In vitro Karakterisering van Histone Chaperones met behulp van Analytische, Pull-Down en Chaperoning Assays

Ons protocol beschrijft hoe technieken zoals pull-down assays analytical size exclusion chromatography, analytical ultra-centrifugation en histone chaperoning assay kunnen worden gebruikt om te bevestigen of een eiwit een histon chaperone is. De technieken die hier worden behandeld, kunnen bij het gebruik van tandem direct worden toegepast om een vermeende chaperonne te karakteriseren. hij kon meegaan met de structurele biologietechniek.

De technieken zijn toepasbaar op het gebied van chromatineonderzoek. De individuele methoden kunnen echter worden toegepast op elk ander eiwit van belang, indien nodig. De procedure wordt gedemonstreerd door mr. Surajit Gandhi, een promovendus uit mijn laboratorium, voor de gecompliceerde pull-down assay; Ms.

Archana Samal, een promovendus, samen met de heer Ruchir C.Bobde voor het analytische ultracentrifugatie-experiment;De heer Somanath Baral, een promovendus;samen met de heer Ketul Saharan voor de plasmide super-coiling assay Meng eerst vijf micromolaire histon chaperones met 20-micromolar H2A / H2B dimeren in 300 microliter equilibratiebuffer. Centrifugeer het histon chaperone H2A/H2B complex om eventuele neerslag te verwijderen.

Laad het monster op de spinkolom die vooraf in evenwicht is gebracht met de equilibratiebuffer. Was de kolom met 100 kolomvolumes of vier milliliter wasbuffer om overtollig H2A/H2B-dimeer te verwijderen. Meng vervolgens het histon chaperone H2A/H2B complex met 20-tot 60-micromolair H3/H4 tetrameer.

Spoel de kolom opnieuw met 100 kolomvolumes of vier milliliter wasbuffer om elk ongebonden H3/H4-tetrameer te verwijderen en elueerde de monsters vervolgens met elutiebuffer. Onderwerp de geëlueerde monsters aan 18% SDS-PAGE. Bevlek vervolgens met Coomassie briljantblauwe R250 en visualiseer de gel.

Zuiver het H2A/H2B-dimeer, H3/H4-tetrameer in de histoncalysone individueel met de dialysebuffer met behulp van analytische grootte-exclusiechromatografie. Sla de buffer op van de run om later verdere verdunningen voor te bereiden en als referentie in de AUC-cel te gebruiken. Meng voor AUC-monsters de gezuiverde chaperones met dimeer of tetrameer in afzonderlijke buizen tot een eindvolume van 450 microliter met behulp van de opgeslagen dialysebuffer om een OD280 van 0,3 tot 0,6 te bereiken.

Monteer de cel met een dubbelzijdig middelpunt en kwartsvensters voorzien van een analytische ultracentrifuge met een absorptiedetector. Vul 400 microliter van de monsteroplossing en 420 microliter dialysebuffer in respectievelijk de referentie- en monstersectoren van de cel. Weeg en balanceer de cellen nauwkeurig en laad ze in een titanium rotor met vier gaten.

Lijn de cellen uit met behulp van de markeringen aan de onderkant van de cellen en de rotor. Laad de rotor in de centrifuge, sluit het deksel en start de run, waardoor een vacuüm kan ontstaan en de temperatuur kan stabiliseren. Bereken voor gegevensanalyse de dichtheid en viscositeit voor de eiwitbuffercomponenten en het gedeeltelijke specifieke volume op basis van de aminozuursamenstelling van het eiwit met behulp van het programma SEDNTERP.

Laad de gegevens van de AUC-machine in het programma SEDFIT. Definieer de groene lijnen van de meniscus, de rode lijn, de celonder, de blauwe lijn en de grenzen van de gegevensanalyse. Kies Continue CS-distributie als model.

Stel in de sectie parameters het maximale resolutie in op maximaal 100. Stel vervolgens de sedimentatiecoëfficiënt minimaal in op nul en maximum op 10 tot 15. Stel de wrijvingsverhouding in eerste instantie in op 1,2 en kies ervoor om te zweven om de verhouding uit de gegevens af te leiden.

Stel de F-ratio in op 0,68 voor één sigma regularisatie. Stel gedeeltelijk specifiek volume, bufferdichtheid en viscositeit in zoals verkregen uit de SEDNTURP. Druk op Uitvoeren om de software toe te staan de lamvergelijking op te lossen.

Druk op Aanpassen om te verfijnen. Kies Piek Mw weergeven in CS in de weergavefunctie van de hoofdwerkbalk om moleculaire massa's te schatten. Meng twee micromolair H3/H4 tetrameer en vier micromolair H2A/H2B dimeer met toenemende concentraties histon chaperonne, variërend van één tot zes micromolar, in een assemblagebuffer tot een eindvolume van 50 microliter.

Incubeer het mengsel bij vier graden Celsius gedurende 30 minuten. Gelijktijdig voorbehandeling 500 nanogram van het negatief supergerolde PUC-19 plasmide met één microgram topoisomerase I-enzym in de assemblagebuffer in een eindvolume van 50 microliter. Combineer vervolgens de voorgemengde oplossing met tetrameer, dimeer en histon chaperonne met het ontspannen plasma-DNA.

Voeg 100 microliter 2X stopbuffer toe en incubeer om de assemblagereactie te beëindigen door het plasmide-DNA te deproteiniseren. Voeg een gelijk volume Tris-verzadigd fenol toe aan de buis die het reactiemengsel bevat en meng de inhoud van het reactiemengsel goed. Centrifugeer vervolgens het monster.

Verzamel voorzichtig de bovenste waterige fase met het plasmide-DNA met een micropipette en meng een gelijk volume chloroform. Vortex het mengsel. Verzamel vervolgens de bovenste waterige fase, voeg een 1/10 volume drie-molair natriumacetaat van pH 5,5 en 2,5 volumes ijskoude ethanol toe.

Meng de oplossing goed door de buis drie tot vier keer om te keren. Centrifugeer het monster gedurende 10 minuten bij 16.200 g en gooi het supernatant voorzichtig weg. Houd de buizen open bij kamertemperatuur totdat zelfs sporenhoeveelheden ethanol verdampen, waardoor het neergeslagen plasmide-DNA in de buis achterblijft.

De analytische SEC-resultaten toonden aan dat het recombinante N-terminale nucleoplasminedomein van het Arabidopsis thaliana-eiwit FKBP53 een pentameer is van 65 kilodalton in oplossing. Het nucleoplasminemonster dat aan een warmtebehandeling werd onderworpen, toonde aan dat het domein zeer thermostabiel is. Het nucleoplasminedomein vertoonde zoutstabiliteit tot twee molars natriumchloride en ureumstabiliteit tot vier kiezen.

Een pull-down assay onthulde dat de interactie van het nucleoplasminedomein met H2A / H2B-dimeer stabiel was tot 0,4-molair natriumchloride, terwijl de associatie met H3 / H4 stabiel was tot 0,7 kiezen. De chaperonne bindt H2A/H2B dimeer en H3/H4 tetrameer gelijktijdig, ongeacht de volgorde waarin ze aan de chaperonne worden toegevoegd, wat afzonderlijke interactieplaatsen voor de oligomeren aangeeft. De geschatte moleculaire massa's via AUC-SV onthullen een 1:1 stoichiometrie van nucleoplasminedomein met de histon oligomeren.

In de plasmide super-coiling assay verhoogden recombinante plant histon chaperones AtNRP1 en AtNRP2 de hoeveelheid super-coiled plasmide, wat suggereert dat het histonen op het DNA zou kunnen afzetten om nucleosomen te vormen, waardoor DNA super coiling ontstaat. Plasmide super-coiling assay vereist speciale zorg en mogelijke optimalisatie voor histon DNA en chaperone karakterisering. Isomere karakteriseringstelemetrie kan worden gebruikt als follow-up van analytische experimenten met het uitsluiten van grootte om de bindingsstabiliteit te bevestigen.