Confocale beeldvorming met hoge doorvoer van Quantum Dot-geconjugeerde SARS-CoV-2 Spike Trimers om binding en endocytose in HEK293T-cellen te volgen

We hebben een platformtechnologie voor SARS COVID 2 opgezet die van toepassing kan zijn op andere virussen met Spike-gemedieerde celherkenning en -invoer als de eerste stap in cellulaire virale infectie. Quantum dots zijn helder, stabiel en hun oppervlak kan worden gefunctionaliseerd voor een verscheidenheid aan cellulaire toepassingen. Met behulp van deze methode kunnen we Spike-internalisatie in cellen visualiseren en meten.

Om 0,1% BSA voor te bereiden. Voeg 130 microliter van 7,5% BSA toe aan 10 milliliter beeldmedia in de mix. Voeg voor een 6,1 tot drie seriële verdunning en drievoud 14,26 microliter QD Spike toe aan 285,74 microliter van de 0,1% BSA om de hoogste concentratie van 20 nanomol te maken.

Voeg vervolgens 100 microliter van 20 nanomol of QD Spike toe aan 200 microliter van 0,1% BSA om de tweede waan van 6,67 nanomol QD Spike te maken. Verwijder alle gebruikte media uit elke put met een meerkanaals aspirator, was eenmaal met een meerkanaalspipet met 100 microliter beeldmedia per put enspirateer vervolgens 100 microliter van de beeldvormende media. Voeg 50 microliter QD Spike-oplossing per put toe en incubeer de plaat gedurende drie uur in een bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide.

Draag beschermende uitrusting, bereid 4% PFA en 0,1% PSA-beeldvormingsmedia voor in een steriele bioveiligheidskast, zuig 50 microliter QD Spike uit elke put en voeg 100 microliter van 4% PFA per put toe met een geautomatiseerde meerkanaalspipet om te voorkomen dat de putten worden gedroogd. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, was vervolgens drie keer met PBS, bereid de dieprode kernkleurstof voor door de vijf millimeter voorraadoplossing te verdunnen bij één tot 1000 in PBS, zuig de PBS op en voeg 50 microliter verdunde kernkleurstof per put toe. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur en was vervolgens drie keer met PBS, beeld de plaat in of verzegel deze met een platensealer voor beeldvorming later.

Bewaar het bord bij vier graden Celsius. Start de software voor het imaging platform. Na het inloggen op het beeldvormingsplatform maakt u een nieuw acquisitieprotocol door het plaattype te selecteren als een 96-wand transparante bodembeeldplaat, selecteer optische modus is focale en vergroting als 40 keer onderdompeling in water gegaan, selecteer binning als één.

Selecteer de modus voor digitale gezichtscontrasten zoals hoog contrast om goed gedefinieerde cellichamen te produceren. Maak een momentopname om te bevestigen dat deze kop geschikt is zoals te zien in het afbeeldingsvenster, selecteer het geschikte C-kanaal voor gebruik met de ACE2-GFP-cellijn om ACE2-handel in de cel te visualiseren. Om een aangepast QD-kanaal te maken, selecteert u het vervolgkeuzemenu driehoek en kiest u de excitatie in het 405 nanometerbereik in emissie in het bereik van 608 nanometer, selecteert u een put met een robuust cytoplasmatisch QD-signaal om de belichtingstijd, het laservermogen en de Z-hoogtepositie in te stellen.

Controleer of de standaardhoogte een afbeelding van de cellen in het gewenste brandpuntsvlak oplevert. De Z-positie zal lager zijn voor de endocytose puncta dan de Z-positie voor het plasmamembraan. Kies een belichtingstijd, meestal tussen 100 en 300 milliseconden, die een helder beeld oplevert met grijswaarden die ten minste drie keer groter zijn dan het achtergrondsignaal.

Bij 20 nanomol zouden de grijswaarden ongeveer 6.000 atomaire eenheden moeten zijn met een belichtingstijd van 200 milliseconden en een laservermogen van 80%. Controleer grijsniveaus door met de rechtermuisknop op de afbeelding te klikken die is geproduceerd met de snapshot-functie in elk kanaal en toonintensiteit te selecteren, klik vervolgens met de linkermuisknop op het interessante object of de achtergrond om het grijsniveau voor die pixel te bekijken, pas het laservermogen aan om de intensiteit van de interessante objecten nauwkeurig af te stellen. Sla het acquisitieprotocol op, schakel over om het experiment uit te voeren en voer de naam van de plaat in, voer het experiment uit.

Translocatie van zowel QD's als ACE2 werd gevisualiseerd met behulp van fluorescentiemicroscopie en een ACE2-GFP-expresserende cellijn. Beeldsegmentatie en daaropvolgende analyse werd uitgevoerd om relevante parameters zoals het aantal vlekken te extraheren. Eerst werden kernen gesegmenteerd uit het nucleaire markerkanaal om een ROI-populatie te creëren.

Vervolgens een ROI-regio waarin de cel wordt geschetst met gesegmenteerd met behulp van het ACE2-GFP-kanaal. Ten slotte werden QD 608 Spike-spots gesegmenteerd vanuit de cel ROI-regio, geïnternaliseerde QD- en ACE2-signalen vertoonden een sterke co-lokalisatie. Een concentratieresponsexperiment met zes verschillende concentraties QD Spike werd uitgevoerd in HEK 293T-cellen.

Het bepalen van optische concentraties van QD, QDS kan worden gebruikt zo laag als 2,22 nanomol, maar het wordt aanbevolen om concentraties van 10 nanomol of hoger te gebruiken om een robuuste respons te garanderen. Tijdens conjugatie naar de QD-eiwitaggregatie kan optreden. Aggregaten werden in de QD-oplossing gespot als heldere samengeklonterde neerslag en HEK 293T-cellen, QD's werden geïncubeerd met geneutraliseerde antilichamen vanaf 30 microgram per microliter vóór toevoeging aan cellen, deze antilichamen blokkeerden bindende internalisatie en veroorzaakten een vermindering van het aantal vlekken in vergelijking met cellen die alleen met QD werden behandeld.

Dit essay kan ook worden gebruikt voor high-throughput screening, leadevaluatie van neutraliserende antilichamen om pun antivirals te identificeren voor de blok virale binnenkomst en worden aangepast om nieuw opkomende varianten te bestuderen.