blue native PAGE 5% G-250 sample additive</td><td>Invitrogen</td><td>BN2004</td><td>Protocol Section Number-8.3</td></tr><tr><td>carbenicillin</td><td>Thermo Fisher</td><td>10177012</td><td>Protocol Section Number-2.5</td></tr><tr><td>centrifuge - Sorvall Lynx 6000</td><td>Thermo Fisher</td><td>75006590</td><td>Protocol Section Number-6.1.3</td></tr><tr><td>Cell Counter - ViCELL</td><td>BECKMAN COULTER</td><td></td><td>Protocol Section Number-4.3</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Anatrace</td><td>C316S</td><td>Protocol Section Number-6.1.4.6</td></tr><tr><td>Competent E. coli cells-TOP10</td><td>Invitrogen</td><td>C404010</td><td>Protocol Section Number-2.4</td></tr><tr><td>digitonin</td><td>Sigma</td><td>D141</td><td>Protocol Section Number-5.1</td></tr><tr><td>differential refractive index detector</td><td>Wyatt</td><td></td><td>Protocol Section Number-7.1</td></tr><tr><td>DYKDDDDK peptide</td><td>Genscript</td><td></td><td>Peptide synthesis service Protocol Section Number-6.1.4.6</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>EDS</td><td>Protocol Section Number-5.1</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Giga Kit</td><td>Qiagen</td><td>12391</td><td>Protocol Section Number-3.3</td></tr><tr><td>Endotoxin free water</td><td>Cytiva</td><td>SH30529.03</td><td>Protocol Section Number-4.1</td></tr><tr><td>endotoxin quantification kit-CRL Endosafe Nexgen-PTS detection system</td><td>Charles River</td><td>PTS150K</td><td>Protocol Section Number-3.4</td></tr><tr><td>fixed angle rotor A23-6x100 rotor</td><td>Thermo Fisher</td><td>75003006</td><td>Protocol Section Number-6.1.3</td></tr><tr><td>FPLC software- Unicorn 6.2</td><td>Cytiva</td><td></td><td>Protocol Section Number-6.1.4</td></tr><tr><td>Gene synthesis</td><td>Genscript</td><td></td><td>Gene synthesis service Protocol Section Number-1.2</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific Glycerol (Certified ACS)</td><td>G33-4</td><td>Protocol Section Number-5.6</td></tr><tr><td>Growth Medium-Expi293 expression medium</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1435102</td><td>Protocol Section Number-4.2</td></tr><tr><td>HEK293 cells</td><td>Thermo Fisher</td><td>R79007</td><td>Protocol Section Number-4</td></tr><tr><td>high shear homogenizer-Microfluidizer</td><td>MicroFluidics</td><td>LM10</td><td>Protocol Section Number-6.1.3</td></tr><tr><td>HPLC - 1260 infinity II Bio-Insert HPLC</td><td>Agilent</td><td></td><td>Protocol Section Number-7.1</td></tr><tr><td>Image Studio</td><td>LiCor</td><td></td><td>Image analysis software Protocol Section Number-5.1</td></tr><tr><td>MAB2166</td><td>Sigma</td><td>MAB2166</td><td>Protocol Section Number-5.7</td></tr><tr><td>MAB2168</td><td>EMD</td><td>MAB2168</td><td>Protocol Section Number-5.7</td></tr><tr><td>MAB3E10</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-47757</td><td>Protocol Section Number-5.7</td></tr><tr><td>MAB4E10</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-7757</td><td>Protocol Section Number-5.7</td></tr><tr><td>MAB5490</td><td>Sigma</td><td>MAB5490</td><td>Protocol Section Number-5.7</td></tr><tr><td>MAB5492</td><td>Sigma</td><td>MAB5492</td><td>Protocol Section Number-5.7</td></tr><tr><td>MAB8A4</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-47759</td><td>Protocol Section Number-5.7</td></tr><tr><td>multi-angle light scattering detector</td><td>Wyatt</td><td></td><td>Protocol Section Number-7.1</td></tr><tr><td>NativeMark Unstained Protein Standard</td><td>Invitrogen</td><td>LC0725</td><td>Protocol Section Number-8.4</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td>Protocol Section Number-5.6</td></tr><tr><td>NheI</td><td>New England Biolab</td><td>R0131S</td><td>Hi-Fi version available Protocol Section Number-2.2</td></tr><tr><td>NuPAGE 3&ndash;8% Tris acetate gels</td><td>Invitrogen</td><td>EA0375PK2</td><td>Protocol Section Number-5.4</td></tr><tr><td>NuPAGE Tris-Acetate SDS Running buffer</td><td>Invitrogen</td><td>LA0041</td><td>Protocol Section Number-5.4</td></tr><tr><td>PEI 25K</td><td>Polysciences</td><td>23966-1</td><td>Protocol Section Number-4.1</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Fisher</td><td>15070063</td><td>Protocol Section Number-4.2</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Cytiva</td><td>SH30256.02</td><td>Protocol Section Number-4.5</td></tr><tr><td>plasmid miniprep kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>Protocol Section Number-2.6</td></tr><tr><td>PmeI</td><td>New England Biolab</td><td>R0560S</td><td>Protocol Section Number-2.2</td></tr><tr><td>precast Bis-tris gel- 3-12% NativePAGE Novex Bis-Tris Gel</td><td>Invitrogen</td><td>BN1003BOX</td><td>Protocol Section Number-8.4</td></tr><tr><td>protease inhibitor cocktail</td><td>GoldBio</td><td>GB-331-1</td><td>Protocol Section Number-5.1</td></tr><tr><td>SEC-MALS analysis software - Astra 7</td><td>Wyatt Technology</td><td></td><td>Protocol Section Number-7.6</td></tr><tr><td>secondary antibody -IRdye 800 CW goat anti-mouse IgG</td><td>LiCor</td><td>926-32210</td><td>Protocol Section Number-5.9</td></tr><tr><td>Superose 6 pg XK 16/70</td><td>Cytiva</td><td>90100042</td><td>Protocol Section Number-6.2</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP152</td><td>Protocol Section Number-5.6</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Thermo Fisher</td><td>AAJ20605AP</td><td>Protocol Section Number-6.1.1</td></tr><tr><td>UV spectrometer - Nanodrop 8000</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-8000-GL</td><td>Protocol Section Number-2.2</td></tr><tr><td>XK26/1

efficiënte en schaalbare productie van volledige menselijke huntingtinevarianten in zoogdiercellen met behulp van een transiënt expressiesysteem

Efficient and Scalable Production of Full-length Human Huntingtin Variants in Mammalian Cells using a Transient Expression System

Full-length huntingtine (FL HTT) is een groot (aa 1-3.144), alomtegenwoordig tot expressie gebracht, polyglutamine (polyQ) bevattend eiwit met een massa van ongeveer 350 kDa. Hoewel de cellulaire functie van FL HTT niet helemaal wordt begrepen, is een mutante expansie van het polyQ-kanaal boven ~ 36 herhalingen geassocieerd met de ziekte van Huntington (HD), waarbij de polyQ-lengte ruwweg correleert met de leeftijd van aanvang. Om het effect van structuur op de functie van mutant HTT (mHTT) beter te begrijpen, zijn grote hoeveelheden van het eiwit nodig. Submilligramproductie van FL HTT in zoogdiercellen werd bereikt met behulp van doxycycline-induceerbare stabiele cellijnexpressie. Eiwitproductie uit stabiele cellijnen heeft echter beperkingen die kunnen worden overwonnen met voorbijgaande transfectiemethoden. 
Dit artikel presenteert een robuuste methode voor de productie van FL HTT met een lage milligram hoeveelheid en zijn varianten van codon-geoptimaliseerde plasmiden door voorbijgaande transfectie met behulp van polyethylenimine (PEI). De methode is schaalbaar (>10 mg) en levert consequent 1-2 mg/L celkweek van sterk gezuiverde FL HTT op. In overeenstemming met eerdere rapporten bleek de gezuiverde oplossingstoestand van FL HTT zeer dynamisch te zijn; het eiwit heeft de neiging om dimeren en oligomeren van hoge orde te vormen. Een sleutel tot het vertragen van oligomeervorming is het snel isoleren van de monomere fracties van de dimerische en high-order oligomere fracties tijdens grootte-uitsluitingschromatografie. 
Grootte-uitsluitingschromatografie met multiangle lichtverstrooiing (SEC-MALS) werd gebruikt om het dimer- en hogere-orde oligomere gehalte van gezuiverde HTT te analyseren. Er werd geen correlatie waargenomen tussen FL HTT polyQ lengte (Q23, Q48 en Q73) en oligomeergehalte. De exon1-verwijderde constructie (aa 91-3.144) vertoonde een vergelijkbare oligomerisatieneiging als FL HTT (aa 1-3.144). Productie-, zuiverings- en karakteriseringsmethoden door SEC / MALS-refractieve index (RI), natriumdodecylsulfate-polyacrylamide gel-elektroforese (SDS-PAGE), western blot, Native PAGE en Blue Native PAGE worden hierin beschreven.

We bieden schaalbare protocollen voor constructontwerp, voorbijgaande transfectie en expressie en zuivering van volledige menselijke huntingtine-eiwitvarianten in HEK293-cellen.

Efficiënte en schaalbare productie van volledige menselijke huntingtinevarianten in zoogdiercellen met behulp van een transiënt expressiesysteem

Full-length huntingtin (FL HTT) is a large (aa 1-3,144), ubiquitously expressed, polyglutamine (polyQ)-containing protein with a mass of approximately 350 ...

Het protocol is ontwikkeld voor de productie van full-length huntingin varianten op een lage milligram schaal. Het zorgt voor consistente hoogwaardige eiwitten die essentieel zijn voor ZvH-onderzoekers. De procedure wordt gedemonstreerd door Michael Harris, een onderzoekswetenschapper van het Curia Laboratory.Begin met het toevoegen van een gram polyethyleenimine 25 K aan een liter endotoxine vrij water en roer goed. Stel de pH in op 2,0 met 100 milliair zoutzuur en roer totdat alle polyethyleenimine is opgelost. Stel vervolgens de pH in op 7,0 met behulp van een natriumhydroxideoplossing van 100 millimolaire en laat de oplossing door een filter van 0,2 micrometer lopen.Maak aliquots van de gefilterde oplossing en bewaar ze bij min 20 graden Celsius. Vermeerder HEK293-cellen in het groeimedium aangevuld met penicilline streptomycine in een bevochtigde shaker incubator bij 37 graden Celsius, 90 RPM, 5% koolstofdioxide gedurende 18 tot 24 uur. Verdun de cellen een dag voor de transfectie met een dichtheid van ongeveer 1,2 x 10 tot de zesde krachtcellen per milliliter in twee liter groeimedium in een erlenmeyer van vijf liter en incubeer gedurende 18 tot 24 uur.Meet aan het einde van de incubatie de celdichtheid en levensvatbaarheid met behulp van een autocelteller volgens de instructies van de fabrikant. Na het berekenen van de hoeveelheid polyethyleenimine en plasmide die nodig is voor transfectie, verdunt u polyethyleenimine en plasmide afzonderlijk in 100 milliliter PBS en incubeert u gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Meng vervolgens het verdunde plasmide en polyethyleenimine door het mengsel gedurende 30 minuten voorzichtig te draaien en incubeer het bij kamertemperatuur.Voeg het mengsel toe aan de celcultuur en meng door zachtjes te draaien. Laat de cellen nu 24 uur groeien. Voeg de volgende dag natriumbutyraatoplossing toe aan een uiteindelijke concentratie van twee millimolaire antiklonter- en antischuimmiddel in een volumeverhouding van 1: 1. 000 tot de cultuur en incubeer de cellen in de bevochtigde shaker-incubator gedurende 48 uur.Na het meten van de levensvatbaarheid en dichtheid van de cel, oogst de cellen door centrifugeren bij 2.000 G gedurende 30 minuten en bewaar de celpellet bij min 80 graden Celsius voor zuivering. Voor anti-FLAG zuivering met behulp van FPLC, verpak 12 tot 25 milliliter anti-FLAG hars op een lege kolom met een stroomsnelheid van vier milliliter per minuut met behulp van buffer A en pas de hoogte van de zuiger aan om de opening tussen het uiteinde van de plunjer en het bed van hars te verwijderen. Suspensie vervolgens de ontdooide celpellet in koude lysisbuffer en passeer de celsuspensie eenmaal door een high-shear homogenisator met een druk van 1.000 pond per vierkante inch.Gebruik een centrifuge die is uitgerust met een compatibele rotor met vaste hoek en verduidelijk het lysaat gedurende één uur bij 20.000 G. Programmeer FPLC onder het venster Methode, laad het geklaarde lysaat via de monsterpomp en was de kolom met de gewenste kolomvolumes van buffer A, B, C, D en elutiebuffer zoals beschreven in het tekstmanuscript. Zodra de run is voltooid, analyseert u 10 microliter van de piekfracties met behulp van SDS-PAGE.Combineer de piekfracties met de gewenste zuiverheid en bespaar ongeveer 50 microliter van de gecombineerde eluaten voor verdere SDS-PAGE-analyse. Begin met het balanceren van de SEC-kolom met behulp van de FPLC en laad het anti-FLAG-eluaat via een superloop van 50 milliliter. Nadat u de SEC-buffer hebt uitgevoerd, laat u de SEC-scheiding 's nachts plaatsvinden bij vier graden Celsius.Vergelijk het elutieprofiel met het standaard HTT-elutieprofiel om de monomeer-, dimer- en hogergeorde oligomere pieken te onderscheiden. Pool de monomere HTT-fracties op basis van het elutieprofiel van de SEC-kolom en bundel, indien gewenst, de hoger geordende oligomere en dimerische HTT-fracties afzonderlijk. Concentreer het gepoolde HTT-eiwit met behulp van een centrifugale concentrator van 100 kilodalton bij vier graden Celsius.Na het berekenen van de eiwitconcentratie, aliquot minder dan 100 microliter van het gezuiverde HTT-eiwit in een cryoveilige microcentrifugebuis. Flash bevries de aliquots met vloeibare stikstof en bewaar ze bij min 80 graden Celsius. Voer alle analytische SEC-MALS uit bij vier graden Celsius op het HPLC-systeem, gekoppeld aan een UV-detector, een multi-angle lichtverstrooiingsdetector, een differentiële brekingsindexdetector en gebruik 0,185 als de brekingsindextoename voor HTT.Spoel de pomp en de detectoren met gefilterd water van HPLC-kwaliteit en sluit de UHPLC-kolom aan op het systeem. Breng de kolom in evenwicht met gefilterd water en vervolgens de SEC-MALS-buffer totdat alle detectorsignalen de basislijn bereiken. Injecteer twee microliter BSA-oplossing met een stroomsnelheid van 0,3 milliliter per minuut gedurende 15 minuten per injectie.Inspecteer de gegevenskwaliteit, voer normalisatie, piekuitlijning en bandverbredingscorrectie uit op basis van het BSA-profiel en maak een sjabloon voor de volgende HTT-voorbeeldruns. Ontdooi snel een injectieflacon van het FL Q23-HTT-monster in een waterbad op kamertemperatuur met behulp van een vlotter. Filter de HTT door een 0,1 micrometer spinfilter.Injecteer twee tot vier microliter van het HTT-monster en laat gedurende 15 minuten draaien bij vier graden Celsius met een stroomsnelheid van 0,3 milliliter per minuut. Analyseer de chromatografische en lichtverstrooiingsgegevens met behulp van bijbehorende software en genereer een Zimm-plot om de gewichtsgemiddelde moleculaire massa voor elke piek te bepalen. In de huidige studie, met behulp van een tweestapskolomproces, werd meer dan 95% van de zuiverheid verkregen voor HTT en de belangrijkste verontreiniging was chaperone Hsp70, die werd geëlimineerd door uitgebreid wassen met magnesiumchloride en ATP tijdens de anti-FLAG affiniteitszuiveringsstap Overexpressie van FL HTT kan leiden tot fragmentatie van het eiwit, maar FL Q23-HTT geproduceerd door de methode opgelost als een enkele band met het juiste molecuulgewicht van 350 kilodalton geeft aan dat er geen fragmentatie.Western blot-analyse na de reactie van antilichamen met FL Q23-HTT toonde aan dat het eiwit werd geïsoleerd zonder significante detecteerbare truncaties, omdat er geen extra fragmentgerelateerde banden werden waargenomen. FL HTT poly-Q lengtevariantie, Q23, Q48 en Q73 reageerden zoals verwacht in Western blot, met een progressief sterker signaal voor poly-Q-gericht monoklonaal antilichaam MW1, correlerend met toenemende Q-lengte. Van de geteste HPLC-kolommen vertoonde de SEC-kolom voldoende resolutie tussen het HTT-monomeer en het dimeer, zodat molaire massa's konden worden onderscheiden.Gezuiverde FL HTT van SEC toonde meerdere banden die overeenkomen met de oligomerisatietoestanden, wat zou kunnen komen door de aanwezigheid van verschillende hydrofobe pleisters die bijdragen aan de vorming van hoger geordende oligomeren tijdens migratie in de gel. Gezuiverde HTT toonde drie belangrijke banden op blauwe inheemse PAGE met een geschat molecuulgewicht van 643, 927 en 1.070 kilodalton die waarschijnlijk respectievelijk de monomere, dimerische en trimerische soorten HTT vertegenwoordigen. Een goede behandeling van gezuiverd huntingtine is essentieel om te voorkomen dat hooggeordende oligomeren in oplosbare aggregaten worden gegenereerd.Het is absoluut noodzakelijk dat de eindgebruiker snel werkt om het monster in voorgekoelde buizen te doseren voordat het flash wordt ingevroren. Langdurige stabiliteitstests kunnen worden uitgevoerd op monsters die gedurende langere perioden bij min 80 graden Celsius zijn opgeslagen. Herhaalde HPLC SEC-MALS-analyses zullen bevestigen of er een wijziging is opgetreden in de monomere inhoud van het monster.

efficient-scalable-production-full-length-human-huntingtin-variants

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

In de post-humane genomics-tijdperk, de beschikbaarheid van recombinante eiwitten in de moedertaal van conformaties is cruciaal voor structurele, functionele en therapeutisch onderzoek en ontwikkeling. Hier beschrijven we een test-en grootschalige eiwitexpressie systeem humane embryonale nier 293T cellen die kunnen worden gebruikt om een ​​verscheidenheid van recombinante eiwitten.

Een handig en algemene uitdrukking platform voor de productie van de uitgescheiden eiwitten uit menselijke cellen

Een snelle en eenvoudige manier om humane cellijnen met induceerbare en omkeerbare cDNA overexpressie of shRNA-gemedieerde knock-down van het gen van belang genereren. Deze methode kunnen onderzoekers betrouwbaar en zeer reproduceerbaar manipuleren cellijnen die moeilijk te veranderen door transiënte transfectie methoden of conventionele knockdown / knockout strategieën.

Genereren van stabiele humane cellijnen met tetracycline induceerbare (Tet-on) shRNA of cDNA Expression

De expressie van recombinante eiwitten door zoogdiersystemen wordt een aantrekkelijke methode voor het produceren van eiwitcomplexen voor structurele biologie. Hier presenteren we een eenvoudig maar zeer efficiënt expressiesysteem dat gebruik maakt van in suspensie gekweekte zoogdiercellen om eiwitcomplexen te zuiveren voor structurele studies.

Recombinante eiwitexpressie voor Structurele Biologie in HEK 293F Suspension cellen: een nieuwe en toegankelijke aanpak

We beschrijven hier een kosteneffectief granzyme-expressiesysteem met behulp van HEK293T-cellen dat hoge opbrengsten produceert van zuivere, volledig geglycoseerde en enzymatisch actieve protease.

Een hoge opbrengst en kosten-efficiënte Expression System van Human granzymen in zoogdiercellen

Dit is een snel, kosteneffectief protocol voor de productie van uitgescheiden, geglycoseerde zoogdier-eiwitten en daaropvolgende eenstapszuivering met voldoende opbrengsten van homogeen eiwit voor röntgenkristallografie en andere biofysische studies.

Efficiënte zoogdiercelexpressie en Single-step Zuivering van extracellulaire Glycoproteïnen voor kristallisatie

De productie op laboratoriumschaal van eukaryote eiwitten met passende post-translationele modificatie vormt een belangrijke barrière. Hier is een robuust protocol met snelle implementatie en doorlooptijd voor eiwitexpressie met behulp van een zoogdier-expressiesysteem. Dit systeem ondersteunt selectieve aminozuren, selectieve markering van eiwitten en kleine moleculaire modulatoren van glyconsamenstelling.

High Yield Expressie van recombinante humane eiwitten met de Transient Transfectie van HEK293 cellen in suspensie

Het bestuderen van ionkanalen via een heteroloog tot expressie brengen systeem is uitgegroeid tot een kern techniek in het biomedisch onderzoek. In dit manuscript presenteren we een tijd efficiënte methode om strak ionkanaal expressie te komen door het uitvoeren transiënte transfectie onder controle van een induceerbare promoter.

Controleerbaar Ion Channel Expression door middel Induceerbare tijdelijke transfectie

Hier presenteren we een robuust en geoptimaliseerde protocol voor de productie van milligram hoeveelheden native, tag-vrije monomeren en fibrillen van de exon1 van het eiwit Huntingtin (Httex1) op basis van de voorbijgaande fusie van kleine ubiquitin verwante modifier (SUMO).

Generatie van eigen, niet-gecodeerde Huntingtin Exon1 monomeer en fibrillen met behulp van een SUMO Fusion strategie

Gerichte DNA epigenome bewerken vertegenwoordigt een krachtige therapeutische aanpak. Dit protocol beschrijft de productie, reiniging en concentratie van de alles-in-één lentivirale vectoren herbergen van de CRISPR-dCas9-DNMT3A-transgenic voor bewerken van epigenome's in menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel (hiPSC)-afgeleid van neuronen.

Lentivirale Vector Platform voor de efficiënte levering van Epigenome-bewerkingsgereedschap in mens geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige ziekte modellen

Recombinant BDNF met een Avi sequentie (BDNFAvi) wordt op een kosteneffectieve manier geproduceerd in HEK293 cellen en wordt gezuiverd door affiniteitschromatografie. BDNFavi wordt dan direct mono-biotinylated met het enzym BirA in een buis. BDNFavi en mono-biotinylated BDNFavi behouden hun biologische activiteit in vergelijking met commercieel verkrijgbaar BDNF.

Een verbeterd protocol om te zuiveren en direct Mono-Biotinylaat Recombinant BDNF in een tube voor cellulaire trafficking studies in neuronen

Hier wordt een op suspensie HEK293-cel gebaseerd AAV-productieprotocol gepresenteerd, wat resulteert in minder tijd en arbeid die nodig is voor vectorproductie met behulp van componenten die beschikbaar zijn voor onderzoeksdoeleinden van commerciële leveranciers.

Productie van Adeno-geassocieerde vectorbatches met hoog rendement met behulp van HEK293-suspensiecellen

Leer een schaalbaar protocol voor de productie van volledige huntingtinevarianten in HEK293-cellen met behulp van transiënte expressie en anti-FLAG-affiniteitschromatografie. Deze methode garandeert meer dan 95% zuiverheid.

Efficiënte en schaalbare productie van volledige menselijke huntingtinevarianten in zoogdiercellen met behulp van een transiënt expressiesysteem (Video) | JoVE Journal

Efficiënte en schaalbare productie van volledige menselijke huntingtinevarianten in zoogdiercellen met behulp van een transiënt expressiesysteem

Meer video's verkennen