Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain

Het protocol illustreert hoe in vivo deep-tissue drie-fotonenmicroscopie kan worden uitgevoerd in muizenhersenen en volwassen zebravissen. Twee belangrijke modelsystemen in de life sciences. Lange golflengte drie-foton microscopie maakt in vivo hoge ruimtelijke resolutie beeldvorming van intacte weefsels of organen mogelijk op diepten die ontoegankelijk zijn door twee-fotonenmicroscopie.

Deze techniek kan ons helpen de onderliggende mechanismen van neurologische ziekten te begrijpen, zoals alzheimer en autisme, waarbij een volledig begrip van hoe de ziekte de hersenen beïnvloedt ontbreekt. Kibaek Choe, de postdoctorale onderzoeker van ons laboratorium en de zebravis hersenbeeldvormingsprocedure demonstreert Kristine Kolkman, een onderzoeksmedewerker van het Fetcho Research Laboratory. Schakel om te beginnen de laser in en stel de middelste golflengte van de idler-uitgang van de niet-collineaire optische parametrische versterker in op 1, 300 of 1, 700 nanometer, plaats vervolgens pulscompressoren op het lichtpad om de femtosecondelaser vooraf te tsjilpen en de pulsduur te optimaliseren voor beeldvorming met drie fotonen.

Stel de hoek tussen de siliciumplaat en het laserpad in de hoek van Brewster in om de lasertransmissie te maximaliseren en draai vervolgens de siliciumplaat om de hoek van Brewster te bereiken door de reflectie te minimaliseren. Plaats vervolgens flipperspiegels om gemakkelijk te schakelen tussen de 1, 300 en 1, 700-nanometer bundellijnen. Plaats een halve golfplaat gemonteerd op een rotatietrap en een polariserende straalsplitter om de intensiteit van de laser te regelen en plaats vervolgens een bundelblokker in het reflectiepad van de bundelsplitser.

Bereid een petrischaaltje met 0,5 centimeter 2% hoogsmeltpunt agar. Zodra de agar is afgekoeld en gestold, snijdt u een rechthoekig gat in de agar dat langer en iets breder is dan de vis. Bevestig met behulp van was dunne buizen aan de petrischaal met één uiteinde in de rechthoek en een buis met een grotere diameter aan de rand van de petrischaal.

Verdoof vervolgens de vis door hem in een tricaïne-oplossing van 0,2 milligram per milliliter te plaatsen, plaats vervolgens de verdoofde vis op zijn kant op een natte spons, gebruik vervolgens een microsyringe, retro-orbitaal injecteer 3 microliter pancuroniumbromide om de vis te verlammen en plaats hem kort in de oplossing van Hank om ervoor te zorgen dat deze volledig verlamd is. Plaats vervolgens de dorsale kant van de vis in de petrischaal met de kop naar de slang, gebruik vervolgens een tang, open voorzichtig de mond van de vis en schuif de slang in de mond. Schuif de vis voorzichtig naar de slang zodat de slang aan de achterkant van de bek van de vis komt te staan.

Droog snel, maar voorzichtig, de agar rond de vis en verwijder het water bovenop de vis. Doop een klein stukje laboratoriumweefsel in laboratoriumlijm en leg het weefsel op de agar aan beide zijden van de vis en over de rug van de vis caudaal naar de kieuwen. Verdoof vervolgens de huid van de vis door een kleine druppel bupivacaïne direct op het oppervlak van het hoofd te plaatsen en breng vervolgens de petrischaal met de vis naar de microscoop.

Vul de schaal met viswater en sluit de slang aan op een waterpomp om systeemwater in de bek van de vis te pompen. Zorg ervoor dat het water met een bubbler van zuurstof wordt voorzien en met een aquariumverwarmer wordt opgewarmd tot 30 graden Celsius. Plaats voor beeldvorming een objectief met lage vergroting op de microscoop met drie fotonen, plaats vervolgens de petrischaal met de vis en de buizen onder de microscoop en gebruik een LED-lichtbron om de petrischaal te verlichten.

Open in de beeldacquisitiesoftware de cameramodus, klik op Live, kies kanaal A aan de rechterkant van het scherm en pas de histograminstellingen aan om de afbeelding duidelijk te zien. Nadat u de motorinstelling op de motorcontroller op de basis hebt ingesteld, verlaagt u het doel totdat de vis zichtbaar is. Plaats het midden van de viskop in het midden van het gezichtsveld en beweeg het doel omhoog en weg van de kop van de vis.

Vervang de objectieflens met lage vergroting door de objectieflens met hoog numeriek diafragma voor beeldvorming met drie fotonen en beweeg deze vervolgens dicht bij het hoofd van de vis. Stel de aswaarden van alle motoren in op nul. Laat de objectieflens langzaam zakken en zorg ervoor dat het objectief geen fysiek contact maakt met het hoofd.

Stop in de CCD-camerasoftware met het bewegen van het objectief wanneer de bovenkant van de kop zichtbaar is en stel de X-, Y- en Z-locaties in op nul. Schakel de LED-lichtbron uit en sluit het donkere gordijn rond het systeem, stel vervolgens de beeldverwerkingssoftware in op de multifoton GG-modus voor beeldvorming met drie fotonen en stel het vermogen onder de objectieflens in op minder dan een milliwatt. Klik op de knop Live in de beeldacquisitiesoftware.

Open PMT-kanalen en pas de PMT-versterking en het achtergrondniveau indien nodig aan. Beweeg langzaam de objectieflens omhoog om het oppervlak van het hoofd te lokaliseren door het THG-kanaal te bewaken vanuit de grote bloedvaten en het glazen oppervlak van het venster. Nadat u de objectieflens dicht bij het venster hebt geplaatst, brengt u water aan tussen het objectief en het schedelvenster en stelt u de aswaarden van alle motoren in op nul.

Klik op de knop Live in de beeldacquisitiesoftware. Open PMT-kanalen en pas de PMT-versterking en het achtergrondniveau indien nodig aan, en beweeg vervolgens langzaam de objectieflens omhoog om het oppervlak van de afdekslip te lokaliseren door het THG-kanaal te bewaken vanaf de grote bloedvaten en het glasoppervlak van het venster. Pas indien nodig de vensteroriëntatie aan en zet vervolgens de motoren op nul om het oppervlak van de hersenen te definiëren.

Voer beeldvorming uit en pas het vermogensniveau aan op basis van de beelddiepte. Hoge resolutie, niet-invasieve en diepe beeldvorming van genetisch gelabelde neuronen in het hersenen van volwassen zebravissen wordt bereikt met behulp van drie-fotonenmicroscopie. De verdeling van cellagen in het optische tectum en cerebellum kan ook worden waargenomen.

De camerafunctie van de microscoop werd gebruikt om de vis te lokaliseren. De schedel is te zien in het THG-kanaal, dat helpt bij het navigeren door de hersenen en het vinden van het bovenste oppervlak. Neuronen zijn te onderscheiden met een hoge signaal-tot-achtergrondverhouding diep in het volwassen brein.

Veelkleurige driefotonenafbeeldingen van GCaMP6s-gelabelde neuronen en Texas Red-gelabelde bloedvaten samen met THG-signalen in het volwassen muizenbrein worden hier getoond. Met setup-optimalisatie werden met succes contrastrijke beelden verkregen tot op 1,2 millimeter van het hersenoppervlak in het CA1-hippocampusgebied. Calciumactiviteitssporen van GCaMP6s-gelabelde neuronen op een diepte van 750 micrometer voor een opnamesessie van 10 minuten toonden een hoge opnamegetrouwheid.

Deze opstelling kan helpen bij het visualiseren van neuronale activiteit om de hersenfunctie te begrijpen. Het kan ook worden gebruikt om celbewegingen in biologisch weefsel te volgen om verschillende biologische systemen te begrijpen. Bovendien kan de bloedstroomsnelheid ook worden gemeten om de gezondheid van het dier te controleren.