Analyses van actinedynamica, koppelingskoppeling en tractiekracht voor groeiconusvooruitgang

Koppelingsanalyse van single speckle imaging en tractiekracht microscopisch kan moleculaire machines analyseren voor groeikegelvooruitgang en navigatie. Omdat de technieken gebruik maken van commercieel verkrijgbare materialen en standaard microscopen. Onderzoekers kunnen zich letterlijk aanpassen aan de technieken in hun studies.

Begin met het behandelen van de neuronen met tetramethyl-rhodamine of TMR-ligand bij een verdunning van één tot 2000 in kweekmedium op de dag in vitro 3. Houd vervolgens de neuronen gedurende een uur op 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Was na incubatie het TMR-ligand driemaal met voorverwarmd PBS.

Verwijder de PBS voordat u 0,5 milliliter opgewarmd L-15-medium van Leibovitz aan de neuronen toevoegt. Houd de neuronen gedurende een uur op 37 graden Celsius. Zet vervolgens een epifluorescentiemicroscoop aan en stel de bovenste incubator van de staat in op 37 graden Celsius.

Plaats vervolgens de met TMR ligand behandelde neuronen in de glazen onderste schaal op de verwarmde incubator aan de bovenkant. Stel de beeldacquisitieparameters in, zoals belichtingstijd op 500 milliseconden voor een Lifeact- en HaloTag-actinefluorescentiekanalen en binning als 0,065 micron bij 0,065 micron per pixel bij een tijdsinterval van drie seconden voor 50 frames. Na het selecteren van een groeikegel die Lifeact sterk tot expressie brengt en wekelijks HaloTag-actine tot expressie brengt.

Sluit het veld op het diafragma om een minimaal gebied met de groeikegel te verlichten en timelapse-beelden te verkrijgen. Vervang op de dag in vitro 3 het kweekmedium door 0,5 milliliter verwarmd L-15-medium van Leibovitz en houd de neuronen gedurende een uur op 37 graden Celsius. Schakel voor tractiekrachtmicroscopie een confocale laserscanmicroscoop in en stel de incubator van het podium in op 37 graden Celsius.

Plaats de neuronen op de glazen onderste schaal op de vooraf gewaarschuwde incubator aan de bovenkant van het podium. Stel de beeldacquisitieparameters in zoals beschreven in het menuscript en selecteer een groeikegel die sterk tot expressie komt met verbeterd groen fluorescentie-eiwit of EGFP. Focus op het geloppervlak en verkrijg time-lapse-beelden.

Als u klaar bent, gebruikt u beeldverwerkingssoftware om RGB-beeldstapels met één kanaal te produceren. Sla de afbeeldingen vervolgens op als tiff-bestanden. Breng vervolgens 100 microliter van 10% gewicht per volume natriumdodecylsulfaat of SDS opgelost in gedestilleerd water aan op de glazen bodemschaal om het gelsubstraat te ontspannen door neuronen uit het substraat vrij te maken.

Incubeer vervolgens het gerecht in de incubator van het podiumtop gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius om de temperatuur te stabiliseren. Richt je in de confocale microscoop van het laserscannen op het geloppervlak om een beeld te krijgen van de kralen in het ongetrainde substraat. Produceer een enkelkanaals RGB-afbeelding van de kralen in het ongetrainde substraat en sla deze afbeelding op als tiff-bestand.

Download de tractiekrachtanalysecode TFM2021 en open TFM2021 in MATLAB. Open hoofdgerecht. m in TFM2021 en voer het uit.

Wanneer een grafische gebruikersinterface op het scherm verschijnt. Klik op load untrained, substrate image en selecteer de X-Y positie gecorrigeerde kraal afbeelding in het ongetrainde substraat. Ga naar fluorescerende kralenafbeeldingen laden en selecteer de time-lapse-stapel afbeeldingskralen.

Klik vervolgens op bright-field images laden om de time-lapse stack image van bright-field te kiezen en gebruik load GFP images om de time-lapse stack image van EGFP te selecteren. Selecteer in de vervolgkeuzelijst op de grafische gebruikersinterface GFP voordat u op ROI klikt om het gewenste rechthoekgebied op te geven, inclusief de groeikegel, door op twee punten op de weergegeven celafbeelding te klikken. Als u klaar bent, klikt u op de knop Opslaan op de grafische gebruikersinterface om de geselecteerde stapelafbeeldingen samen met de ROI in een matbestand op te slaan.

Klik vervolgens ter plaatse op detecteren en voer een gewenste waarde in het dialoogvenster in om een drempel voor kraaldetectie te bepalen. Druk op ok om de berekening te beginnen. Nadat u de berekening hebt voltooid, klikt u op plottrack om het eerder geselecteerde gebied te vergroten en de gedetecteerde kralen als witte stippen weer te geven.

Gebruik geselecteerde kralen om een veelhoekig gebied af te bakenen dat de juiste stippen onder de groeikegel bevat. Door vervolgens op enter op het toetsenbord te drukken, veranderen de witte stippen in het veelhoekige gebied in rood. Klik op schattingskracht in de grafische gebruikersinterface.

Voer vervolgens waarden in voor de pixelgrootte en young's modulus zoals uitgelegd in het manuscript. Zet de waarde voor de verhouding van Poisson op 0,3 en voer de schattingskracht uit om de berekening te starten. De software slaat de berekeningsresultaten op in een spreadsheetformaatbestand.

De fluorescentiebeelden van een neuronale groeikegel toonden een hoge Lifeact-expressie die de visualisatie van de morfologie van de groeikegel onder een volledig open en smal diafragma mogelijk maakte. HaloTag-actine expressie niveaus waren zeer laag met dim signalen. Wanneer het diafragma op de juiste manier is versmald, nemen achtergrondsignalen af en verschijnen er enkele handelingen in spikkels in de groeikegel.

Onderzoekers die alle stappen op de juiste manier bereiken, zullen de retrograde stroom F-actine in de groeikegel observeren. De stijfheid van de polyacrylamidegel werd bepaald door de inkepingsdiepte te berekenen die werd veroorzaakt door het gewicht van de microsfeer. Een confocale laserscanmicroscoop werd gebruikt om beelden van het geloppervlak en de bodem van de microsfeer vast te leggen.

De signalen van de fluorescerende kralen waren niet zichtbaar aan het geloppervlak in het ingesprongen gebied. Fluorescentiebeelden van de kralen ingebed in de polyacrylamidegel en de neurale groeikegel, toonden de kralen in hun oorsprong en verplaatste posities. Het EGFP-signaal van de groeikegel werd ook waargenomen.

De kymografen toonden de bewegingen van de kraal in vergelijking met een referentiekraal. Bij het uitvoeren van een enkele spikkelbeeldvorming, belangrijke dingen om een neuron te selecteren dat wekelijks uitdrukt hoe te acteren onder twee een minimumgebied. Bij het uitvoeren van een tractiekrachtmicroscopie is beeldvorming met een hoge vergroting belangrijk voor een nauwkeurige concentratie van tractiekracht.