De toepassing van open zoekgebaseerde benaderingen voor de identificatie van Acinetobacter baumannii O-gebonden glycopeptiden

Dit protocol stroomlijnt de identificatie van bacteriële glycop%eptides, waardoor onderzoekers nieuwe glycosylatiegebeurtenissen kunnen identificeren, evenals de verschillen in de glycanen die worden gebruikt voor glycosylering tussen stammen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het niet-glycosylatie-experts in staat stelt om potentiële glycosylatiegebeurtenissen in bacteriële proteoommonsters te identificeren. Open zoeken is een algemeen toepasbare benadering die kan worden gebruikt voor de identificatie van een reeks modificaties, niet alleen glycosylatie, en kan worden toegepast op elk proteoommonster.

Om STB-RPS stop-and-go extractietips te bereiden, gebruikt u een 14-gauge stompe naald om drie STB-RPS-schijven uit een STB-RPS-membraan van 47 vierkante millimeter te verwijderen voor het binden van 50 microgram peptide. Voor grotere hoeveelheden peptiden, verhoog het aantal schijven dienovereenkomstig. Voordat u de SDB-RPS-fasetips gebruikt, wast u de tips door 150 microliter 100% acetonitril toe te voegen en de buffer te laten draaien door centrifugeren of voorzichtig druk uit te oefenen met een spuit.

Was vervolgens de uiteinden met 150 microliter 30% methanol met 1% TFA en breng de uiteinden vervolgens in evenwicht met 150 microliter 90% isopropanol met 1% TFA. Na equilibratie laadt u de proteoommonsters op de STB-RPS-fasepunten door centrifugeren of met behulp van een spuit. Was vervolgens de uiteinden met 150 microliter 90% isopropanol met 1% TFA gevolgd door 150 microliter 1% TFA.

Om de peptiden uit de STB-RPS-fasetips te elueren, gebruikt u 150 microliter 5% ammoniumhydroxide en 80% acetonitril toegevoegd aan een enkele punt en verzamelt u de geëlueerde monsters in afzonderlijke buizen door voorzichtig druk uit te oefenen met behulp van een spuit. Als alternatief, als eluting via centrifugeren, gebruik dan 150 microliter bij 5% ammoniumhydroxide in 80% acetonitril toegevoegd aan alle fasepunten en verzamel in een schone plaat. Droog de geëlueerde peptiden door vacuümcentrifugeren bij 25 graden Celsius.

Om vervolgens de glycopeptidemonsters te verrijken, bereidt u een zwitterionische hydrofiele interactievloeistofchromatografie of ZIC-HILIC, fasetips voor. Verwijder een C8-schijf uit een C8-membraan van 470 vierkante millimeter met behulp van een stompe naald van 14 gauge en verpak de schijf in een P-200-punt om een frit te maken. Voeg vervolgens ongeveer vijf millimeter ZIC-HILIC-materiaal, geresuspendeerd in 50% acetonitril, toe aan de friet door voorzichtig druk uit te oefenen met behulp van een spuit.

Voordat u de uiteinden gebruikt, moet u de hars in evenwicht brengen met 20 bedvolumes ZIC-HILIC-elutiebuffer, waarbij u 10 microliter volume boven de hars laat om ervoor te zorgen dat de hars niet droog wordt. Was vervolgens de hars achtereenvolgens met 20 bedvolumes ZIC-HILIC-voorbereidingsbuffer gevolgd door 20 bedvolumes ZIC-HILIC-laad- of wasbuffer. Resuspendeer vervolgens de verteerde en gedroogde peptiden in de ZIC-HILIC-laadbuffer tot een eindconcentratie van vier microgram per microliter.

Vortex kort gedurende één minuut om ervoor te zorgen dat de monsters opnieuw worden gespuspendeerd en draai ze vervolgens gedurende één minuut op 2000 keer G en 25 graden Celsius. Na het draaien laadt u het geresuspendeerde peptidemonster op de geconditioneerde ZIC-HILIC-kolom en wast u de kolom driemaal met 20 bedvolumes van de ZIC-HILIC-laadbuffer door voorzichtig druk uit te oefenen met een spuit. Elueer ten slotte de glycopeptiden met 20 bedvolumes van de ZIC-HILIC-elutiebuffer in een buis van 1,5 milliliter door voorzichtig druk uit te oefenen met een spuit en droog het eluent vervolgens door vacuümcentrifugatie bij 25 graden Celsius.

Voor LC-MS-analyse resuspendeert u de monsters in Buffer A* tot een eindconcentratie van één microgram per microliter en laadt u de monsters vervolgens op een HPLC-UPLC gekoppeld aan een MS om de scheiding en identificatie van glycopeptiden mogelijk te maken. Bewaak de resulterende MS-gegevensverzameling en zorg ervoor dat de gegevens worden verzameld met de gewenste parameters. Om de met proteoom en glycopeptide verrijkte monsters te analyseren, opent u FragPipe en klikt u op het tabblad Workflow.

Selecteer in het vervolgkeuzemenu Workflow de optie Zoekopdracht openen en klik op Bestanden toevoegen om de gegevensbestanden te importeren die moeten worden doorzocht in FragPipe. Klik vervolgens op het tabblad Database gevolgd door Downloaden om de downloadmanager te starten voor het downloaden van proteoomdatabases van UniProt met behulp van een UniProt-toetredingsnummer. Klik in de downloadmanager op de optie Lokmiddelen en verontreinigingen toevoegen om lok- en verontreinigingseiwitten in deze database op te nemen.

Klik vervolgens op het tabblad MSFragger en verhoog vervolgens in het vak Peak Matching de precursormassatolerantie van de standaard 500 dalton naar 2.000 dalton om grote wijzigingen te identificeren. Klik op het tabblad Uitvoeren om de locatie van de uitgangen van FragPipe te definiëren en klik vervolgens op de knop Uitvoeren om het zoeken te starten. Met hoog-betrouwbaarheid glycopeptiden toegewezen, identificeer vaak waargenomen glycaan-geassocieerde ionen om de identificatie van glycopeptiden te verbeteren.

Klik vervolgens op het tabblad MSFragger en voeg de vastgestelde deltamassa's van de waargenomen glycanen toe aan de secties Variabele wijzigingen en Massaverschuivingen met individuele massa's gescheiden met een schuine streep. Voeg vervolgens de glycaan-geassocieerde fragmentmassa's van deze glycanen toe aan de glyco / labiele mods-sectie van MSFragger. Upload ten slotte alle MS-gegevens die verband houden met proteomische studies naar gecentraliseerde proteomische repositories, zoals de PRIDE- of MassIVE-repositories.

Open zoektocht van de Acinetobacter baumannii stam AB307-0294 onthulde twee dominante deltamassa's die overeenkomen met 648,25 en 692,28 dalton. Van de ACICU-capsule is bekend dat deze bestaat uit een tetrasaccharide K-eenheid die overeenkomt met een voorspelde massa van 843,31 dalton. Deze capsulestructuur is consistent met de meest waargenomen deltamassa binnen de ACICU.

Open zoekanalyse van de stam D1279779 onthulde de aanwezigheid van meerdere deltamassa's in overeenstemming met 203,08, 794,31 en 1588,62 dalton. Met behulp van de interactieve peptide spectrale annotator werden glycopeptiden geïdentificeerd over drie A.baumannii-stammen beoordeeld die potentiële glycaan-geassocieerde ionen onthulden. Glycan-gerichte zoekopdrachten leidden tot een opmerkelijke toename van het totale aantal glycopeptide / peptide spectrale matches geïdentificeerd in alle drie de A.baumannii-stammen, wat overeenkomt met een toename van 37% in ACICU, een toename van 117% in AB307-0294 en een toename van 363% in D1279779.

Voor individuele MS-voorvallen verhoogt de opname van glycaanspecifieke informatie doorgaans de waargenomen Hyperscore, hoewel deze toename sterk glycaanafhankelijk is. Zorg er bij ZIC-HILIC-verrijking voor dat de hars altijd nat blijft, omdat verlies van oplosmiddel de isolatie van glycopeptiden in gevaar kan brengen. Gegevens over verschillen in glycosylatie kunnen worden gebruikt om mutagenesestudies te informeren of genklassen te identificeren die verantwoordelijk zijn voor glycaanbiosynthese.

Met behulp van open database zoeken, zijn we begonnen met het karakteriseren van glycaan diversiteit in bacteriële geslachten. Dit heeft aangetoond dat bacteriële glycosylatie zowel vaker voorkomt als veel diverser is dan we ooit dachten.