Name: ACT1-CUP1-testen bepalen de substraatspecifieke gevoeligheden van spliceosomale mutanten in ontluikende gist (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Leer de ACT1-CUP1-test om pre-mRNA-splitsing in gist te evalueren en spliceosomale mutanten te identificeren. Deze methode gebruikt een groeifeno-type als eenvoudige aflezing voor onderzoek naar genetische mechanismen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dank aan Aaron Hoskins en de Hoskins-lableden van de Universiteit van Wisconsin-Madison voor het gebruik van giststammen en apparatuur bij het genereren van figuren 3-5. Dank aan Harpreet Kaur en Xingyang Fu voor hun inzichtelijke commentaar op het manuscript. Bedankt aan de ondersteunende studenten, medewerkers en faculteit van northwest university tijdens het schrijven, monteren en filmen van dit artikel. Bedankt aan Isabelle Marasigan voor hulp bij het filmen van deze methode.

1. Giststamconstructie
<ol><li>Genereer of verkrijg een S. cerevisiae-stam waarvan de achtergrond leu2 en cup1Δ omvat. Om deze achtergrond te genereren, gebruikt u de gevestigde gistmethode die lithiumacetaat en enkelstrengs DNA39 gebruikt. OPMERKING: Haploïde giststammen kunnen één, twee of meer exemplaren van CUP1 6,38 bevatten. Raadpleeg genomische informatie voor de geselecteerde giststam bij het ontwerpen van knock-out primers om de cup1-genlocatie(s) te flankeren.</li>
	<li>Voer een gisttransformatie uit om de QSP op te nemen via genomische opname of op een plasmide. Gebruik een goed ingeburgerd protocol zoals beschreven in eerder onderzoek 40,41,42.</li>
	<li>Voer een gisttransformatie uit met de resulterende stam(en) uit stap 1.2. om het gewenste ACT1-CUP1 reporter plasmide toe te voegen. OPMERKING: Cellen moeten worden onderhouden op leucine drop-out (-Leu) platen en media om ervoor te zorgen dat de ACT1-CUP1 reporter plasmiden na deze transformatie behouden blijven.</li>
	<li>Voer stappen 1.2 uit. en 1.3. voor elke te testen QSP en elk TE testen ACT1-CUP1 reporterplasmide, inclusief controlestammen.</li>
</ol>2. Koperen plaatvoorbereiding
<ol><li>Selecteer een koperconcentratiebereik dat past bij de te testen verslaggevers (zie tabel 1 voor de letaliteit van vaak gebruikte verslaggevers). OPMERKING: Een voorbeeld van een uitgebreid koperconcentratiebereik is 30 verschillende koperconcentraties van 0 mM, 0,025 mM, 0,05 mM, 0,075 mM, 0,1 mM, 0,15 mM, 0,2 mM, 0,25 mM, 0,3 mM, 0,35 mM, 0,4 mM, 0,45 mM, 0,5 mM, 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM en 2,5 mM Cu2+.</li>
	<li>Maak een stockoplossing van 1 M CuSO4 en steriel filter door een steriel filter van 0,22 μm PES (polyethersulfon).</li>
	<li>Bereid per gewenste koperplaat een verdunning van 2 ml van de CuSO4-kolf in steriel water. OPMERKING: Aangezien de plaat met 0 mM Cu2+ altijd als referentie wordt geanalyseerd en afgebeeld, wordt aanbevolen om twee 0 mM Cu2+ platen te maken, één aan het begin en één aan het einde van de beplatingsstap (stap 3.4.).<ol><li>Bereken de hoeveelheid voorraad voor de uiteindelijke gewenste koperconcentratie in 40 ml van het plaatvolume (aanvullende tabel 1).</li>
		<li>Voeg de berekende hoeveelheid steriel water en 1 M CuSO4-voorraad toe aan een steriele buis van 2 ml.</li>
	</ol></li>
	<li>Giet platen voor de ACT1-CUP1 assay. OPMERKING: Een alternatief voor het onderstaande protocol is om in eerste instantie de media en agar in een grote container en aliquot te combineren na autoclaveren in kleinere containers om verschillende koperconcentraties voor elke plaat te bereiken. Welke methode ook wordt gevolgd, het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de mediaconcentratie consistent is tussen alle platen, ondanks dat ze elk een andere koperconcentratie hebben.<ol><li>Label elke lege plaat die moet worden gegoten met de uiteindelijke koperconcentratie die het zal bevatten. Bereid ten minste één vierkante plaat per te testen koperconcentratie voor.</li>
		<li>Label een te testen fles van 100 ml per koperconcentratie.</li>
		<li>Voeg aan elke fles 790 mg agar (2% w/v agar) en een roerstaaf toe.</li>
		<li>Combineer in een groot bekerglas de -Leu groeimedia voor alle te gieten koperen platen. Los per te maken plaat 265 mg giststikstofbase (YNB) en 64 mg drop-out mix minus leucine (en alle andere voedingsstoffen die nodig kunnen zijn om het QSP-plasmide in de cellen te behouden) op in 34 ml gedeïoniseerd water.</li>
		<li>Voeg 34 ml van de -Leu groeimedia-oplossing toe aan elke bereide fles van 100 ml en dop met aluminiumfolie. Label de folie met de beoogde koperconcentratie.</li>
		<li>Autoclaaf om de agar te steriliseren en op te lossen met behulp van de aanbevolen vloeistofcyclus voor de autoclaaf.</li>
		<li>Voeg zo snel mogelijk 4 ml 20% w/v glucose (steriel gefilterd) toe aan elke fles.</li>
		<li>Match de etiketten en voeg de 2 ml verdunningen van CuSO4 toe aan de beoogde fles. OPMERKING: Omdat tientallen koperen platen tegelijkertijd kunnen worden gemaakt, elk met een andere concentratie, zal het duidelijk labelen van alle flessen, buizen en platen met de beoogde koperconcentratie verwarring tijdens het gieten van de plaat voorkomen.</li>
		<li>Gebruik een roerplaat om ~ 30 s te mengen en giet of pipetteer 35 ml in de gelabelde plaat, vermijd bubbels. Laat afkoelen voordat u het opbergt of gebruikt. OPMERKING: Vaak worden de platen 1 dag of 2 dagen voor de test gemaakt en bewaard bij 4 °C tot enkele uren voor gebruik. De platen moeten op kamertemperatuur (RT) zijn voordat de beplating begint (stap 3.4.).</li>
	</ol></li>
</ol>3. ACT1-CUP1-test
<ol><li>Streep de gewenste stammen uit op -Leu platen. OPMERKING: Als u vanuit cryovoorraden werkt, moet ervoor worden gezorgd dat de cellen voldoende uit de opslag worden gereanimeerd voordat ze worden plating. Een aanbevolen procedure hiervoor is om uit de cryogene voorraad te strepen en deze gedurende 3-5 dagen bij 30 °C te laten groeien. Herstel vervolgens een klein staal en laat het nog 2-3 dagen groeien bij 30 °C.</li>
	<li>Kweek overnight culturen in 10 ml media.<ol><li>Bereid -Leu groeimedia met dezelfde verhoudingen als beschreven in stap 2.4.2. Voeg per 10 ml media 66 mg giststikstofbase (YNB) en 16 mg drop-out mix minus leucine toe aan 9 ml gedeïoniseerd water. Ga door een steriel filter van 0,22 μm PES.</li>
		<li>Voeg per giststam 9 ml -Leu groeimedia en 1 ml 20% w/v glucose (steriel gefilterd) toe aan een steriele conische buis van 50 ml.</li>
		<li>Verzamel met behulp van een steriele stok of pipetpunt een klein (~ 1 mm rond) staal van gist en ent de media in.</li>
		<li>Schud alle nachtculturen op 180 rpm en 30 °C. OPMERKING: Indien beschikbaar, kunnen rotatoren worden gebruikt in plaats van een shaker.</li>
	</ol></li>
	<li>Verdun de stammen tot een OD600 0,5 ± 0,05 in 10% glycerol.<ol><li>Voeg per stam 100 μL cultuur toe aan een cuvette met 900 μL water.</li>
		<li>Meet de OD600 met een spectrofotometer.</li>
		<li>Bereken de verdunning die nodig is bij een OD600 van 0,5 in een eindvolume van 2 ml.</li>
		<li>Verdun elke stam tot OD600 0,5 in 10% glycerol (steriel).</li>
		<li>Meet de OD600 opnieuw om te bevestigen dat de celdichtheid binnen het gewenste bereik van 0,5 ± 0,05 ligt.</li>
	</ol></li>
	<li>Plaats de spanningen op de koperen platen. OPMERKING: Er kunnen verschillende methoden worden gebruikt om de stammen te platen, waaronder het met de hand pipetteren van volumes van 5-10 μL, met behulp van een herhaalde of meerkanaals pipettor of stempelen met een pinreplicator. Deze laatste methode wordt hieronder beschreven, hoewel de meeste stappen vergelijkbaar zullen zijn, ongeacht de methode.<ol><li>Stel een steriele werklocatie en een brandende Bunsenbrander in.</li>
		<li>Voor een 48-pins replicator pipetteer je 200 μL van elke verdunde stam in een aparte put van een 96-well plaat. Vul de lege plekken in het rooster van 6 x 8 met 200 μL 10% glycerol (steriel). OPMERKING: Een voorbeeld van een platingschema voor negen giststammen staat in aanvullende tabel 2.</li>
		<li>Dompel de replicator in een ondiepe schaal van 95% (v/v) ethanol en vlam om te steriliseren. Laat het minstens 2 minuten afkoelen nadat de vlam is gedoofd om te voorkomen dat de cellen door hitte worden geschokt.</li>
		<li>Plaats vier platen in de buurt van de brander en verwijder de deksels.</li>
		<li>Dompel de replicator in de 96-well plaat en til hem in één snelle beweging op.</li>
		<li>Leg zachtjes op de plaat en schommel licht heen en weer om een goede overdracht mogelijk te maken.</li>
		<li>Til op in één snelle beweging en plaats in exact dezelfde richting in de 96-well plaat.</li>
		<li>Herhaal dit voor maximaal drie andere borden. Herhaal het proces van het onderdompelen van de replicator in ethanol, vlammen om te steriliseren en wachten om elke vier platen af te koelen.</li>
		<li>Nadat een plaat is verguld, beweegt u met een soepele beweging naar de zijkant, maar nog steeds binnen de sterilisatieparaplu van de vlam. OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de gistverdunningen en plating in de buurt van een vlam te doen. De platen kunnen gemakkelijk besmet raken tijdens het drogen.</li>
		<li>Laat de borden volledig drogen voordat u de deksels erop plaatst, meestal 3-5 min.</li>
		<li>Incubeer de platen gedurende 3 dagen bij 30 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Gegevensverzameling en -analyse
<ol><li>Verwijder de platen uit de couveuse en inspecteer ze visueel.</li>
	<li>Neem de beelden van de platen op met een beschikbare camera of ander digitaal beeldvormingssysteem.</li>
	<li>Noteer (of score) voor elke stam de laatste zichtbare koperconcentratie die zichtbaar is. OPMERKING: De cellen kunnen splitsen en levensvatbaar blijven tot die concentratie. Gebruik voor consistentie altijd dezelfde methode, hetzij met het oog of van de plaatafbeeldingen, om de laatste levensvatbare koperconcentratie te scoren. Zeer kleine kolonies zijn soms zichtbaar door het oog, maar niet op het beeld. Het verschil tussen directe visuele inspectie of opname van beelden is klein, meestal een stap in het verloop. Omdat afbeeldingen van de kolonies vaak worden gebruikt in publicaties, wordt scoren op basis van de afbeeldingen aanbevolen.</li>
	<li>Combineer gegevens van meerdere ACT1-CUP1-testen voor dezelfde stam om conclusies te trekken over hoe de QSP splicing beïnvloedt. OPMERKING: Publicatiecijfers tonen gewoonlijk afbeeldingen van de gistkolonies bij 0 mM Cu2+ concentratie, de laatste levensvatbare koperconcentratie en de daaropvolgende concentratie waar de kolonie is gestorven. Gegevens kunnen ook worden weergegeven als een staafdiagram met foutbalken voor de standaardafwijking tussen replicaties. Gegevens hoeven niet te worden genormaliseerd, maar kunnen worden door de levensvatbaarheid van de WT-splicingfactorcontrole op 1 te zetten en het effect van de geïntroduceerde mutatie(s) te vergelijken.</li>
</ol>

De auteur heeft niets te onthullen.

ACT1-CUP1 is een groeitest en er moet voor worden gezorgd dat waargenomen groeiverschillen alleen kunnen worden toegeschreven aan splicingdefecten. Alle stammen moeten op dezelfde manier worden behandeld voorafgaand aan het beplateren, inclusief een vergelijkbare lengte en type groei- en opslagomstandigheden. Bij gebruik van temperatuurgevoelige stammen mogen ACT1-CUP1-testen alleen worden uitgevoerd onder omstandigheden waarin die stammen vergelijkbaar zijn met wild type. In verband hiermee wordt voor de QSP-component g...

Het spliceosoom is een grote, biologische machine die de verwijdering van introns katalyseert, niet-coderende gebieden in precursor messenger RNA (pre-mRNA)1,2. Het karakteriseren van het effect van een single point mutant in 1 van de bijna 100 eiwitten en 5 niet-coderende RNA's is vaak dubbelzinnig bij het bestuderen van het eiwit of RNA in isolatie. De verandering in de functie van de gemuteerde component kan het best in vivo worden geëvalueerd in de context van het volledige, functionerende spliceosoom.
De hier beschreven kopergroeitest is een snelle graadmeter voor de splicing-efficiëntie in Saccharomyces cerevisiae of ontluikende gist. Ontwikkeld door C.F. Lesser en C. Guthrie en gepubliceerd in 1993, combineert deze test het gemak van het werken met een eenvoudig modelorganisme en de eenvoudige uitlezing van de levensvatbaarheid van cellen3. De levensvatbaarheid correleert met hoe goed de spliceosomen in deze cellen het transcript van de verslaggever kunnen herkennen en splitsen.
Deze kopergroeitest wordt vaker de ACT1-CUP1-test genoemd. De naam ACT1-CUP1 is afkomstig van de twee genen die zijn gefuseerd om een verslaggever van splicing-efficiëntie te creëren. ACT1 is het actinegen van gist, dat sterk tot expressie komt en een efficiënt gesplitst intron 4,5 heeft. Cup1p is een koperchelator die koper in de cel vastlegt om interferentie met reguliere cellulaire functies te voorkomen 6,7,8. De ACT1-CUP1-reporter bevat deze genen in volgorde, zodat CUP1 alleen in het juiste leesframe is als pre-mRNA-splicing van ACT1's intron optreedt (figuur 1). Het resulterende fusie-eiwit bevat de eerste 21 aminozuren van actine en het Cup1p-eiwit over de volledige lengte, wat de levensvatbaarheid van gist in een koperrijke omgeving verhoogt3. Een toename van de hoeveelheid splicing van de reporter resulteert dus in een hogere concentratie Cup1p en een hogere koperweerstand (figuur 1). In vergelijking met andere reportergenen beïnvloedt CUP1 de levensvatbaarheid van cellen, zelfs op lage niveaus, heeft het een breed gevoeligheidsbereik en kan het worden gebruikt om direct te selecteren op splicingmutaties 3,6,7. Bovendien is CUP1 niet essentieel voor standaard gistgroei, en dus wordt cellulaire homeostase niet beïnvloed tijdens het opzetten van deze test. Aanvullend op deletie- of temperatuurgroeitests biedt ACT1-CUP1 informatie over de effecten op splicing onder verder optimale gistgroeiomstandigheden.
Het spliceosoom herkent zijn substraat door middel van drie intronische sequenties, namelijk de 5' splice site (5' SS), branch-site (BS) en 3' splice site (3' SS). Er zijn talloze ACT1-CUP1-verslaggevers gegenereerd met niet-consensussequenties op deze sites. Een selectie van de meest voorkomende ACT1-CUP1-verslaggevers is weergegeven in figuur 1 en tabel 1. Aangezien het spliceosoom op unieke wijze op verschillende punten in de splicingcyclus met elke splicelocatie interageert, kan de robuustheid van het spliceosoom in verschillende stappen worden getest op basis van welke niet-consensusrapporteur wordt gebruikt. Niet-consensusverslaggevers worden genoemd naar de gemuteerde positie binnen het intron en de basis waarop het was gemuteerd. A3c is bijvoorbeeld een verslaggever met een mutatie op de 5' SS, specifiek positie 3 van de consensus adenosine naar een cytosine. Deze reporter zal sterk interageren met spliceosoommutaties die van invloed zijn op de 5's SS-selectie en -gebruik. In hun eerste studie bepaalden Lesser en Guthrie welke 5' SS-mutaties splicingremden 3. Later datzelfde jaar werden niet-consensusverslaggevers op alle drie de splice-sites gepubliceerd door Burgess en Guthrie in een suppressorscreening van mutaties in de ATPase Prp16p9. Door consensus te vergelijken met niet-consensusverslaggevers, is de ACT1-CUP1-test een belangrijke sleutel geweest om de robuustheid en selectiviteit van het gistspliceosoom te begrijpen en om de functie van de spliceosomen van andere eukaryoten af te leiden.
Aangezien niet-consensus ACT1-CUP1-verslaggevers het spliceosoom sensibiliseren voor verdere verstoring, kan de impact van een enkele splicingfactormutatie worden gekarakteriseerd door de verslaggevers die het positief of negatief beïnvloedt. Dit is op verschillende manieren toegepast op het splitsen van onderzoeksvragen. Ten eerste kan en is de ACT1-CUP1-test gebruikt als een genetische screening voor mutaties in splicingfactoren. Prp8p, het grootste splicing-eiwit, dient bijvoorbeeld als een platform waarop de RNA-kern van het spliceosoom de splicingreactie katalyseert. Dit werd gedeeltelijk afgeleid door hoe Prp8p-mutanten de splicing van verschillende ACT1-CUP1-verslaggeversverbeterden of verminderden 10,11,12,13,14,15,16,17. Andere eiwitcomponenten van het spliceosoom zijn ook onderzocht met ACT1-CUP1, waaronder Hsh155p, Cwc2p, Cef1p en Ecm2p 18,19,20,21,22,23,24,25. De energetische drempels voor Prp16p en vier andere ATPasen die betrokken zijn bij spliceosomale overgang zijn ook bestudeerd met deze assay 9,26,27,28,29,30. De kleine nucleaire RNA's (snRNA's) zijn ook uitgebreid bestudeerd met behulp van ACT1-CUP1 om de pre-mRNA-sequenties te identificeren die ze coördineren en de veranderingen in secundaire structuur die de snRNA's ondergaan tijdens splicing 3,31,32,33,34,35,36,37.
De ACT1-CUP1-test vereist een giststam waarbij alle kopieën van het CUP1-gen zijn uitgeschakeld. Omdat CUP1 een hoog kopienummer 6,38 kan hebben, kan de voorbereiding van een volledige knock-out stam meerdere rondes of uitgebreide screening vereisen. Als gevolg hiervan zijn cup1Δ-giststammen vaak gedeeld tussen laboratoria, net als de verslaggevers.
Als mutatie(s) in een splicingfactor worden beoordeeld op basis van een plasmidekopie, moet het wild-type gen voor deze factor worden uitgeschakeld. Bovendien moet de gistachtergrond de selectie van ten minste twee plasmiden mogelijk maken, één met een ACT1-CUP1-verslaggever, historisch gezien op een leucine-nutriëntenselectieplasmide, en één met een mutatie of verstoring in de splicingmachinerie die zal worden bestudeerd (figuur 2). Meestal zullen in een enkele test meerdere giststammen, elk met de query splicing perturbation (QSP) en een andere reporter, de impact van de query op splicing testen.
De onafhankelijke variabelen in de ACT1-CUP1-test stellen een onderzoeker in staat om de ernst van een QSP te beoordelen. Deze onafhankelijke variabelen zijn de concentratie van koper en de selectie van meerdere niet-consensus splicing reporters. Ten eerste, aangezien de giststammen worden gekweekt op platen die een reeks koperconcentraties bevatten (figuur 2), omvat het opzetten van de test het selecteren van de gradiënt van de gebruikte concentraties. Studies kunnen een cursus koperconcentratiegradiënt gebruiken om een eerste uitlezing van levensvatbaarheid te krijgen en vervolgens de test herhalen met een fijnere gradiënt om subtiele levensvatbaarheidsverschillen te identificeren. De tweede variabele is het brede scala aan ACT1-CUP1-melders dat kan worden getest (figuur 1 en tabel 1). Als de QSP de levensvatbaarheid van gist anders beïnvloedt in de aanwezigheid van een niet-consensusrapporteur versus wild-type, kan een conclusie worden getrokken dat de QSP een stap in splicing of een gebied van het spliceosoom beïnvloedt dat belangrijk is tijdens de herkenning of verwerking van dat gebied van het intron.
De gistenkist is uitgebreid en de ACT1-CUP1-test is een integraal onderdeel van splicing-onderzoek. De ACT1-CUP1-test wordt vaak uitgevoerd naast een meer diepgaande genetische, structurele en / of biochemische analyse van de impact van een QSP. Aangezien deze meer gedetailleerde studies over het algemeen een langere procedure en/of een hoger prijskaartje hebben, is een frequente aanpak het eerst screenen op interessante mutanten met ACT1-CUP1.
Hier wordt een ACT1-CUP1-testprotocol verstrekt, inclusief koperplaatvoorbereiding. Deze test biedt onderzoekers een eerste antwoord op het effect van een QSP op splicing en welke intronische regio's het meest worden beïnvloed door de verstoring.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL steriele microcentrifuge buizen</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td>Of een vergelijkbaar artikel van een andere fabrikant.</td></tr><tr><td>2 mL steriele microcentrifuge buizen</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-138</td><td>Of een vergelijkbaar artikel van een andere fabrikant.</td></tr><tr><td>50 mL steriele centrifuge buizen</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-201-332</td><td>Of een vergelijkbaar artikel van een andere fabrikant.</td></tr><tr><td>96-well ronde bodem microplaat</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-760</td><td>Of een vergelijkbaar artikel van een andere fabrikant.</td></tr><tr><td>190 proof ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-032-600</td><td>Of een vergelijkbaar artikel van een andere fabrikant.</td></tr><tr><td>500 mL Filter Systeem (0,22 µm)</td><td>CellTreat Scientific Products</td><td>229707</td><td>Of een vergelijkbaar artikel van een andere fabrikant.</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1423-500</td><td>Elke moleculaire kwaliteit agar zal werken.</td></tr><tr><td>Autoclaaf</td><td>Tuttnauer</td><td>3870EA</td><td>Of een vergelijkbaar artikel van een andere fabrikant.</td></tr><tr><td>Bunsenbrander</td><td>Humboldt</td><td>PN6200.1</td><td>Of een vergelijkbaar artikel van een andere fabrikant.</td></tr><tr><td>Celdichtheidmeter</td><td>VWR</td><td>490005-906</td><td>Of ander spectraal apparaat dat de absorptie bij 595 nm kan meten.</td></tr><tr><td>Kopersulfaat Pentahydraat</td><td>Fisher Scientific</td><td>LC134051</td><td>Of een vergelijkbaar artikel van een andere fabrikant.</td></tr><tr><td>Digitaal beeldvormingssysteem</td><td>Cytiva</td><td>29399481</td><td>ImageQuant 4000 (gebruikt voor figuur 3), Amersham ImageQuant 800, of een vergelijkbaar artikel van een andere fabrikant.</td></tr><tr><td>Dropout mix (-Leu)</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>D9525</td><td>Gebruik de juiste drop out mix voor je experiment. Het is mogelijk dat je ook een voedingsadditief voor je query-perturbatie gebruikt. In dat geval moet de drop out mix voor die marker en Leu zijn</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA1682836</td><td>Of een vergelijkbaar artikel van een andere fabrikant.</td></tr><tr><td>Gel band kwantificerende software</td><td>Cytiva</td><td>29-0006-05</td><td>ImageQuant TL v8.1 (gebruikt voor figuur 5A) of een vergelijkbaar artikel van een andere fabrikant.</td></tr><tr><td>Handcamera</td><td>Nikon</td><td>D3500</td><td>Of een vergelijkbaar artikel van een andere fabrikant.</td></tr><tr><td>Near infra-red gel beeldvormingsapparaat</td><td>Cytiva</td><td>29238583</td><td>Amersham Typhoon NIR (gebruikt voor figuur 5a) of een vergelijkbaar artikel van een andere fabrikant.</td></tr><tr><td>Klem van laboratoriumkwaliteit</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-769-7Q</td><td>Of een vergelijkbaar artikel van een andere fabrikant.</td></tr><tr><td>Standaard en klem van laboratoriumkwaliteit</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-000-101</td><td>Of een vergelijkbaar artikel van een andere fabrikant.</td></tr><tr><td>Magneet roerstokjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-513-51</td><td>Of een vergelijkbaar artikel van een andere fabrikant.</td></tr><tr><td>Pin replicator</td><td>VP Scientific</td><td>VP 407AH</td><td></td></tr><tr><td>Semi-micro wegwerp cuvetten</td><td>VWR</td><td>97000-590</td><td>Of een vergelijkbaar artikel van een andere fabrikant.</td></tr><tr><td>Schakelaar</td><td>JEIO Tech</td><td>IST-3075</td><td>Of een vergelijkbaar artikel van een andere fabrikant.</td></tr><tr><td>Spectrofotometer</td><td>Biowave</td><td>80-3000-45</td><td>Of elke spectrofotometer die de absorptie bij 600 nm kan meten.</td></tr><tr><td>Vierkante platen</td><td>VWR</td><td>102091-156</td><td>Ronde platen kunnen ook worden gebruikt, hoewel ze uitdagender zijn als je een pin replicator gebruikt.</td></tr><tr><td>Roerplaat</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-520-16S</td><td>Of een vergelijkbaar artikel van een andere fabrikant.</td></tr><tr><td>Gist stikstofbasis</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>Y2025</td><td>Of een vergelijkbaar artikel van een andere fabrikant.</td></tr></tbody></table>

act1-cup1-testen bepalen de substraatspecifieke gevoeligheden van spliceosomale mutanten in ontluikende gist

ACT1-CUP1 Assays Determine the Substrate-Specific Sensitivities of Spliceosomal Mutants in Budding Yeast

Mutaties geïntroduceerd in het spliceosoom of zijn substraat hebben aanzienlijk bijgedragen aan ons begrip van de fijne kneepjes van de spliceosomale functie. Of het nu gaat om ziektegerelateerde of functioneel geselecteerde mutaties, veel van deze mutaties zijn bestudeerd met behulp van groeitests in het modelorganisme Saccharomyces cerevisiae (gist). De splicing-specifieke kopergroeitest, of ACT1-CUP1-assay, biedt een uitgebreide analyse van mutatie op fenotypisch niveau. De ACT1-CUP1-test maakt gebruik van verslaggevers die kopertolerantie verlenen wanneer deze correct worden gesplitst. Dus, in aanwezigheid van koper, correleren veranderingen in de levensvatbaarheid van gist met veranderingen in mRNA-productie door splicing. In een typisch experiment wordt het gistspliceosoom uitgedaagd met verschillende niet-consensus splicing-verslaggevers en de splicingfactormutatie van belang om een synergetische of antithetische impact op splicing te detecteren. Hier wordt een volledige beschrijving gegeven van koperplaatbereiding, plating van gistcellen en gegevensevaluatie. Een selectie van complementaire experimenten wordt beschreven, waarbij de veelzijdigheid van de ACT1-CUP1-verslaggevers wordt benadrukt. De ACT1-CUP1 assay is een handig hulpmiddel in de splicing toolbox dankzij de directe uitlezing van mutatie-effect(en) en de vergelijkende mogelijkheden van het voortdurende gebruik in het veld.

Groeitests, zoals ACT1-CUP1, vereisen de visuele, vergelijkende beoordeling van meerdere kolonies. Hier werd elke stam 's nachts tot verzadiging gekweekt, verdund tot een OD600 van 0,5 en verguld op 20 platen met een bereik van koperconcentraties van 0 mM tot 1,1 mM CuSO4 (figuur 3). Dit bereik is kleiner dan het bereik dat in het protocol wordt vermeld, omdat het de volledige beoordeling van de impact van de QSP's en ACT1-CUP1-verslaggevers mogelijk maakte die hieronde...

De ACT1-CUP1-test, een kopergroeitest, biedt een snelle uitlezing van precursor messenger RNA (pre-mRNA) splicing en de impact die mutante splicingfactoren hebben op de spliceosomale functie. Deze studie biedt een protocol en benadrukt het maatwerk dat mogelijk is om de splicingvraag van belang aan te pakken.

ACT1-CUP1-testen bepalen de substraatspecifieke gevoeligheden van spliceosomale mutanten in ontluikende gist

Mutations introduced in the spliceosome or its substrate have significantly contributed to our understanding of the intricacies of spliceosomal function. ...

De ACT1-CUP1 Assay kan identificeren of een mutatie pre-messenger RNA splicing beïnvloedt en een indicatie geven van welke splicingstap het meest wordt beïnvloed. De ACT1-CUP1 Assay koppelt splicing factor mutatie aan de impact ervan op het complexe proces van splicing. Het maakt gebruik van de eenvoudige uitlezing van het groeifenotype en heeft een breed gevoeligheidsbereik.Efficiënt gebruik van tijd is belangrijk bij het uitvoeren van een ACT1-CUP1 Assay. Begin met een test van vijf tot 10 stammen om stress-geïnduceerde groeiafwijkingen te minimaliseren. Het proces wordt gedemonstreerd door mijzelf en Isabelle Marasigan, een niet-gegradueerde onderzoeker uit mijn laboratorium.Voeg om te beginnen 790 milligram agar en een roerstaaf toe aan elke fles. Bereid in een groot bekerglas de leucine dropout groeimedia voor op alle koperen platen die moeten worden gegoten. Dit omvat 265 milligram giststikstofbasis, 64 milligram dropout-mix, minus leucine, en 34 milliliter gedeïoniseerd water voor elke te gieten plaat.Roer om op te lossen Voeg vervolgens 34 milliliter van de leucine dropout groeimedia-oplossing toe aan elke bereide fles van 100 milliliter en sluit af met aluminiumfolie. Vervolgens autoclaaf om de agar te steriliseren en op te lossen, met behulp van de aanbevolen vloeistofcyclus voor de autoclaaf. Voeg zo snel mogelijk na het autoclaveren vier milliliter 20% glucose toe aan elke fles.Stem vervolgens het buisetiket af op het etiket van de fles om de twee milliliter verdunningen van kopersulfaat elk aan de beoogde fles toe te voegen. Gebruik een roerplaat, meng gedurende ongeveer 30 seconden en giet of pipetteer 35 milliliter in de gelabelde plaat, vermijd bubbels. Voeg per giststam negen milliliter leucine dropout groeimedia en één milliliter 20% glucose toe aan een steriele, 50 milliliter conische buis.Verzamel met behulp van een steriele stok of pipetpunt een klein staaltje gist en ent de media in. Schud vervolgens alle nachtculturen op 180 RPM en 30 graden Celsius. Voeg vervolgens 100 microliter cultuur toe aan een cuvette, met 900 microliter water per stam.Meet daarna de optische dichtheid met een spectrofotometer en bereken de verdunning die nodig is om bij een optische dichtheid van 0,5 te zijn in een eindvolume van twee milliliter. Verdun vervolgens elke stam tot optische dichtheid 0,5 in 10% glycerol en meet de optische dichtheid opnieuw om te bevestigen dat de celdichtheid binnen het gewenste bereik ligt. Steek na het instellen van een steriele werklocatie een Bunsenbrander aan.Voor een 48-pins Replicator pipet u 200 microliter van elke verdunde stam in een afzonderlijke put van een 96-well plaat en vult u de lege ruimtes in het raster van zes bij acht met 200 microliter van 10% glycerol. Dompel vervolgens de replicator in een ondiepe schaal van 95% ethanol en vlam om te steriliseren. Laat het minstens twee minuten afkoelen nadat de vlam is gedoofd om te voorkomen dat de cellen door hitte worden geschokt.Plaats vier platen in de buurt van de brander en verwijder de deksels. Dompel de replicator in de 96-well plaat en til hem in één snelle beweging op. Plaats vervolgens voorzichtig op de plaat en schommel licht heen en weer om een goede overdracht mogelijk te maken.Til op in één snelle beweging en plaats in exact dezelfde richting in de 96-well plaat. Nadat een plaat is verguld, beweegt u met een soepele beweging naar de zijkant, maar nog steeds binnen de sterilisatieparaplu van de vlam. Laat de borden volledig drogen voordat je de deksels erop plaatst, meestal drie tot vijf minuten.Incubeer vervolgens de borden gedurende drie dagen bij 30 graden Celsius. Nadat u de platen uit de incubator hebt verwijderd, inspecteert u ze visueel. De groeitest toonde aan dat naarmate de koperconcentratie toeneemt, stammen met lagere splicing een verminderde samenvloeiing vertonen, tot het punt waarop de koperconcentratie dodelijk wordt.De gistachtergrond bevat een verstoord ADE2-gen, waardoor de kolonies verschillende tinten rood zijn. En de volwassen kolonies waren dieprood van kleur. Tijdens het plateren, als de replicator wordt opgetild terwijl hij naar links of rechts beweegt, onder een hoek wordt gebracht of boven de plaat wordt geschud, is het mogelijk om kolonies te maken die ovaalvormig zijn, of microkolonies van kleine druppeltjes celoplossing.Gist met de A3c-reporter overleefde tot 0,15 millimol koper, terwijl de wild-type reportercellen levensvatbaar bleven tot het einde van het geteste bereik van koperconcentraties. De testresultaten toonden aan dat de verschillende basen op U6 snRNA-positie 57 unieke effecten hebben op het spliceosoom in combinatie met een 5 priem- of branch-sitemutatie. Terwijl U57c een additieve mutatie is, die de kopertolerantie vermindert, in combinatie met A3c- en branch site G-verslaggevers.U57a daarentegen verhoogt de kopertolerantie omdat het de progressie naar de tweede stap bevordert. Nadat splicing perturbatie is geïdentificeerd via ACT1-CUP1, kan onderzoek overgaan op meer kwantitatieve methoden, zoals primer-extensie en de identificatie van verstoorde moleculaire interactie door EMSAs en enzymatisch tasten. ACT1-CUP1 is een fundamentele test geweest, die ons begrip van de robuustheid en selectiviteit van het gistspliceosoom heeft opgebouwd.En het blijft ons begrip van de spliceosomale functie uitbreiden.

act1-cup1-assays-determine-substrate-specific-sensitivities

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

We hebben uitgebreide, onpartijdige genoom-brede schermen van gen-drugs-en gen-omgeving interacties te begrijpen. Methoden voor het screenen van deze mutant collecties worden gepresenteerd.

Concurrerende Genomische Schermen van streepjescode Gist Bibliotheken

Een reeks colorimetrische testen beschreven voor het snel onderscheiden eiwitten, RNA, DNA, en opnieuw in ducing suikers mogelijk heterogene biomoleculaire monsters.

Snelle Colorimetrische Testen om kwalitatief onderscheid RNA en DNA in Biomoleculaire Monsters

Hier presenteren we een kosteneffectieve methode voor het definiëren van chemisch-genetische interacties in knopgistende gist. De benadering is gebaseerd op fundamentele technieken in moleculaire biologie van gist en is zeer geschikt voor het mechanistische onderzoek van kleine tot middelgrote collecties chemicaliën en andere media-omgevingen.

Snelle identificatie van chemische Genetische Interacties in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Dit artikel beschrijft een op groei gebaseerde gisttest voor de bepaling van genetische vereisten voor eiwitafbraak. Het demonstreert ook een methode voor snelle extractie van gisteiwitten, geschikt voor western blotting om biochemisch de afbraakvereisten te bevestigen. Deze technieken kunnen worden aangepast om de afbraak van een verscheidenheid aan eiwitten te monitoren.

-Groei op basis Vaststelling en Biochemische Bevestiging van Genetische Eisen voor de afbraak van eiwitten in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Hier beschrijven we een protocol gericht op onderzoek naar de gevolgen van afwijkende splicing op resistentie in solide tumoren en hematologische maligniteiten. Om dit doel te bereiken, analyseerden we het transcriptoom profielen van de ouders en bestand in vitro modellen door middel van RNA-seq en vestigde een qRT-PCR-methode om kandidaatgenen te valideren.

Met behulp van RNA-sequencing te detecteren Novel Splice varianten Gerelateerd aan Drug Resistance in<em&gt; In Vitro</em&gt; Cancer Models

Ribonucleotides behoren tot de meest voorkomende niet-canonieke nucleotiden in het genoom opgenomen tijdens de eukaryote nucleair DNA-replicatie. Als het niet correct is verwijderd, kan ribonucleotides DNA-beschadiging en mutagenese veroorzaken. Hier presenteren we twee experimentele benaderingen die worden gebruikt voor het beoordelen van de overvloed van ribonucleotide opneming in DNA en zijn mutagene effecten.

Studeren Ribonucleotide opneming: Strand-specifieke detectie van Ribonucleotides in het genoom van de gist en het meten van Ribonucleotide-geïnduceerde mutagenese

Hier zijn vier protocollen voor het construeren en exploiteren van gist Saccharomyces cerevisiae reporter stammen te bestuderen van menselijke P53 trans activatie potentieel, effecten van de verschillende kanker-geassocieerde mutaties, co-uitgedrukt interactie eiwitten, en de effecten van specifieke kleine moleculen.

Gist als chassis voor het ontwikkelen van functionele assays voor het bestuderen van menselijke P53

Wij presenteren een eenvoudige suppressor scherm protocol in kernsplijting gist. Deze methode is efficiënt, mutageen-vrije en selectieve voor mutaties die vaak bij een enkele genomic locus voorkomen.  Het protocol is geschikt voor het isoleren van suppressors die verlichten van gebreken van de groei in vloeibare cultuur die worden veroorzaakt door een mutatie of een drug.

Een Deep-sequencing-bijgewoonde, spontane Suppressor scherm in de kernsplijting gist Schizosaccharomyces pombe

Hier beschrijven we het gebruik van Grafix (Gradient Fixation), een glycerol gradiënt centrifugatie in de aanwezigheid van een crosslinker, om interacties te identificeren tussen splicingfactoren die tijdelijk binden aan het spliceosoomcomplex.

Gebruik van Grafix voor de detectie van transiënte interactoren van Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexen

Dit protocol beschrijft een minigene reporter assay om de impact van 5'-splice site mutaties op splicing te monitoren en ontwikkelt suppressor U1 snRNA voor de redding van mutatie-geïnduceerde splicing remming. De reporter en suppressor U1 snRNA constructen worden uitgedrukt in HeLa cellen, en splicing wordt geanalyseerd door primer extensie of RT-PCR.

Een op reporter gebaseerde cellulaire test voor het bewaken van splicing-efficiëntie

Leer de ACT1-CUP1-test om pre-mRNA-splitsing in gist te evalueren en spliceosomale mutanten te identificeren. Deze methode gebruikt een groeifeno-type als eenvoudige aflezing voor onderzoek naar genetische mechanismen.

ACT1-CUP1-testen bepalen de substraatspecifieke gevoeligheden van spliceosomale mutanten in ontluikende gist

Meer video's verkennen