Generatie van null-mutanten om de rol van bacteriële glycosyltransferasen in bacteriële motiliteit op te helderen

Neurmienzuurderivaat is dus alleen aanwezig in pathogene bacteriën, aminiglycosylated flagella bevat deze suiker. In frame deletie van regio in de genen kan helpen om flagella glycosylatie clusters te vinden. Deze techniek, de nieuwste specifieke regio of genen, zoals glycosyltransferasen die een hoge homologie tussen hen hebben en betrokken zijn bij verschillende processen, en analyseren de betrokkenheid ervan bij het flagellaglycosylatieproces.

Deze techniek kan ook helpen om de rol van glycosyltransferasen te vinden die betrokken zijn bij de biosynthese van relevante polysacchariden in pathogene bacteriën en ook de rol van gen-coderende eiwitten die betrokken zijn bij flagellavorming. Maite Polo, een technicus van mijn laboratorium, demonstreert de procedure. Ontwerp twee paar primers die DNA-gebieden stroomopwaarts en stroomafwaarts van het geselecteerde gen of gebied versterken dat moet worden verwijderd.

Primers A en D moeten aan het vijfprime-uiteinde een restrictieplaats bevatten voor een endonuclease die klonen in pDM4 mogelijk maakt. Zorg ervoor dat primers B en C zich in het te verwijderen gen bevinden of in het eerste en laatste gen van het te verwijderen gebied. Zorg ervoor dat beide primers in beeld zijn en zich tussen de vijf en zes codons in het gen bevinden.

Zorg ervoor dat beide primers een 21 basenparen gratis sequentie bevatten aan het vijf priemgetal om DNA-amplicons AB en CD samen te voegen.Gebruik 100 nanogram gezuiverd chromosomaal DNA als sjabloon in twee sets asymmetrische PCR's met AB- en CD-primers gevolgd door de analyse van resulterende producten in 1% agarosegel. Zuiver en kwantificeer de weggesneden ampliconen uit elektroforetische gel. Meng 100 nanogram van elk amplicon met PCR-reagentia zonder primer.

Voeg na het verlengen A- en D-primers toe en versterk ze als een enkel fragment. Analyseer, zuiver en kwantificeer vervolgens de resulterende producten zoals eerder beschreven. Verteer één microgram pDM4 en 400 nanogram AD amplicon met een endonuclease.

Combineer de verteerde pDM4 met AD amplicon op een molaire vector tot insert ratio van één tot vier en bereid de ligatiereactie voor. Incubeer 's nachts bij 20 graden Celsius. Inactiveer later T4-ligase bij 70 graden Celsius gedurende 20 minuten.

Ent de Escherichia coli-stam in Luria Bertani Miller-bouillon en incubeer bij 30 graden Celsius met schudden bij 200 RPM totdat een optische dichtheid tussen 0,4 en 0,6 wordt waargenomen. Pellet de bacteriecultuur door centrifugeren op 5.000 keer G en vier graden Celsius gedurende 15 minuten. Suspensie van de pellet in gekoeld gedestilleerd water en herhaal het reinigingsproces nog twee keer.

Breng de bacteriesuspensie over naar microfugebuizen en herhaal de centrifugatie bij 14.000 keer G en vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Voeg na het resuspenderen van de pellet in gekoeld water ongeveer 3,5 microliter van het ligatiemengsel toe en incubeer gedurende vijf minuten op ijs. Breng de inhoud over in een gekoelde twee millimeter gap elektroporatie cuvette.

Voeg na elektroporatie het SOC-medium toe en breng de inhoud over naar een kweekbuis. Incubeer gedurende een uur bij 30 graden Celsius met schudden bij 200 RPM. Plaat de getransformeerde cellen op LB agar platen aangevuld met chlooramfenicol.

Controleer het invoegen van het deletieconstruct in pDM4 door PCR met behulp van primers die de pDM4-kloonzijde flankeren. Bereid 's nachts culturen voor zodat de ontvangende Aeromonas-stam rifampicineresistent is en twee verschillende stammen van Escherichia coli. De donorstam met het pDM4 recombinante plasmide en de helperstam met het PRK 2073 plasmide bij 30 graden Celsius.

Suspensie hetzelfde aantal kolonies van de donor-, ontvanger- en helperstammen in drie LB-buizen met 150 microliter LB. Meng vervolgens op een LB-agarplaat zonder antibiotica de drie bacteriële suspensies in twee druppels bij een verhouding tussen ontvanger en helper tot donor van vijf op één tot één en incubaleer de plaat 's nachts met het gezicht naar boven bij 30 graden Celsius. Oogst bacteriën door een milliliter LB-bouillon toe te voegen aan de LB-agarplaat. Breng de bacteriële suspensie over in een conische microfugebuis van 1,5 milliliter en vortex krachtig.

Verspreid 100 microliter van de bacteriële suspensie op LB-agarplaten met rifampicine en chlooramfenicol. Draai 200 microliter en 600 microliter van de monsters naar beneden, suspenstuur de pellet in 100 microliter LB-bouillon en plaat op LB-agar met rifampicine en chlooramfenicol gevolgd door incubatie. Voer een oxidasetest uit om te bevestigen dat de kolonies Aeromonas zijn.

Bevestig verder de insertie van pDM4-recombinant plasmide in het specifieke chromosomale gebied door PCR met behulp van de E- en F-primers. Kweek de recombinante kolonies in twee milliliter LB met 10% sucrose en zonder antibiotica 's nachts bij 30 graden Celsius. Na het bereiden van verschillende kweekverdunningen, plaat 100 microliter van de bacterieculturen en verdunningen op LB agarplaat met 10% sucrose en incubeer 's nachts bij 30 graden Celsius.

Pak de volgende dag de kolonies op en breng ze over naar LB-platen met en zonder chlooramfenicol. Nadat je ze 's nachts bij 30 graden Celsius hebt uitgebroed, selecteer je de chlooramfenicolgevoelige kolonies. Analyseer de gevoelige kolonies door PCR met behulp van het EF-primerspaar en selecteer de kolonies waarvan het PCR-product correleerde met de grootte van de verwijderde constructie.

Plaats een klein druppeltje siliconen in de vier hoeken van de afdekplaat en monteer 's nachts gekweekte cultuur van Aeromonas op een afdekplaat. Plaats een uitgegraven dia op de afdekplaat en draai de dia ondersteboven. Analyseer de zwemmotiliteit door lichtmicroscopie met behulp van een optische microscoop en breng vervolgens drie microliter van de cultuur over op het midden van een zachte agarplaat.

Incubeer de plaat 's nachts met de voorkant naar boven tussen de 25 en 30 graden Celsius. Meet met behulp van een liniaal aan het einde van de incubatie de bacteriële migratie van het plaatcentrum naar de periferie door de agar. Culture Aeromonas stamt 's nachts in 900 milliliter TSB tussen de 25 en 30 graden Celsius.

Na centrifugeren suspensie van de pellet in 20 milliliter van 100 millimolaire Tris waterstofchloridebuffer van pH 7,8. Om de verankerde flagella te verwijderen, schuift u de suspensie gedurende drie tot vier minuten in een vortex met een glazen staaf en gaat u vervolgens herhaaldelijk door een spuit van 21 gauge. Pellet de bacteriën door twee opeenvolgende centrifugaties bij vier graden Celsius en verzamel het supernatant in een aparte buis.

Na ultracentrifuging van het supernatant, suspensie de pellet in 150 microliter van 100 millimolar Tris waterstofchloride met twee millimolar EDTA-buffer. Breng 150 microliter van de verrijkte fractie flagella over in een dunwandige ultraheldere buis en vul deze met 12 milliliter cesiumchlorideoplossing. Ultracentrifugeer de buis op 60.000 keer G gedurende 48 uur bij vier graden Celsius in een zwaaiende emmerrotor.

Verzamel de flagellaband in de cesiumchloridegradiënt met een spuit en dialyseer tegen 100 millimolar Tris waterstofchloride plus twee millimolar EDTA gevolgd door analyse door elektroforese en Coomassie blauwe kleuring of massaspectrometrie. In de volgende figuur is baan WT Aeromonas piscicola AH3. Lanes één tot acht toont chlooramfenicol gevoelige kolonies van de tweede recombinatie.

ST is hyperblaas 1KB marker. Lanes één tot drie en vijf tot acht tonen de kolonies met wild type FGI4 gen als lane WT. Baan vier toont een kolonie met het verwijderde FGI4-gen. Lichte microscopie-assays toonden aan dat polaire of laterale flagellamodificaties alleen leiden tot reducties in de migratiediameters, dus AH-3 FGI-mutant en AH-3 FGI-4-mutanten vertonen slechts verminderde motiliteit in relatie tot de wildtype-stam.

De figuur toont polair flagellum van AH-3 van baan één, en de geen mutanten in het FGI-gebied van baan twee en FGI-4 gen van baan drie, waarbij beide mutanten polaire flagellines hebben met een lager molecuulgewicht dan de wildtype stam, wat veranderingen in de flagella glycaan suggereert. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat mutaties geen invloed hebben op downstream-genen en leiden tot het onvermogen tot de flagella-assemblage of het onvermogen van filamenten van flagella. Wanneer verandering in flagelline-eiwitten niet detecteerbaar is, is massaspectrometrie-analyse vereist met behulp van het totale eiwit van flagellinepeptiden om de glycaanmassa te kennen.