ACT1-CUP1-testen bepalen de substraatspecifieke gevoeligheden van spliceosomale mutanten in ontluikende gist

De ACT1-CUP1 Assay kan identificeren of een mutatie pre-messenger RNA splicing beïnvloedt en een indicatie geven van welke splicingstap het meest wordt beïnvloed. De ACT1-CUP1 Assay koppelt splicing factor mutatie aan de impact ervan op het complexe proces van splicing. Het maakt gebruik van de eenvoudige uitlezing van het groeifenotype en heeft een breed gevoeligheidsbereik.

Efficiënt gebruik van tijd is belangrijk bij het uitvoeren van een ACT1-CUP1 Assay. Begin met een test van vijf tot 10 stammen om stress-geïnduceerde groeiafwijkingen te minimaliseren. Het proces wordt gedemonstreerd door mijzelf en Isabelle Marasigan, een niet-gegradueerde onderzoeker uit mijn laboratorium.

Voeg om te beginnen 790 milligram agar en een roerstaaf toe aan elke fles. Bereid in een groot bekerglas de leucine dropout groeimedia voor op alle koperen platen die moeten worden gegoten. Dit omvat 265 milligram giststikstofbasis, 64 milligram dropout-mix, minus leucine, en 34 milliliter gedeïoniseerd water voor elke te gieten plaat.

Roer om op te lossen Voeg vervolgens 34 milliliter van de leucine dropout groeimedia-oplossing toe aan elke bereide fles van 100 milliliter en sluit af met aluminiumfolie. Vervolgens autoclaaf om de agar te steriliseren en op te lossen, met behulp van de aanbevolen vloeistofcyclus voor de autoclaaf. Voeg zo snel mogelijk na het autoclaveren vier milliliter 20% glucose toe aan elke fles.

Stem vervolgens het buisetiket af op het etiket van de fles om de twee milliliter verdunningen van kopersulfaat elk aan de beoogde fles toe te voegen. Gebruik een roerplaat, meng gedurende ongeveer 30 seconden en giet of pipetteer 35 milliliter in de gelabelde plaat, vermijd bubbels. Voeg per giststam negen milliliter leucine dropout groeimedia en één milliliter 20% glucose toe aan een steriele, 50 milliliter conische buis.

Verzamel met behulp van een steriele stok of pipetpunt een klein staaltje gist en ent de media in. Schud vervolgens alle nachtculturen op 180 RPM en 30 graden Celsius. Voeg vervolgens 100 microliter cultuur toe aan een cuvette, met 900 microliter water per stam.

Meet daarna de optische dichtheid met een spectrofotometer en bereken de verdunning die nodig is om bij een optische dichtheid van 0,5 te zijn in een eindvolume van twee milliliter. Verdun vervolgens elke stam tot optische dichtheid 0,5 in 10% glycerol en meet de optische dichtheid opnieuw om te bevestigen dat de celdichtheid binnen het gewenste bereik ligt. Steek na het instellen van een steriele werklocatie een Bunsenbrander aan.

Voor een 48-pins Replicator pipet u 200 microliter van elke verdunde stam in een afzonderlijke put van een 96-well plaat en vult u de lege ruimtes in het raster van zes bij acht met 200 microliter van 10% glycerol. Dompel vervolgens de replicator in een ondiepe schaal van 95% ethanol en vlam om te steriliseren. Laat het minstens twee minuten afkoelen nadat de vlam is gedoofd om te voorkomen dat de cellen door hitte worden geschokt.

Plaats vier platen in de buurt van de brander en verwijder de deksels. Dompel de replicator in de 96-well plaat en til hem in één snelle beweging op. Plaats vervolgens voorzichtig op de plaat en schommel licht heen en weer om een goede overdracht mogelijk te maken.

Til op in één snelle beweging en plaats in exact dezelfde richting in de 96-well plaat. Nadat een plaat is verguld, beweegt u met een soepele beweging naar de zijkant, maar nog steeds binnen de sterilisatieparaplu van de vlam. Laat de borden volledig drogen voordat je de deksels erop plaatst, meestal drie tot vijf minuten.

Incubeer vervolgens de borden gedurende drie dagen bij 30 graden Celsius. Nadat u de platen uit de incubator hebt verwijderd, inspecteert u ze visueel. De groeitest toonde aan dat naarmate de koperconcentratie toeneemt, stammen met lagere splicing een verminderde samenvloeiing vertonen, tot het punt waarop de koperconcentratie dodelijk wordt.

De gistachtergrond bevat een verstoord ADE2-gen, waardoor de kolonies verschillende tinten rood zijn. En de volwassen kolonies waren dieprood van kleur. Tijdens het plateren, als de replicator wordt opgetild terwijl hij naar links of rechts beweegt, onder een hoek wordt gebracht of boven de plaat wordt geschud, is het mogelijk om kolonies te maken die ovaalvormig zijn, of microkolonies van kleine druppeltjes celoplossing.

Gist met de A3c-reporter overleefde tot 0,15 millimol koper, terwijl de wild-type reportercellen levensvatbaar bleven tot het einde van het geteste bereik van koperconcentraties. De testresultaten toonden aan dat de verschillende basen op U6 snRNA-positie 57 unieke effecten hebben op het spliceosoom in combinatie met een 5 priem- of branch-sitemutatie. Terwijl U57c een additieve mutatie is, die de kopertolerantie vermindert, in combinatie met A3c- en branch site G-verslaggevers.

U57a daarentegen verhoogt de kopertolerantie omdat het de progressie naar de tweede stap bevordert. Nadat splicing perturbatie is geïdentificeerd via ACT1-CUP1, kan onderzoek overgaan op meer kwantitatieve methoden, zoals primer-extensie en de identificatie van verstoorde moleculaire interactie door EMSAs en enzymatisch tasten. ACT1-CUP1 is een fundamentele test geweest, die ons begrip van de robuustheid en selectiviteit van het gistspliceosoom heeft opgebouwd.

En het blijft ons begrip van de spliceosomale functie uitbreiden.