Name: De toepassing van open zoekgebaseerde benaderingen voor de identificatie van Acinetobacter baumannii O-gebonden glycopeptiden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Leer hoe u open zoekmethoden toepast voor de identificatie van O-gebonden glycopeptiden in Acinetobacter baumannii. Dit protocol maakt glycopeptide-identificatie toegankelijk voor onderzoekers zonder glycosyleringsexpertise.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

N.E.S wordt ondersteund door een Australian Research Council Future Fellowship (FT200100270) en een ARC Discovery Project Grant (DP210100362). We bedanken de Melbourne Mass Spectrometry and Proteomics Facility van het Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute voor toegang tot MS-instrumentatie.

OPMERKING: De bereiding en analyse van bacteriële glycopeptidemonsters kan worden onderverdeeld in vier secties (figuur 1). Voor dit onderzoek werd de glycosylatie van drie gesequencede A. baumannii-stammen beoordeeld (tabel 1). Proteome FASTA-databases van elk van deze stammen zijn toegankelijk via Uniprot. Raadpleeg tabel 2 voor de samenstelling van de buffers die in dit protocol worden gebruikt.
1. Voorbereiding van eiwitmonsters voor proteomische analyse
<ol><li>Isolatie van proteoommonsters van belang<ol>
<li>Als u hele cellen gebruikt, zorg er dan voor dat de cellen zijn gewassen met een fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om potentiële eiwitverontreinigingen in de media te verwijderen. Vries hele cellen na het wassen in en bewaar ze bij -80 °C totdat ze nodig zijn.</li>
		<li>Als gefractioneerde monsters worden gebruikt (zoals membraanpreparaten), zorg er dan voor dat de gebruikte reagentia de downstream liquid chromatography MS (LC-MS)-analyse niet verstoren50.</li>
		<li>Als detergentia, zoals natriumdodecylodeylsulfaat (SDS), Triton X-100, NP-40 of lauroylsarcosine, zijn gebruikt, verwijder deze detergentia dan met acetonprecipitatie, SP3-monstervoorbereidingsmethoden51 of commerciële proteomische reinigingskolommen zoals S-traps52. U kunt ook incompatibele detergentia vervangen door een MS-compatibel of verwijderbaar reinigingsmiddel zoals natriumdeoxycholaat (SDC) of octylglucopyranoside.</li>
		<li>Zorg ervoor dat al het plastic en glaswerk dat voor de monstervoorbereiding wordt gebruikt, niet is geautoclaveerd. Geautoclaveerd glaswerk en kunststoffen zijn meestal zwaar verontreinigd met verbindingen met een klein molecuulgewicht, zoals polymeren, die gemakkelijk worden gedetecteerd in de MS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Oplosbaarheid van hele celmonsters<ol>
<li>Resuspend ~ 10 mg gewassen, vastgevroren cellen in 200 μL vers bereid natriumdeoxycholaatlysisbuffer (SDC-lysisbuffer: 4% SDC in 100 mM Tris, pH 8,5). OPMERKING: Proteaseremmers kunnen worden toegevoegd aan de SDC-lysisbuffer om eiwitafbraak te beperken.</li>
		<li>Kook de monsters gedurende 10 minuten bij 95 °C met schudden (2000 rpm op een thermomixer) en laat vervolgens 10 minuten op ijs staan. Herhaal dit proces twee keer om een efficiënte lysis en oplosbaarheid van de monsters te garanderen. OPMERKING: Monsters kunnen op dit punt langdurig worden bewaard bij -80 °C. Indien opgeslagen, repareer door verhitting bij 95 °C voordat u verder wordt verwerkt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kwantificeer de eiwitconcentraties van het monster met behulp van een bicinchoninezuur (BCA) eiwittest53. Bewaar monsters op ijs terwijl u kwantificeert om eiwitafbraak te beperken. OPMERKING: Voor totale proteoomanalyse is 20-100 μg eiwit meer dan voldoende voor nano-LC-MS, waarvoor doorgaans minder dan 2 μg eiwitvertering per analyse nodig is. De bereiding van overtollig peptide maakt replicatieanalyse of verdere fractionering mogelijk als diepe proteomische dekking vereist is. Voor op glycopeptideverrijking gebaseerde analyse met behulp van hydrofiele interactiechromatografie (HILIC) is 100-500 μg eiwit vereist.</li>
	<li>Verminder en alkylaatmonsters.<ol>
<li>Voeg 1/10e het volume van 10x reductie/alkyleringsbuffer (100 mM Tris 2-carboxyethylfosfinehydrochloride; 400 mM 2-chlooracetamide in 1 M Tris, pH 8,5) toe aan monsters voor een eindconcentratie van 1x en incubeer monsters in het donker gedurende 30 minuten bij 45 °C met schudden bij 1.500 tpm. OPMERKING: Controleer de pH van de 10x reductie-/alkyleringsbuffer om een pH van ongeveer 7,0-8,0 te garanderen voordat u deze aan de monsters toevoegt, omdat een lagere pH ervoor zorgt dat de SDC neerslaat.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Draai de monsters kort af en voeg de proteasen Trypsin/Lys-C (~10 μL, geresuspendeerd in 100 mM Tris, pH 8,5) toe voor een uiteindelijke protease:eiwitverhouding van 1:100. Incubeer de digesten een nacht bij 37 °C met schudden bij 1.500 tpm (tot 18 uur). Gebruik voor een volledige eiwitvertering een Trypsine/Lys-C protease:eiwitverhouding van 1:50 tot 1:200.</li>
	<li>Blus digesten door 1,25 volumes 100% isopropanol aan de monsters toe te voegen. Draai de monsters gedurende 1 minuut om te mengen en draai ze kort af. OPMERKING: Monsters kunnen worden bewaard bij -20 °C om later verder te worden verwerkt.</li>
	<li>Verzuur de monsters door 0,115 volumes 10% trifluorazijnzuur (TFA; eindconcentratie van ~1% TFA) toe te voegen, vortex de monsters en draai ze kort af.</li>
</ol>2. Verwerking van proteoommonsters
<ol><li>Peptide-opschoning van proteoommonsters<ol>
<li>Bereid één styrenedivinylbenzeen-omgekeerde-fase sulfonaat (SDB-RPS) Stop-and-go-extractie (Stage) Tip voor elk monster zoals eerder beschreven54.<ol>
<li>Empirisch, voor het binden van 50 μg peptide, verwijder drie SDB-RPS-schijven uit een 47 mm2 SDB-RPS-membraan met behulp van een stompe naald (14 G). Voor grotere hoeveelheden peptiden, verhoog het aantal schijven dienovereenkomstig.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Voordat u SDB-RPS Stage Tips gebruikt, bereidt u de tips voor door achtereenvolgens ten minste tien bedvolumes van de volgende buffers toe te voegen en de buffer door de kolom te draaien door middel van centrifugering (25 °C, 3 min, 500 × g) of door de buffer door de kolom te duwen door voorzichtig druk uit te oefenen met een spuit.<ol>
<li>Maak de uiteinden nat met 150 μL 100% acetonitril.</li>
			<li>Was de uiteinden met 150 μL 30% methanol, 1% TFA in 18,2 MΩ H2O.</li>
			<li>Breng de uiteinden in evenwicht met 150 μL 90% isopropanol, 1% TFA gebalanceerd met 18,2 MΩ H2O.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Laad de monsters (die 50% isopropanol, 1% TFA bevatten) op de SDB-RPS Stage Tips door centrifugeren (25 °C, 3 min, 500 × g) of door voorzichtig druk uit te oefenen met een spuit.</li>
		<li>Was de SDB-RPS Stage Tips met de volgende buffers door centrifugeren (25 °C, 3 min, 500 × g) of door voorzichtig druk uit te oefenen met een spuit. OPMERKING: Extra wasbeurten of alternatieve buffers kunnen worden gebruikt om niet-peptideverontreinigingen te verwijderen, zoals het gebruik van ethylacetaat in plaats van isopropanol55.<ol>
<li>Was de tips met 150 μL 90% isopropanol, 1% TFA.</li>
			<li>Was de uiteinden met 150 μL 1% TFA in 18,2 MΩ H2O.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Eluteer de peptiden uit de SDB-RPS Stage Tips met 150 μL 5% ammoniumhydroxide in 80% acetonitril door centrifugeren of door voorzichtig druk uit te oefenen met een spuit. Verzamel de monsters in afzonderlijke buizen. OPMERKING: Bereid 5% ammoniumhydroxide in 80% acetonitril in een plastic container onmiddellijk voor gebruik in een zuurkast.</li>
		<li>Droog de geëlueerde peptiden door vacuümcentrifugeren bij 25 °C. OPMERKING: Als HILIC-verrijking wordt uitgevoerd, kan 1-10% van de peptide-eluaten op dit punt worden verwijderd, gedroogd en gebruikt als totale proteoominvoercontroles.</li>
	</ol></li>
	<li>Verrijking van glycopeptidemonsters<ol>
<li>Bereid Zwitterionic Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography (ZIC-HILIC) Stage Tips voor zoals eerder beschreven54,56.<ol>
<li>Snijd kort een C8-schijf uit een 47 mm2 C8-membraan met behulp van een stompe naald (14 G) en verpak de schijf in een P200-punt om een frit te maken. Voeg ongeveer 5 mm ZIC-HILIC-materiaal, geresuspendeerd in 50% acetonitril, 50% 18,2 MΩ H2O, toe aan de friet door voorzichtig druk uit te oefenen met behulp van een spuit.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Voordat u ZIC-HILIC Stage Tips gebruikt, conditioneert u de hars door achtereenvolgens de volgende buffers toe te voegen en voorzichtig druk uit te oefenen met een spuit. OPMERKING: Om de integriteit van de pseudo-waterlaag op het oppervlak van de ZIC-HILIC-hars (nodig om glycopeptiden te verrijken) te waarborgen, moet de hars altijd nat blijven. Laat bij het wassen van de hars altijd ~10 μL oplosmiddel boven de hars en zorg ervoor dat de wasbeurten/monsters direct in dit resterende oplosmiddel worden gepipetteerd.<ol>
<li>Breng de hars in evenwicht met 20 bedvolumes (200 μL) ZIC-HILIC-elutiebuffer (0,1% TFA in 18,2 MΩ H2O).</li>
			<li>Was de hars met 20 bedvolumes (200 μL) ZIC-HILIC-bereidingsbuffer (95% acetonitril in 18,2 MΩ H2O).</li>
			<li>Was de hars met 20 bedvolumes (200 μL) ZIC-HILIC laad-/wasbuffer (80% acetonitril, 1% TFA gebalanceerd met 18,2 MΩ H2O).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Resuspend de gedroogde verteerde monsters (vanaf stap 2.1.6) in ZIC-HILIC laad-/wasbuffer tot een eindconcentratie van 4 μg/μL (bv. voor 200 μg peptide, geresuspendeerd in 50 μL ZIC-HILIC laad-/wasbuffer). Vortex kort gedurende 1 minuut om ervoor te zorgen dat de monsters opnieuw worden gesuspendeerd en draai gedurende 1 minuut bij 2.000 × g bij 25 °C.</li>
		<li>Laad het geresuspendeerde peptidemonster op een geconditioneerde ZIC-HILIC-kolom.<ol>
<li>Was driemaal met 20 bedvolumes (200 μL) ZIC-HILIC laad-/wasbuffer (voor 60 bedvolumes in totaal) door voorzichtig druk uit te oefenen met een spuit.</li>
			<li>Elute glycopeptiden met 20 bedvolumes (200 μL) ZIC-HILIC elutiebuffer in een buis van 1,5 ml door voorzichtig druk uit te oefenen met behulp van een spuit en droog het eluaat vervolgens door vacuümcentrifugeren bij 25 °C.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>3. LC-MS van proteoom/glycopeptide-verrijkte monsters
<ol><li>Resuspend de monsters in Buffer A* (2% acetonitril, 0,1% TFA) tot een eindconcentratie van 1 μg/μL (bijvoorbeeld voor 50 μg peptide, resuspend in 50 μL Buffer A*).</li>
	<li>Laad de monsters op een HPLC/UPLC gekoppeld aan een MS om de scheiding en identificatie van glycopeptiden mogelijk te maken. OPMERKING: De kolomparameters, waaronder binnendiameter, lengte, stroomsnelheden, type chromatografiehars en vereiste peptide-injectiehoeveelheden, moeten worden geoptimaliseerd voor de analytische opstelling en de te gebruiken gradiëntlengte; voor een voorbeeld van het optimaliseren van analytische opstellingen, zie57.</li>
	<li>Controleer de verzameling van de resulterende MS-gegevens en zorg ervoor dat de gegevens worden verzameld met de gewenste parameters. OPMERKING: Voor de samenstellingsanalyse is de fragmentatie van de CID voldoende. Vanwege de toevoeging van glycanen aan glycopeptiden worden glycopeptide-ionen meestal waargenomen met een hogere m / z en lagere ladingsdichtheid dan unglycosylated peptiden. Om ervoor te zorgen dat deze ionen waarneembaar zijn, moet u een MS1-massabereik van 400 tot 2.000 m / z toestaan.</li>
	<li>Fragment geselecteerde ionen met behulp van CID, waardoor de verzameling van lage m / z-fragmentionen die oxoniumionen bevatten die belangrijk zijn voor de karakterisering van glycanen, wordt gewaarborgd. OPMERKING: Fragmentatie van glycopeptiden met behulp van CID wordt beïnvloed door zowel de peptide- als glycaansequenties, evenals de energie die wordt toegepast tijdens fragmentatie 25,58,59. Hoewel een reeks verschillende botsingsenergieën kan worden gebruikt, is een optimale strategie voor het fragmenteren van glycopeptiden het gebruik van getrapte botsingsenergieën die het gebruik van meerdere botsingsenergieën combineren 25,59,60.</li>
	<li>Gebruik alternatieve fragmentatiemethoden, indien beschikbaar, zoals ETD voor locatielokalisatie of IT-CID om te helpen bij het bepalen van glycaansamenstellingen. OPMERKING: Geen van deze fragmentatiebenaderingen zijn essentieel voor samenstellingsanalyse, maar kunnen worden verzameld om verdere ondervraging van glycopeptiden van belang mogelijk te maken.</li>
</ol>4. Analyse van met proteoom/glycopeptide verrijkte monsters
<ol><li>Gegevensbestanden vooraf filteren om zoeken in FragPipe mogelijk te maken<ol>
<li>Als ETD- of IT-CID-scans zijn verkregen in gegevenssets, filtert u deze scangebeurtenissen uit de gegevensbestanden met MSConvert61 voordat u met FragPipe gaat zoeken. OPMERKING: Voor de hieronder beschreven parameters voor open zoeken zijn alleen CID-gegevens van het straaltype vereist.</li>
	</ol></li>
	<li>Open zoekopdrachten uitvoeren in FragPipe<ol>
<li>Open FragPipe en klik op het tabblad Workflow . Selecteer in het vervolgkeuzemenu workflow de optie Zoekopdracht openen en klik op Bestanden toevoegen om de gegevensbestanden te importeren die moeten worden doorzocht in FragPipe (afbeelding 2A).</li>
		<li>Klik op het tabblad Database en start de downloadmanager door op Downloaden te klikken. Hierdoor kunnen proteoomdatabases worden gedownload van Uniprot met behulp van een Uniprot Proteome ID. Klik op de optie Lokmiddelen en verontreinigingen toevoegen in de downloadmanager om lok- en verontreinigingseiwitten in databases op te nemen.</li>
		<li>Voor strengere FDR-drempels klikt u op het tabblad Validatie en wijzigt u de filter- en rapportwaarde van 0,01 naar de vereiste FDR. OPMERKING: De standaard FragPipe-instellingen zorgen voor een FDR van 1% op eiwitniveau.</li>
		<li>Klik op het tabblad MSfragger . Verhoog in het vak Piekmatching de massatolerantie voor precursoren van de standaard 500 Da naar 2.000 Da om grote wijzigingen te kunnen identificeren (figuur 2A).</li>
		<li>Klik op het tabblad Uitvoeren en definieer de locatie van de uitgangen van FragPipe. Klik op de knop Uitvoeren om de zoekopdracht te starten.</li>
	</ol></li>
	<li>Met behulp van de PSM's die zijn geïdentificeerd in datasets (opgenomen in de psm.tsv-uitgangen van FragPipe), identificeert u potentiële glycanen door de frequentie van waargenomen deltamassa's in datasets uit te zetten (figuur 3). Maak deltamassaplots van MSfragger-uitgangen met behulp van de R-scripts die toegankelijk zijn via PRIDE-toetreding PXD027820. OPMERKING: Minimale nabewerking van de open zoekresultaten wordt uitgevoerd binnen deze scripts, omdat het belangrijkste doel van deze scripts is om te helpen bij de visualisatie van deltamassaprofielen. Belangrijk is dat de waarneming van overvloedige deltamassa's alleen geen bewijs is dat een modificatie een potentiële glycaan is, omdat het toewijzen van deltamassa's als glycanen verdere analyse van de overeenkomstige MS2-gebeurtenissen vereist.</li>
	<li>Om de karakterisering van glycopeptiden in monsters mogelijk te maken, richt u zich op deltamassa-identificaties met een hoge betrouwbaarheid, overeenkomend met toewijzingen met hoge hyperscores.<ol>
<li>Om te helpen bij het beoordelen van glycopeptidespectra, gebruikt u peptide-annotatietools, zoals de Interactive Peptide Spectral Annotator63, die de toewijzing van peptide-geassocieerde ionen binnen spectra mogelijk maakt, waardoor de handmatige identificatie van de glycaan-geassocieerde ionen mogelijk is (figuur 4). OPMERKING: Binnen de hier gepresenteerde datasets worden hyperscores van >30 als hoge scores beschouwd, omdat deze overeenkomen met scores binnen de top 50% van alle geïdentificeerde glycopeptiden (figuur 5).</li>
	</ol></li>
	<li>Met hoog-betrouwbaarheid glycopeptiden toegewezen, identificeer vaak waargenomen glycaan-geassocieerde ionen (figuur 4) om de identificatie van glycopeptiden te verbeteren. OPMERKING: Door glycaan-geassocieerde ionen op te nemen in zoekopdrachten, bekend als glycaangerichte zoekopdrachten, kan de kwaliteit van glycopeptide-toewijzingen worden verbeterd.<ol>
<li>Klik op het tabblad MSfragger van FragPipe en neem de vastgestelde deltamassa's van de waargenomen glycanen op in de secties Variabele wijzigingen en Massaverschuivingen . Voeg deze massa's toe door waarden te typen in de secties Variabele wijzigingen en Massaverschuivingen met afzonderlijke massa's gescheiden door een /. Voeg de glycaan-geassocieerde fragmentmassa's van deze glycanen toe aan de Glyco / Labile mods-sectie van MSFragger. OPMERKING: Figuur 2B geeft een overzicht van de belangrijkste informatie die nodig is voor een glycaangerichte zoektocht naar de A. baumannii-stam AB307-0294.</li>
	</ol></li>
	<li>Upload alle MS-gegevens die verband houden met proteomische studies naar gecentraliseerde proteomische repositories zoals de PRIDE of MASSIVE repositories. OPMERKING: Alle gegevens in verband met deze studie zijn gedeponeerd in de PRIDE proteomische repository en zijn toegankelijk via de PRIDE-toetreding: PXD027820.</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenverstrengeling.

Open searching is een effectieve en systematische methode voor het identificeren van onbekende modificaties. Hoewel de identificatie van onbekende glycanen in bacteriële proteoommonsters van oudsher een tijdrovende en technisch gespecialiseerde onderneming is, maken de recente ontwikkelingen van hulpmiddelen zoals MSfragger 21,41 en Byonic31,38 nu de snelle en effectieve identificatie van deltamassa's mog...

Eiwitglycosylatie, het proces van het hechten van koolhydraten aan eiwitmoleculen, is een van de meest voorkomende posttranslationele modificaties (PTM's) in de natuur 1,2. In alle domeinen van het leven is een reeks complexe machines geëvolueerd die zijn gewijd aan het genereren van glycoproteïnen die een groot aantal cellulaire functies beïnvloeden 1,3,4,5. Terwijl eiwitglycosylatie optreedt op een reeks aminozuren 6,7, zijn N-gebonden en O-gebonden glycosylatiegebeurtenissen twee dominante vormen die in de natuur worden waargenomen. N-gebonden glycosylering omvat de hechting van glycanen aan een stikstofatoom van asparagine (Asn) residuen, terwijl bij O-gebonden glycosylatie glycanen worden bevestigd aan een zuurstofatoom van serine (Ser), threonine (Thr) of tyrosine (Tyr) residuen7. Ondanks de overeenkomsten in residuen die het doelwit zijn van glycosylatiesystemen, resulteren de verschillen in de glycanen die aan eiwitten zijn gehecht, ertoe dat glycosylatie de meest chemisch diverse klasse ptm's is die in de natuur wordt aangetroffen.
Hoewel eukaryote glycosylatiesystemen glycaandiversiteit bezitten, zijn deze systemen meestal beperkt in het aantal gebruikte unieke koolhydraten. De resulterende diversiteit komt voort uit hoe deze koolhydraten zijn gerangschikt in glycanen 8,9,10,11,12. Daarentegen bezitten bacteriële en archaeale soorten vrijwel onbeperkte glycaandiversiteit vanwege de enorme reeks unieke suikers die binnen deze systemen worden gegenereerd 2,10,13,14,15,16,17. Deze verschillen in de glycaandiversiteit waargenomen tussen domeinen van het leven vormen een belangrijke analytische uitdaging voor de karakterisering en identificatie van glycosylatiegebeurtenissen. Voor eukaryote glycosylatie heeft het vermogen om te anticiperen op glycaansamenstellingen de groeiende interesse in glycobiologie vergemakkelijkt; hetzelfde geldt echter niet voor bacteriële glycosylatie, die nog steeds grotendeels beperkt is tot studie door gespecialiseerde laboratoria. Naarmate de toegankelijkheid van massaspectrometrie (MS) instrumentatie in de biowetenschappen is toegenomen, zijn ms-gebaseerde benaderingen nu de primaire methode voor glycoproteomische analyse.
MS is naar voren gekomen als het ultieme hulpmiddel voor de karakterisering van glycosylatie, met zowel top-down als bottom-up benaderingen die nu vaak worden gebruikt om glycoproteïnen te karakteriseren6. Terwijl top-down proteomics wordt gebruikt om globale glycosylatiepatronen van specifieke eiwitten te beoordelen18,19, worden bottom-up benaderingen gebruikt om de glycaanspecifieke karakterisering van glycopeptiden mogelijk te maken, zelfs uit complexe mengsels 6,20,21,22,23. Voor de analyse van glycopeptiden is het genereren van informatieve fragmentatie-informatie essentieel voor de karakterisering van glycosylatiegebeurtenissen24,25. Een reeks fragmentatiebenaderingen is nu routinematig toegankelijk op instrumenten, waaronder resonantie-ionenval-gebaseerde collision-induced dissociation (IT-CID), beam-type collision-induced dissociation (CID) en electron transfer dissociation (ETD). Elke benadering heeft verschillende sterke en zwakke punten voor glycopeptide-analyse25,26, met aanzienlijke vooruitgang in het afgelopen decennium bij het toepassen van deze fragmentatiebenaderingen om glycosylatie te analyseren 6,20. Voor bacteriële glycosylatieanalyse was de kritische beperking echter niet het vermogen om glycopeptiden te fragmenteren, maar eerder het onvermogen om de potentiële glycaansamenstellingen in monsters te voorspellen. Binnen deze systemen beperkt de onbekende aard van diverse bacteriële glycanen de identificatie van glycopeptiden, zelfs met glycosylatiegerichte zoekhulpmiddelen die nu gemeengoed zijn voor de analyse van eukaryote glycopeptiden, zoals O-Pair27, GlycopeptideGraphMS28 en GlycReSoft29. Om dit probleem op te lossen, is een alternatieve zoekmethode vereist, waarbij het gebruik van open zoekhulpmiddelen naar voren komt als een krachtige benadering voor de studie van bacteriële glycosylatie30.
Open zoeken, ook bekend als blind of wildcard zoeken, maakt de identificatie van peptiden met onbekende of onverwachte PTM's 21,30,31,32 mogelijk. Open zoekopdrachten maken gebruik van een verscheidenheid aan computationele technieken, waaronder samengestelde wijzigingszoekopdrachten, zoekopdrachten met meerdere stappendatabases of breed-massatolerant zoeken 33,34,35,36,37. Hoewel open zoeken een groot potentieel heeft, wordt het gebruik ervan meestal belemmerd door de aanzienlijke toename van analysetijden en verlies in gevoeligheid van de detectie van ongewijzigde peptiden in vergelijking met beperkte zoekopdrachten 31,32. De afname van de detectie van ongewijzigde peptide-spectrale matches (PSM's) is een gevolg van de verhoogde fout-positieve PSM-snelheden geassocieerd met deze technieken, die een verhoogde strenge filtering vereisen om de gewenste false discovery rates (FDR's) te behouden33,34,35,36,37 . Onlangs zijn er verschillende tools beschikbaar gekomen die de toegankelijkheid van open zoeken aanzienlijk verbeteren, waaronder Byonic 31,38, Open-pFind39, ANN-SoLo40 en MSFragger21,41. Deze tools maken de robuuste identificatie van glycosylatiegebeurtenissen mogelijk door de analysetijden aanzienlijk te verkorten en benaderingen te implementeren om heterogene glycaansamenstellingen te verwerken.
Dit artikel presenteert een gestroomlijnde methode voor de identificatie van bacteriële glycopeptiden door open zoeken, met behulp van de Gram-negatieve nosocomiale pathogeen, Acinetobacter baumannii, als model. A. baumannii bezit een geconserveerd O-gebonden glycosyleringssysteem dat verantwoordelijk is voor de modificatie van meerdere eiwitsubstraten, bekend als het PglL-eiwitglycosyleringssysteem 42,43,44. Hoewel vergelijkbare eiwitten gericht zijn op glycosylering tussen stammen, is het PglL-glycosyleringssysteem zeer variabel vanwege de biosynthese van het glycaan dat wordt gebruikt voor eiwitglycosylatie en wordt afgeleid van de capsulelocus (bekend als de K-locus)44,45,46. Dit resulteert in diverse glycanen (ook bekend als een K-eenheid), afgeleid van enkele of beperkte gepolymeriseerde K-eenheden, die worden toegevoegd aan eiwitsubstraten 30,44,46. Binnen dit werk wordt het gebruik van de open zoekfunctie, MSfragger, binnen de software FragPipe, gebruikt om glycanen over A. baumannii-stammen te identificeren. Door open zoeken en handmatige curatie te combineren, kunnen "glycaangerichte zoekopdrachten" worden uitgevoerd om de identificatie van bacteriële glycopeptiden verder te verbeteren. Samen maakt deze meerstapsidentificatiebenadering de identificatie van glycopeptiden mogelijk zonder uitgebreide ervaring in de karakterisering van nieuwe glycosylatiegebeurtenissen.

```html
<table><tbody><tr><td>14 G Kel-F Hub point style 3</td><td>Hamilton company</td><td>hanc90514</td><td></td></tr><tr><td>2-Chloroacetamide</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>C0267-100G</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>34851-4L</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium hydroxide (28%)</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>338818-100ML</td><td></td></tr><tr><td>BCA Protein Assay Reagent A</td><td>Pierce</td><td>23228</td><td></td></tr><tr><td>BCA Protein Assay Reagent B</td><td>Pierce</td><td>23224</td><td></td></tr><tr><td>C8 Empore SPE</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>66882-U</td><td>Een alternatieve leverancier voor C8 materiaal is Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/)</td></tr><tr><td>Formic acid</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>5.33002</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>650447-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Chemical</td><td>M/4058/17</td><td></td></tr><tr><td>SDB-RPS Empore SPE (Reversed-Phase Sulfonate)</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>66886-U</td><td>Een alternatieve leverancier voor SDB-RPS is Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/)</td></tr><tr><td>Sodium Deoxycholate</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>D6750-100G</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>2232000083</td><td></td></tr><tr><td>trifluoroacetic acid</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>302031-10X1ML</td><td></td></tr><tr><td>Tris 2-carboxyethyl phosphine hydrochloride</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>C4706-2G</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>252859-500G</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/Lys-C protease mixture</td><td>Promega</td><td>V5073</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum concentrator</td><td>Labconco</td><td>7810040</td><td></td></tr><tr><td>ZIC-HILIC material</td><td>Merck</td><td>1504580001</td><td>Hars voor gebruik in SPE-kolommen voor eenmalig gebruik kan worden verkregen door een grotere formulierkolom te legen en het vrije hars te gebruiken</td></tr></tbody></table>
```

de toepassing van open zoekgebaseerde benaderingen voor de identificatie van acinetobacter baumannii o-gebonden glycopeptiden

The Application of Open Searching-based Approaches for the Identification of Acinetobacter baumannii O-linked Glycopeptides

Eiwitglycosylatie wordt steeds meer erkend als een veel voorkomende modificatie binnen bacteriële organismen, die bijdraagt aan prokaryote fysiologie en optimale infectiviteit van pathogene soorten. Hierdoor is er een toenemende interesse in het karakteriseren van bacteriële glycosylatie en een behoefte aan analytische hulpmiddelen met hoge doorvoer om deze gebeurtenissen te identificeren. Hoewel bottom-up proteomics gemakkelijk de generatie van rijke glycopeptidegegevens mogelijk maakt, maken de breedte en diversiteit van glycanen waargenomen in prokaryote soorten de identificatie van bacteriële glycosylatiegebeurtenissen uiterst uitdagend.
Traditioneel maakte de handmatige bepaling van glycaansamenstellingen in bacteriële proteomische datasets dit een grotendeels op maat gemaakte analyse die beperkt was tot veldspecifieke experts. Onlangs zijn op open zoeken gebaseerde benaderingen naar voren gekomen als een krachtig alternatief voor de identificatie van onbekende wijzigingen. Door de frequentie van unieke modificaties die op peptidesequenties worden waargenomen te analyseren, maken open zoektechnieken de identificatie mogelijk van gemeenschappelijke glycanen die aan peptiden zijn bevestigd in complexe monsters. Dit artikel presenteert een gestroomlijnde workflow voor de interpretatie en analyse van glycoproteomische gegevens, die aantoont hoe open zoektechnieken kunnen worden gebruikt om bacteriële glycopeptiden te identificeren zonder voorafgaande kennis van de glycaansamenstellingen.
Met behulp van deze aanpak kunnen glycopeptiden in monsters snel worden geïdentificeerd om glycosylatieverschillen te begrijpen. Met behulp van Acinetobacter baumannii als model, maken deze benaderingen de vergelijking van glycaansamenstellingen tussen stammen en de identificatie van nieuwe glycoproteïnen mogelijk. Alles bij elkaar toont dit werk de veelzijdigheid van open database-zoektechnieken voor de identificatie van bacteriële glycosylatie, waardoor de karakterisering van deze zeer diverse glycoproteïnen eenvoudiger dan ooit tevoren is.

Om het nut van open zoeken naar bacteriële glycopeptide-analyse te illustreren, werd de chemische diversiteit van O-gebonden glycanen binnen drie stammen van A. baumannii-AB307-0294, ACICU en D1279779-beoordeeld. De O-gebonden glycoproteïnen zijn zeer variabel tussen A. baumannii-stammen, omdat de glycanen die worden gebruikt voor glycosylering zijn afgeleid van de zeer variabele capsule loci 44,45,46.<sup class="xre...

Open zoeken maakt de identificatie van glycopeptiden versierd met voorheen onbekende glycaansamenstellingen mogelijk. In dit artikel wordt een gestroomlijnde aanpak voor het uitvoeren van open zoekopdrachten en daaropvolgende glycaangerichte glycopeptide-zoekopdrachten gepresenteerd voor bacteriële monsters met behulp van Acinetobacter baumannii als model.

De toepassing van open zoekgebaseerde benaderingen voor de identificatie van Acinetobacter baumannii O-gebonden glycopeptiden

Protein glycosylation is increasingly recognized as a common modification within bacterial organisms, contributing to prokaryotic physiology and optimal ...

Dit protocol stroomlijnt de identificatie van bacteriële glycop%eptides, waardoor onderzoekers nieuwe glycosylatiegebeurtenissen kunnen identificeren, evenals de verschillen in de glycanen die worden gebruikt voor glycosylering tussen stammen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het niet-glycosylatie-experts in staat stelt om potentiële glycosylatiegebeurtenissen in bacteriële proteoommonsters te identificeren. Open zoeken is een algemeen toepasbare benadering die kan worden gebruikt voor de identificatie van een reeks modificaties, niet alleen glycosylatie, en kan worden toegepast op elk proteoommonster.Om STB-RPS stop-and-go extractietips te bereiden, gebruikt u een 14-gauge stompe naald om drie STB-RPS-schijven uit een STB-RPS-membraan van 47 vierkante millimeter te verwijderen voor het binden van 50 microgram peptide. Voor grotere hoeveelheden peptiden, verhoog het aantal schijven dienovereenkomstig. Voordat u de SDB-RPS-fasetips gebruikt, wast u de tips door 150 microliter 100% acetonitril toe te voegen en de buffer te laten draaien door centrifugeren of voorzichtig druk uit te oefenen met een spuit.Was vervolgens de uiteinden met 150 microliter 30% methanol met 1% TFA en breng de uiteinden vervolgens in evenwicht met 150 microliter 90% isopropanol met 1% TFA. Na equilibratie laadt u de proteoommonsters op de STB-RPS-fasepunten door centrifugeren of met behulp van een spuit. Was vervolgens de uiteinden met 150 microliter 90% isopropanol met 1% TFA gevolgd door 150 microliter 1% TFA.Om de peptiden uit de STB-RPS-fasetips te elueren, gebruikt u 150 microliter 5% ammoniumhydroxide en 80% acetonitril toegevoegd aan een enkele punt en verzamelt u de geëlueerde monsters in afzonderlijke buizen door voorzichtig druk uit te oefenen met behulp van een spuit. Als alternatief, als eluting via centrifugeren, gebruik dan 150 microliter bij 5% ammoniumhydroxide in 80% acetonitril toegevoegd aan alle fasepunten en verzamel in een schone plaat. Droog de geëlueerde peptiden door vacuümcentrifugeren bij 25 graden Celsius.Om vervolgens de glycopeptidemonsters te verrijken, bereidt u een zwitterionische hydrofiele interactievloeistofchromatografie of ZIC-HILIC, fasetips voor. Verwijder een C8-schijf uit een C8-membraan van 470 vierkante millimeter met behulp van een stompe naald van 14 gauge en verpak de schijf in een P-200-punt om een frit te maken. Voeg vervolgens ongeveer vijf millimeter ZIC-HILIC-materiaal, geresuspendeerd in 50% acetonitril, toe aan de friet door voorzichtig druk uit te oefenen met behulp van een spuit.Voordat u de uiteinden gebruikt, moet u de hars in evenwicht brengen met 20 bedvolumes ZIC-HILIC-elutiebuffer, waarbij u 10 microliter volume boven de hars laat om ervoor te zorgen dat de hars niet droog wordt. Was vervolgens de hars achtereenvolgens met 20 bedvolumes ZIC-HILIC-voorbereidingsbuffer gevolgd door 20 bedvolumes ZIC-HILIC-laad- of wasbuffer. Resuspendeer vervolgens de verteerde en gedroogde peptiden in de ZIC-HILIC-laadbuffer tot een eindconcentratie van vier microgram per microliter.Vortex kort gedurende één minuut om ervoor te zorgen dat de monsters opnieuw worden gespuspendeerd en draai ze vervolgens gedurende één minuut op 2000 keer G en 25 graden Celsius. Na het draaien laadt u het geresuspendeerde peptidemonster op de geconditioneerde ZIC-HILIC-kolom en wast u de kolom driemaal met 20 bedvolumes van de ZIC-HILIC-laadbuffer door voorzichtig druk uit te oefenen met een spuit. Elueer ten slotte de glycopeptiden met 20 bedvolumes van de ZIC-HILIC-elutiebuffer in een buis van 1,5 milliliter door voorzichtig druk uit te oefenen met een spuit en droog het eluent vervolgens door vacuümcentrifugatie bij 25 graden Celsius.Voor LC-MS-analyse resuspendeert u de monsters in Buffer A* tot een eindconcentratie van één microgram per microliter en laadt u de monsters vervolgens op een HPLC-UPLC gekoppeld aan een MS om de scheiding en identificatie van glycopeptiden mogelijk te maken. Bewaak de resulterende MS-gegevensverzameling en zorg ervoor dat de gegevens worden verzameld met de gewenste parameters. Om de met proteoom en glycopeptide verrijkte monsters te analyseren, opent u FragPipe en klikt u op het tabblad Workflow.Selecteer in het vervolgkeuzemenu Workflow de optie Zoekopdracht openen en klik op Bestanden toevoegen om de gegevensbestanden te importeren die moeten worden doorzocht in FragPipe. Klik vervolgens op het tabblad Database gevolgd door Downloaden om de downloadmanager te starten voor het downloaden van proteoomdatabases van UniProt met behulp van een UniProt-toetredingsnummer. Klik in de downloadmanager op de optie Lokmiddelen en verontreinigingen toevoegen om lok- en verontreinigingseiwitten in deze database op te nemen.Klik vervolgens op het tabblad MSFragger en verhoog vervolgens in het vak Peak Matching de precursormassatolerantie van de standaard 500 dalton naar 2.000 dalton om grote wijzigingen te identificeren. Klik op het tabblad Uitvoeren om de locatie van de uitgangen van FragPipe te definiëren en klik vervolgens op de knop Uitvoeren om het zoeken te starten. Met hoog-betrouwbaarheid glycopeptiden toegewezen, identificeer vaak waargenomen glycaan-geassocieerde ionen om de identificatie van glycopeptiden te verbeteren.Klik vervolgens op het tabblad MSFragger en voeg de vastgestelde deltamassa's van de waargenomen glycanen toe aan de secties Variabele wijzigingen en Massaverschuivingen met individuele massa's gescheiden met een schuine streep. Voeg vervolgens de glycaan-geassocieerde fragmentmassa's van deze glycanen toe aan de glyco / labiele mods-sectie van MSFragger. Upload ten slotte alle MS-gegevens die verband houden met proteomische studies naar gecentraliseerde proteomische repositories, zoals de PRIDE- of MassIVE-repositories.Open zoektocht van de Acinetobacter baumannii stam AB307-0294 onthulde twee dominante deltamassa's die overeenkomen met 648,25 en 692,28 dalton. Van de ACICU-capsule is bekend dat deze bestaat uit een tetrasaccharide K-eenheid die overeenkomt met een voorspelde massa van 843,31 dalton. Deze capsulestructuur is consistent met de meest waargenomen deltamassa binnen de ACICU.Open zoekanalyse van de stam D1279779 onthulde de aanwezigheid van meerdere deltamassa's in overeenstemming met 203,08, 794,31 en 1588,62 dalton. Met behulp van de interactieve peptide spectrale annotator werden glycopeptiden geïdentificeerd over drie A.baumannii-stammen beoordeeld die potentiële glycaan-geassocieerde ionen onthulden. Glycan-gerichte zoekopdrachten leidden tot een opmerkelijke toename van het totale aantal glycopeptide / peptide spectrale matches geïdentificeerd in alle drie de A.baumannii-stammen, wat overeenkomt met een toename van 37% in ACICU, een toename van 117% in AB307-0294 en een toename van 363% in D1279779.Voor individuele MS-voorvallen verhoogt de opname van glycaanspecifieke informatie doorgaans de waargenomen Hyperscore, hoewel deze toename sterk glycaanafhankelijk is. Zorg er bij ZIC-HILIC-verrijking voor dat de hars altijd nat blijft, omdat verlies van oplosmiddel de isolatie van glycopeptiden in gevaar kan brengen. Gegevens over verschillen in glycosylatie kunnen worden gebruikt om mutagenesestudies te informeren of genklassen te identificeren die verantwoordelijk zijn voor glycaanbiosynthese.Met behulp van open database zoeken, zijn we begonnen met het karakteriseren van glycaan diversiteit in bacteriële geslachten. Dit heeft aangetoond dat bacteriële glycosylatie zowel vaker voorkomt als veel diverser is dan we ooit dachten.

the-application-open-searching-based-approaches-for-identification

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

We hebben onlangs melding gemaakt van een nieuwe benadering voor het genereren van fluorogene DNAzyme probes die kan worden toegepast op het opzetten van een eenvoudige, "mix-and-lezen" TL-test voor bacteriële detectie. Deze speciale DNA probes katalyseren de splitsing van een chromofoor gemodificeerde DNA-RNA chimère substraat in aanwezigheid van ruwe extracellulaire mengsel (CEM) door een bepaald bacterie, waardoor vertaling bacteriële detectie in fluorescentiesignaal generatie. In dit...

Detectie van bacteriën met behulp van fluorogene DNAzymes

We beschrijven een elektrochemische sensor bepalingsmethode voor snelle bacteriële detectie en identificatie. De bepaling omvat een sensor-array gefunctionaliseerd met DNA oligonucleotide capture probes voor ribosomaal RNA (rRNA) species-specifieke sequenties. Sandwich hybridisatie van doelwit rRNA met de invangingsprobe en een mierikswortel peroxidase-linked DNA-oligonucleotide probe detector produceert een meetbare amperometrisch stroom.

Bacteriële Detection &amp; Identification gebruiken elektrochemische sensoren

Matrix-ondersteunde laserdesorptie/ionisatie tijd-van-vlucht massaspectrometrie (MALDI-TOF MS) en moleculaire technieken (16S rRNA gen sequencing) maken de identificatie van zeldzame bacteriële pathogenen in routine diagnostische mogelijkheden. Het doel van dit protocol ligt in de combinatie van beide technieken, wat leidt tot meer nauwkeurige en betrouwbare gegevens.

Identificatie van bijzondere bacteriële pathogenen door 16S rRNA Gene Sequencing en MALDI-TOF MS

IDBac is een open-source massaspectrometrie gebaseerde bioinformatica pijpleiding die gegevens van zowel intact eiwit en gespecialiseerde metaboliet spectra, verzameld op celmateriaal geschuurd uit bacteriële kolonies integreert. De pijpleiding stelt onderzoekers in staat om snel honderden tot duizenden bacteriële kolonies in putatieve taxonomische groepen te organiseren en ze verder te differentiëren op basis van gespecialiseerde metaboliet productie.

Met behulp van de open-source MALDI TOF-MS IDBac pijpleiding voor analyse van microbiële eiwitten en gespecialiseerde metaboliet gegevens

Gram-negatieve bacteriën produceren twee ruimtelijk gescheiden membranen. Het buitenste membraan wordt van het binnenste membraan verdeeld door een periplasma en een peptidoglycanlaag. Het vermogen om de dubbele tweelagen van deze microben te isoleren is van cruciaal belang geweest voor het begrijpen van hun fysiologie en pathogenese.

Scheiding van de celenvelop voor gramnegatieve bacteriën in binnen- en buitenste membraanfracties met technische aanpassingen voor Acinetobacter baumannii

Dit protocol omvat een gedetailleerde analyse van de peptidoglycaansamenstelling met behulp van vloeistofchromatografie massaspectrometrie in combinatie met geavanceerde functie-extractie en bio-informatica-analysesoftware.

Semi-kwantitatieve analyse van peptidoglycaan door vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en bio-informatica

Hier presenteren we een protocol voor de snelle identificatie van eiwitten geproduceerd door genomisch gesequencede pathogene bacteriën met behulp van MALDI-TOF-TOF tandem massaspectrometrie en top-down proteomische analyse met in eigen huis ontwikkelde software. Metastabieuze eiwitionen fragmenteren vanwege het asparaginezuureffect en deze specificiteit wordt gebruikt voor eiwitidentificatie.

Identificatie van antibacteriële immuniteitseiwitten in Escherichia coli met behulp van MALDI-TOF-TOF-MS/MS en top-down proteomische analyse

EUCAST heeft een protocol voor directe antimicrobiële gevoeligheidstests (AST) ontwikkeld voor geautomatiseerde bloedculturen. De afhankelijkheid van op massaspectrometrie gebaseerde microbiële identificatie kan echter worden vermeden door gebruik te maken van een direct protocol voor de bereiding van inoculum in een geautomatiseerd microbieel identificatiesysteem. Deze aanpak kan AST-rapporten opleveren binnen 24 uur na monsterafname.

Directe microbiële identificatie met behulp van een geautomatiseerd microbieel identificatiesysteem om de EUCAST RAST-methode zonder massaspectrometrie te vergemakkelijken

Om de snelle en nauwkeurige detectie van Acinetobacter baumannii te vergemakkelijken, presenteren we een protocol dat gebruik maakt van Recombinase Polymerase Amplification (RPA) in combinatie met LbaCas12a-endonuclease voor het identificeren van A. baumannii-infecties .

Snelle en specifieke detectie van Acinetobacter baumannii-infecties met behulp van een op recombinasepolymeraseamplificatie/Cas12a gebaseerd systeem

We stellen een protocol voor om vetzuren te identificeren zonder dat ze hoeven te worden gezuiverd. Het combineert informatie over de retentietijd met de massaspectra van drie soorten vetzuurderivaten: vetzuurmethylesters (FAME's), 4,4-dimethyloxazolinederivaten (DMOX) en 3-pyridylcarbinylester (picolinyl).

Identificatie van vetzuren in<em&gt; Bacillus cereus</em

Leer hoe u open zoekmethoden toepast voor de identificatie van O-gebonden glycopeptiden in Acinetobacter baumannii. Dit protocol maakt glycopeptide-identificatie toegankelijk voor onderzoekers zonder glycosyleringsexpertise.

De toepassing van open zoekgebaseerde benaderingen voor de identificatie van Acinetobacter baumannii O-gebonden glycopeptiden

Meer video's verkennen