Efficiënte en schaalbare productie van volledige menselijke huntingtinevarianten in zoogdiercellen met behulp van een transiënt expressiesysteem

Het protocol is ontwikkeld voor de productie van full-length huntingin varianten op een lage milligram schaal. Het zorgt voor consistente hoogwaardige eiwitten die essentieel zijn voor ZvH-onderzoekers. De procedure wordt gedemonstreerd door Michael Harris, een onderzoekswetenschapper van het Curia Laboratory.

Begin met het toevoegen van een gram polyethyleenimine 25 K aan een liter endotoxine vrij water en roer goed. Stel de pH in op 2,0 met 100 milliair zoutzuur en roer totdat alle polyethyleenimine is opgelost. Stel vervolgens de pH in op 7,0 met behulp van een natriumhydroxideoplossing van 100 millimolaire en laat de oplossing door een filter van 0,2 micrometer lopen.

Maak aliquots van de gefilterde oplossing en bewaar ze bij min 20 graden Celsius. Vermeerder HEK293-cellen in het groeimedium aangevuld met penicilline streptomycine in een bevochtigde shaker incubator bij 37 graden Celsius, 90 RPM, 5% koolstofdioxide gedurende 18 tot 24 uur. Verdun de cellen een dag voor de transfectie met een dichtheid van ongeveer 1,2 x 10 tot de zesde krachtcellen per milliliter in twee liter groeimedium in een erlenmeyer van vijf liter en incubeer gedurende 18 tot 24 uur.

Meet aan het einde van de incubatie de celdichtheid en levensvatbaarheid met behulp van een autocelteller volgens de instructies van de fabrikant. Na het berekenen van de hoeveelheid polyethyleenimine en plasmide die nodig is voor transfectie, verdunt u polyethyleenimine en plasmide afzonderlijk in 100 milliliter PBS en incubeert u gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Meng vervolgens het verdunde plasmide en polyethyleenimine door het mengsel gedurende 30 minuten voorzichtig te draaien en incubeer het bij kamertemperatuur.

Voeg het mengsel toe aan de celcultuur en meng door zachtjes te draaien. Laat de cellen nu 24 uur groeien. Voeg de volgende dag natriumbutyraatoplossing toe aan een uiteindelijke concentratie van twee millimolaire antiklonter- en antischuimmiddel in een volumeverhouding van 1: 1. 000 tot de cultuur en incubeer de cellen in de bevochtigde shaker-incubator gedurende 48 uur.

Na het meten van de levensvatbaarheid en dichtheid van de cel, oogst de cellen door centrifugeren bij 2.000 G gedurende 30 minuten en bewaar de celpellet bij min 80 graden Celsius voor zuivering. Voor anti-FLAG zuivering met behulp van FPLC, verpak 12 tot 25 milliliter anti-FLAG hars op een lege kolom met een stroomsnelheid van vier milliliter per minuut met behulp van buffer A en pas de hoogte van de zuiger aan om de opening tussen het uiteinde van de plunjer en het bed van hars te verwijderen. Suspensie vervolgens de ontdooide celpellet in koude lysisbuffer en passeer de celsuspensie eenmaal door een high-shear homogenisator met een druk van 1.000 pond per vierkante inch.

Gebruik een centrifuge die is uitgerust met een compatibele rotor met vaste hoek en verduidelijk het lysaat gedurende één uur bij 20.000 G. Programmeer FPLC onder het venster Methode, laad het geklaarde lysaat via de monsterpomp en was de kolom met de gewenste kolomvolumes van buffer A, B, C, D en elutiebuffer zoals beschreven in het tekstmanuscript. Zodra de run is voltooid, analyseert u 10 microliter van de piekfracties met behulp van SDS-PAGE.

Combineer de piekfracties met de gewenste zuiverheid en bespaar ongeveer 50 microliter van de gecombineerde eluaten voor verdere SDS-PAGE-analyse. Begin met het balanceren van de SEC-kolom met behulp van de FPLC en laad het anti-FLAG-eluaat via een superloop van 50 milliliter. Nadat u de SEC-buffer hebt uitgevoerd, laat u de SEC-scheiding 's nachts plaatsvinden bij vier graden Celsius.

Vergelijk het elutieprofiel met het standaard HTT-elutieprofiel om de monomeer-, dimer- en hogergeorde oligomere pieken te onderscheiden. Pool de monomere HTT-fracties op basis van het elutieprofiel van de SEC-kolom en bundel, indien gewenst, de hoger geordende oligomere en dimerische HTT-fracties afzonderlijk. Concentreer het gepoolde HTT-eiwit met behulp van een centrifugale concentrator van 100 kilodalton bij vier graden Celsius.

Na het berekenen van de eiwitconcentratie, aliquot minder dan 100 microliter van het gezuiverde HTT-eiwit in een cryoveilige microcentrifugebuis. Flash bevries de aliquots met vloeibare stikstof en bewaar ze bij min 80 graden Celsius. Voer alle analytische SEC-MALS uit bij vier graden Celsius op het HPLC-systeem, gekoppeld aan een UV-detector, een multi-angle lichtverstrooiingsdetector, een differentiële brekingsindexdetector en gebruik 0,185 als de brekingsindextoename voor HTT.

Spoel de pomp en de detectoren met gefilterd water van HPLC-kwaliteit en sluit de UHPLC-kolom aan op het systeem. Breng de kolom in evenwicht met gefilterd water en vervolgens de SEC-MALS-buffer totdat alle detectorsignalen de basislijn bereiken. Injecteer twee microliter BSA-oplossing met een stroomsnelheid van 0,3 milliliter per minuut gedurende 15 minuten per injectie.

Inspecteer de gegevenskwaliteit, voer normalisatie, piekuitlijning en bandverbredingscorrectie uit op basis van het BSA-profiel en maak een sjabloon voor de volgende HTT-voorbeeldruns. Ontdooi snel een injectieflacon van het FL Q23-HTT-monster in een waterbad op kamertemperatuur met behulp van een vlotter. Filter de HTT door een 0,1 micrometer spinfilter.

Injecteer twee tot vier microliter van het HTT-monster en laat gedurende 15 minuten draaien bij vier graden Celsius met een stroomsnelheid van 0,3 milliliter per minuut. Analyseer de chromatografische en lichtverstrooiingsgegevens met behulp van bijbehorende software en genereer een Zimm-plot om de gewichtsgemiddelde moleculaire massa voor elke piek te bepalen. In de huidige studie, met behulp van een tweestapskolomproces, werd meer dan 95% van de zuiverheid verkregen voor HTT en de belangrijkste verontreiniging was chaperone Hsp70, die werd geëlimineerd door uitgebreid wassen met magnesiumchloride en ATP tijdens de anti-FLAG affiniteitszuiveringsstap Overexpressie van FL HTT kan leiden tot fragmentatie van het eiwit, maar FL Q23-HTT geproduceerd door de methode opgelost als een enkele band met het juiste molecuulgewicht van 350 kilodalton geeft aan dat er geen fragmentatie.

Western blot-analyse na de reactie van antilichamen met FL Q23-HTT toonde aan dat het eiwit werd geïsoleerd zonder significante detecteerbare truncaties, omdat er geen extra fragmentgerelateerde banden werden waargenomen. FL HTT poly-Q lengtevariantie, Q23, Q48 en Q73 reageerden zoals verwacht in Western blot, met een progressief sterker signaal voor poly-Q-gericht monoklonaal antilichaam MW1, correlerend met toenemende Q-lengte. Van de geteste HPLC-kolommen vertoonde de SEC-kolom voldoende resolutie tussen het HTT-monomeer en het dimeer, zodat molaire massa's konden worden onderscheiden.

Gezuiverde FL HTT van SEC toonde meerdere banden die overeenkomen met de oligomerisatietoestanden, wat zou kunnen komen door de aanwezigheid van verschillende hydrofobe pleisters die bijdragen aan de vorming van hoger geordende oligomeren tijdens migratie in de gel. Gezuiverde HTT toonde drie belangrijke banden op blauwe inheemse PAGE met een geschat molecuulgewicht van 643, 927 en 1.070 kilodalton die waarschijnlijk respectievelijk de monomere, dimerische en trimerische soorten HTT vertegenwoordigen. Een goede behandeling van gezuiverd huntingtine is essentieel om te voorkomen dat hooggeordende oligomeren in oplosbare aggregaten worden gegenereerd.

Het is absoluut noodzakelijk dat de eindgebruiker snel werkt om het monster in voorgekoelde buizen te doseren voordat het flash wordt ingevroren. Langdurige stabiliteitstests kunnen worden uitgevoerd op monsters die gedurende langere perioden bij min 80 graden Celsius zijn opgeslagen. Herhaalde HPLC SEC-MALS-analyses zullen bevestigen of er een wijziging is opgetreden in de monomere inhoud van het monster.