Name: Modellering Paracriene Niet-canonische Wnt Signalering In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Leer een reproduceerbare methode om paracriene niet-canonische Wnt-signalering in vitro te evalueren met C2C12-myoblasten en O9-1-neurale kamcellen. Deze techniek maakt functionele en moleculaire analyses van Wnt5a-signalering mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door NIH-awards F30HL154324 aan O.T. en K08HL121191 en R03HL154301 aan S.R.K. De auteurs willen graag erkennen dat het schema in figuur 1 in dit manuscript is gemaakt met biorender.com.

<ol><li>Ho, H. Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt5a-Ror-Dishevelled+signaling+constitutes+a+core+developmental+pathway+that+controls+tissue+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Wnt5a-Ror-Dishevelled signaling constitutes a core developmental pathway that controls tissue morphogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (11), 4044-4051 (2012).</li>
<li>Čapek, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-activated+Frizzled7+reveals+a+permissive+role+of+noncanonical+wnt+signaling+in+mesendoderm+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Light-activated Frizzled7 reveals a permissive role of noncanonical wnt signaling in mesendoderm cell migration.</a> Elife. (8), 42093(2019).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+cell+polarity+signaling+regulates+polarized+second+heart+field+morphogenesis+to+promote+both+arterial+and+venous+pole+septation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Planar cell polarity signaling regulates polarized second heart field morphogenesis to promote both arterial and venous pole septation.</a> Development. 146 (20), 181719(2019).</li>
<li>Lutze, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncanonical+WNT-signaling+controls+differentiation+of+lymphatics+and+extension+lymphangiogenesis+via+RAC+and+JNK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Noncanonical WNT-signaling controls differentiation of lymphatics and extension lymphangiogenesis via RAC and JNK signaling.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4739(2019).</li>
<li>Buttler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maldevelopment+of+dermal+lymphatics+in+Wnt5a-knockout-mice%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Maldevelopment of dermal lymphatics in Wnt5a-knockout-mice.</a> Developmental Biology. 381 (2), 365-376 (2013).</li>
<li>Betterman, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atypical+cadherin+FAT4+orchestrates+lymphatic+endothelial+cell+polarity+in+response+to+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Atypical cadherin FAT4 orchestrates lymphatic endothelial cell polarity in response to flow.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (6), 3315-3328 (2020).</li>
<li>Descamps, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frizzled+4+regulates+arterial+network+organization+through+noncanonical+Wnt%2Fplanar+cell+polarity+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Frizzled 4 regulates arterial network organization through noncanonical Wnt/planar cell polarity signaling.</a> Circulation Research. 110 (1), 47-58 (2012).</li>
<li>Weeraratna, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt5a+signaling+directly+affects+cell+motility+and+invasion+of+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt5a signaling directly affects cell motility and invasion of metastatic melanoma.</a> Cancer Cell. 1 (3), 279-288 (2002).</li>
<li>Henry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+novel+Wnt+receptor+ROR2+is+increased+in+breast+cancer+and+may+regulate+both+%CE%B2-catenin+dependent+and+independent+Wnt+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer+Research+and+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Expression of the novel Wnt receptor ROR2 is increased in breast cancer and may regulate both β-catenin dependent and independent Wnt signalling.</a> Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 141 (2), 243-254 (2014).</li>
<li>Anastas, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protein+complex+of+SCRIB%2C+NOS1AP+and+VANGL1+regulates+cell+polarity+and+migration%2C+and+is+associated+with+breast+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">A protein complex of SCRIB, NOS1AP and VANGL1 regulates cell polarity and migration, and is associated with breast cancer progression.</a> Oncogene. 31 (32), 3696-3708 (2012).</li>
<li>Niehrs, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+world+of+WNT+receptor+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The complex world of WNT receptor signalling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (12), 767-779 (2012).</li>
<li>Dong, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+redundancy+of+frizzled+3+and+frizzled+6+in+planar+cell+polarity+control+of+mouse+hair+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Functional redundancy of frizzled 3 and frizzled 6 in planar cell polarity control of mouse hair follicles.</a> Development. 145 (19), (2018).</li>
<li>Bernascone, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sfrp3+modulates+stromal-epithelial+crosstalk+during+mammary+gland+development+by+regulating+Wnt+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Sfrp3 modulates stromal-epithelial crosstalk during mammary gland development by regulating Wnt levels.</a> Nature Communications. 10 (1), 2481(2019).</li>
<li>Hendrickx, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WNT16+requires+G%CE%B1+subunits+as+intracellular+partners+for+both+its+canonical+and+noncanonical+WNT+signalling+activity+in+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+International%22%5BJournal%5D)">WNT16 requires Gα subunits as intracellular partners for both its canonical and noncanonical WNT signalling activity in osteoblasts.</a> Calcified Tissue International. 106 (3), 294-302 (2020).</li>
<li>Avgustinova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+cell-derived+Wnt7a+recruits+and+activates+fibroblasts+to+promote+tumour+aggressiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Tumour cell-derived Wnt7a recruits and activates fibroblasts to promote tumour aggressiveness.</a> Nature Communications. (7), 10305(2016).</li>
<li>Tseng, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAPE+suppresses+migration+and+invasion+of+prostate+cancer+cells+via+activation+of+noncanonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">CAPE suppresses migration and invasion of prostate cancer cells via activation of noncanonical Wnt signaling.</a> Oncotarget. 7 (25), 38010-38024 (2016).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+Wnt%2FCa2%2B+signaling+in+actin+cytoskeleton+remodeling+and+cell+motility+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A novel role for Wnt/Ca2+ signaling in actin cytoskeleton remodeling and cell motility in prostate cancer.</a> PLoS One. 5 (5), 10456(2010).</li>
<li>Gibbs, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prickle1+mutation+causes+planar+cell+polarity+and+directional+cell+migration+defects+associated+with+cardiac+outflow+tract+anomalies+and+other+structural+birth+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Prickle1 mutation causes planar cell polarity and directional cell migration defects associated with cardiac outflow tract anomalies and other structural birth defects.</a> Biology Open. 5 (3), 323-335 (2016).</li>
<li>Cui, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+PCP+protein+required+for+ciliogenesis%2C+regulates+directional+cell+migration+and+cell+polarity+by+direct+modulation+of+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">a PCP protein required for ciliogenesis, regulates directional cell migration and cell polarity by direct modulation of the actin cytoskeleton.</a> PLoS Biology. 11 (11), 1001720(2013).</li>
<li>Gombos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formin+DAAM+functions+as+molecular+effector+of+the+planar+cell+polarity+pathway+during+axonal+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The formin DAAM functions as molecular effector of the planar cell polarity pathway during axonal development in Drosophila.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (28), 10154-10167 (2015).</li>
<li>Toubat, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+Crest+Cell-derived+Wnt5a+Regulates+Planar+Cell+Polarity+in+Cranial+Second+Heart+Field+Progenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Neural Crest Cell-derived Wnt5a Regulates Planar Cell Polarity in Cranial Second Heart Field Progenitor Cells.</a> Circulation. 142, Suppl_3 12540(2020).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+regulation+of+cell+cohesion+by+Wnt5a+during+second+heart+field+progenitor+deployment%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Spatial regulation of cell cohesion by Wnt5a during second heart field progenitor deployment.</a> Developmental Biology. 412 (1), 18-31 (2016).</li>
<li>Sinha, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Wnt5a+disrupts+second+heart+field+cell+deployment+and+may+contribute+to+OFT+malformations+in+DiGeorge+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Loss of Wnt5a disrupts second heart field cell deployment and may contribute to OFT malformations in DiGeorge syndrome.</a> Human Molecular Genetics. 24 (6), 1704-1716 (2015).</li>
<li>Humphries, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+instruction+to+output%3A+Wnt%2FPCP+signaling+in+development+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">From instruction to output: Wnt/PCP signaling in development and cancer.</a> Current Opinion in Cell Biology. (51), 110-116 (2018).</li>
<li>Shi, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+Dishevelled-Mediated+Wnt+Signaling+in+Vertebrate+Early+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Decoding Dishevelled-Mediated Wnt Signaling in Vertebrate Early Development.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. (8), 588370(2020).</li>
<li>Butler, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+cell+polarity+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Planar cell polarity in development and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 375-388 (2017).</li>
<li>Bradshaw, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+role+for+neural+crest+cells+during+outflow+tract+septation+in+the+neural+crest-deficient+mutant+Splotch2H%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Dual role for neural crest cells during outflow tract septation in the neural crest-deficient mutant Splotch2H.</a> Journal of Anatomy. 214 (2), 245-257 (2009).</li>
<li>Kodo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Sema3c+and+the+interaction+between+cardiac+neural+crest+and+second+heart+field+during+outflow+tract+development%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Regulation of Sema3c and the interaction between cardiac neural crest and second heart field during outflow tract development.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6771(2017).</li>
<li>Waldo, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+neural+crest+is+necessary+for+normal+addition+of+the+myocardium+to+the+arterial+pole+from+the+secondary+heart+field%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cardiac neural crest is necessary for normal addition of the myocardium to the arterial pole from the secondary heart field.</a> Developmental Biology. 281 (1), 66-77 (2005).</li>
<li>Schleiffarth, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt5a+is+required+for+cardiac+outflow+tract+septation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Wnt5a is required for cardiac outflow tract septation in mice.</a> Pediatric Research. 61 (4), 386-391 (2007).</li>
<li>Nguyen, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+and+Manipulation+of+O9-1+Neural+Crest+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e58346(2018).</li>
<li>Suarez-Arnedo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+image+J+plugin+for+the+high+throughput+image+analysis+of+in+vitro+scratch+wound+healing+assays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays.</a> PLoS One. 15 (7), 0232565(2020).</li>
<li>Martinotti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scratch+wound+healing+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Scratch wound healing assay.</a> Methods in Molecular Biology. (2109), 225-229 (2020).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat het onderzoek is uitgevoerd bij afwezigheid van commerciële of financiële relaties die kunnen worden opgevat als een potentieel belangenconflict.

De niet-canonische Wnt/planaire celpolariteit (PCP) signaleringsroute is een uiterst belangrijke cellulaire signaleringsroute die betrokken is bij meervoudige ontwikkelingsprocessen24,25 en ziekteprocessen24,26. Tijdens de embryonale ontwikkeling omvat niet-canonische Wnt-signalering een uitgebreid netwerk van moleculaire signalen van signaalzendende cellen die uiteindelijk veranderingen in morfo...

Niet-canonische Wnt-signalering is een evolutionair geconserveerde route die de organisatie van cellulair filament en directionele migratie reguleert. Deze route is betrokken bij meerdere biologische processen, waaronder embryonale weefselmorfogenese 1,2,3, lymfatische en vasculaire angiogenese 4,5,6,7, en kankergroei en metastase 8,9,10 . Op cellulair niveau wordt niet-canonische Wnt-signalering uitgevoerd door gecoördineerde paracriene interacties tussen signaal-zendende en signaal-ontvangende cellen. Deze interacties komen vaak voor tussen cellen van verschillende afstammingslijnen of typen en omvatten een divers moleculair netwerk dat tot 19 liganden en meerdere receptoren, co-receptoren en downstream signaaltransductie-effectoren omvat11. Om dit signaleringsproces verder te compliceren, hebben eerdere studies aangetoond dat ligand-receptorcombinaties op een context- en weefselafhankelijke manier kunnen variëren12,13, en dat dezelfde bronliganden die niet-canonische Wnt-signalering in signaal-ontvangende cellen aandrijven, kunnen worden geproduceerd door meerdere signaalzendende celtypen14,15 . Gezien de cellulaire en moleculaire complexiteit geassocieerd met niet-canonische Wnt-signalering, is het vermogen om individuele en klinisch relevante mechanismen in vivo te bestuderen beperkt.
Er zijn pogingen gedaan om niet-canonische Wnt-signalering te bestuderen met behulp van celkweektechnieken in vitro. Wondgenezingstests uitgevoerd in cellulaire monolagen zijn bijvoorbeeld gebruikt om cellulaire directionele migratie functioneel te beoordelen 4,16,17,18,19. Immunostaining-technieken zijn gebruikt om ruimtelijke analyses van oppervlakte-eiwitexpressie uit te voeren om niet-canonische Wnt-geïnduceerde veranderingen in cellulaire morfologie 7,10, architectuur en asymmetrische polarisatie 18,19,20 te evalueren. Hoewel deze benaderingen belangrijke hulpmiddelen hebben geboden voor het karakteriseren van Wnt-gerelateerde fenotypen in signaalontvangstcellen, beperkt het gebrek aan signaalzendende componenten in deze protocollen hun vermogen om paracriene signaleringsmechanismen die in vivo worden waargenomen nauwkeurig te modelleren. Als gevolg hiervan blijft er een kritieke behoefte om in vitro systemen te ontwikkelen die een robuuste en reproduceerbare evaluatie van paracriene signaleringsinteracties tussen signaal-verzendende en ontvangende cellen van de niet-canonische Wnt-route mogelijk maken, met name die van verschillende celtypen.
Hiertoe was het primaire doel van deze studie het opstellen van een protocol om paracriene niet-canonische Wnt-signaleringsinteracties in vitro te modelleren. We ontwikkelden een contactloos cocultuursysteem dat signaalzendende en signaalontvangstcomponenten van deze interacties samenvat en het gebruik van standaard moleculaire, genetische of farmacologische benaderingen mogelijk maakt om onafhankelijk specifieke ligandreceptormechanismen in de niet-canonische Wnt-route te bestuderen. Mechanismen van NCC-gemedieerde Wnt-signalering werden onderzocht in myoblasten met behulp van gevestigde muizencellijnen. Als bewijs van het principe werd dit model gebruikt om bevindingen van eerdere in vivo studies bij muizen te bevestigen die de Wnt5a-ROR2-as impliceren als een relevante niet-canonieke Wnt-signaleringsroute tussen NCC's21 en SHF cardiomyoblastvoorlopers 3,22,23.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M-7522</td><td></td></tr><tr><td>Antifade mounting medium with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200-10</td><td>Opgeslagen bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2323</td><td>Opgeslagen bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>C2C12 murine myoblast cell line</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture flasks, 75 cm2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>Chamber Slide System, 4-well</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>154526</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Modified Eagle&rsquo;s Medium (DMEM), high glucose (4.5 g/L), L-glutamine (2 mM)</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td>Opgeslagen bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Falcon conical centrifuge tubes, 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Falcon permeable support for 24-well plate with 0.4 &micro;M transparent PET membrane</td><td>Corning</td><td>353095</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Fisher Scientific</td><td>W3381E</td><td>Opgeslagen in 50 mL aliquoten bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Gelatin solution, 0.1%</td><td>ATCC</td><td>PCS-999-027</td><td>Opgeslagen bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Graduated and sterile pipette tips, 10 &micro;L</td><td>USA Scientific</td><td>1111-3810</td><td></td></tr><tr><td>Leukemia inhibitory factor (LIF), 106 unit/mL</td><td>Millipore Sigma</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine 200 mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13778-075</td><td></td></tr><tr><td>MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100x</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Minimum essential medium (MEM)</td><td>Corning</td><td>10-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>Mitomycin C</td><td>Roche</td><td>10107409001</td><td></td></tr><tr><td>Non-stick auto-glass coverslips, 24 x 55 mm</td><td>Springside Scientific</td><td>HRTCG2455</td><td></td></tr><tr><td>O9-1 neural crest cell line</td><td>Millipore Sigma</td><td>SCC049</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I, 1x</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde solution in PBS, 4%</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281692</td><td>Opgeslagen bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL penicillin and 10,000 &mu;g/mL streptomycin)</td><td>Fisher Scientific</td><td>W3470H</td><td>Opgeslagen in 10 mL aliquoten bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Phalloidin-iFluor 488</td><td>Abcam</td><td>ab176753</td><td>Opgeslagen bij -20 &deg;C, Uit de buurt van licht houden</td></tr><tr><td>Phosphate-buffer saline (PBS), 1x, without calcium and magnesium, pH 7.4</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td>Opgeslagen bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic)</td><td>R&amp;D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human/mouse Wnt5a protein</td><td>R&amp;D Systems</td><td>645-WN-010</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate, 100 mM</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Square Petri dish with grid</td><td>Thomas Scientific</td><td>1219C98</td><td></td></tr><tr><td>STO murine fibroblast feeder cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA, 0.25%</td><td>Fisher Scientific</td><td>W3513C</td><td>Opgeslagen bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Zeiss Apotome.2 fluorescence microscope</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss inverted Axio Vert.A1 light microscope</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zen lite 2012 microscopy software</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td>beeldvormingssoftware</td></tr></tbody></table>

modellering paracriene niet-canonische wnt signalering in vitro

Modeling Paracrine Noncanonical Wnt Signaling In Vitro

Niet-canonische Wnt-signalering reguleert de intracellulaire actinefilamentorganisatie en gepolariseerde migratie van voorlopercellen tijdens embryogenese. Dit proces vereist complexe en gecoördineerde paracriene interacties tussen signaal-zendende en signaal-ontvangende cellen. Aangezien deze interacties kunnen optreden tussen verschillende soorten cellen uit verschillende afstammingslijnen, kan in vivo evaluatie van celspecifieke defecten een uitdaging zijn. De huidige studie beschrijft een zeer reproduceerbare methode om paracriene niet-canonische Wnt-signalering in vitro te evalueren. Dit protocol is ontworpen met de mogelijkheid om (1) functionele en moleculaire beoordelingen uit te voeren van niet-canonische Wnt-signalering tussen twee celtypen van belang; (2) de rol van signaalzendende versus signaal-ontvangende moleculen in de niet-canonische Wnt-signaleringsroute te ontleden; en (3) fenotypische reddingsexperimenten uitvoeren met standaard moleculaire of farmacologische benaderingen.
Dit protocol werd gebruikt om neurale crest cell (NCC)-gemedieerde niet-canonische Wnt-signalering in myoblasten te evalueren. De aanwezigheid van NCC's is geassocieerd met een verhoogd aantal falloïdine-positieve cytoplasmatische filopodia en lamellipodie in myoblasten en verbeterde myoblastmigratie in een wondgenezingstest. De Wnt5a-ROR2-as werd geïdentificeerd als een cruciale niet-canonische Wnt-signaleringsroute tussen NCC en tweede hartveld (SHF) cardiomyoblastvoorlopers. Kortom, dit is een zeer handelbaar protocol om paracriene niet-canonische Wnt-signaleringsmechanismen in vitro te bestuderen.

Effecten van NCC's op de migratiecapaciteit van muizenmyoblasten Deze test werd voor het eerst toegepast om de impact van NCC's op de migratiecapaciteit van myoblasten te evalueren. Figuur 1 schetst het schematische model van de test. Om deze impact te testen, werden krastests uitgevoerd met myoblasten die geïsoleerd werden gekweekt (zonder NCC-inserts) in vergelijking met die gekweekt in de aanwezigheid van inserts. Als positieve controle werd 500 ng/ml recombinant Wnt5a...

De huidige studie schetst een zeer reproduceerbare en handelbare methode om paracriene niet-canonische Wnt-signaleringsgebeurtenissen in vitro te bestuderen. Dit protocol werd toegepast om de impact van paracriene Wnt5a-signalering in muizenneuraalcellen en myoblasten te evalueren.

Modellering Paracriene Niet-canonische Wnt Signalering In Vitro

Noncanonical Wnt signaling regulates intracellular actin filament organization and polarized migration of progenitor cells during embryogenesis. This ...

Dit protocol schetst een zeer reproduceerbare methode om paracriene niet-canonieke Wnt-signalering functioneel en moleculair te evalueren in elke celpopulatie van belang. Functionele en moleculaire beoordelingen worden uitgevoerd in dezelfde celpopulatie en kunnen worden toegepast om elk onderdeel van de Wnt / PCP-route te bestuderen. Om te beginnen resuspenseer je de eerder gepelletiseerde C2C12-cel in 10 milliliter C2C12-medium.Om de cellen te verdunnen in de verhouding van 1: 20, voegt u 0,5 milliliter celsuspensie toe in een buis van 15 milliliter met 9,5 milliliter vers C2C12-medium en mengt u voorzichtig met een serologische pipet met behulp van een P1000-pipet, voegt u een milliliter van de verdunde celsuspensie toe aan elke put van een nieuwe put met vier kamers en plaatst u deze in de incubator. Voor het platen van O9-1 celinzetstukken resuspenseert u de O9-1-celpellet in 10 milliliter O9-1-groeimedium. En vergelijkbaar met C2C12-celverdunning, verdun de O9-1-cellen in de verhouding van 1: 20.Plaats vervolgens een enkele permeabele insert in elke put van een nieuwe vierkamerige put gevuld met één milliliter O9-1 groeimedium. Voeg 300 microliter van de verdunde O9-1 celsuspensie toe aan elke insert en zorg ervoor dat de insert volledig wordt ondergedompeld. Incubeer vervolgens de put bij 37 graden Celsius.Om siRNA knockdown in de O9-1-cellen uit te voeren, verdunt u het siRNA en transfectiereagens in het gereduceerde serummedium volgens de aanbevelingen van de fabrikant in de gewenste concentraties. Meng voorzichtig het verdunde siRNA en transfectiereagens en incubeer het mengsel gedurende zeven minuten bij kamertemperatuur. Voeg na 18 tot 24 uur celplating de siRNA-lipidencomplexen toe aan de O9-1-celinzetstukken en incubeer gedurende ongeveer 34 tot 48 uur.Wanneer de cellen 70 tot 80% confluency bereiken, verwijdert u het medium goed uit de C2C12-kamer en wast u de cellen eenmaal met PBS. Nadat u de PBS hebt verwijderd, begint u de cellen te krassen door een steriele P10-pipetpunt stevig in één richting te plaatsen om de volledige lengte of breedte van de celmonolaag te overspannen. Zodra de cellen zijn bekrast, voegt u snel een milliliter PBS toe.Schakel vervolgens de computer en de microscoop in. Plaats de schuifkamer op het werkgebied en draai de objectiefknop naar 5x vergroting. Open de imaging software.Klik op het tabblad Camera en klik vervolgens op de knop Live om de cellen op het tabblad AxioCam IC te visualiseren. Zorg ervoor dat het lichtfilter helemaal naar buiten wordt getrokken om licht door te laten naar de camera en het computerscherm, beweeg of draai de kamerschuif handmatig om het wondgebied in het midden van het live beeld op het AxioCam IC-tabblad te plaatsen. Als u foto's wilt maken, klikt u op Uitlijnen om een nieuw tabblad te openen naast het tabblad AxioCam IC dat de afbeelding bevat.Om deze stilstaande afbeelding op te slaan, klikt u op het bestand, selecteert u Opslaan als, selecteert u bureaublad op de balk aan de linkerkant om het bestand op het bureaublad op te slaan, voert u de bestandsnaam in het bestandsnaamvak in en slaat u de figuur op in czi-bestandsindeling. Als u de afbeelding als tiff wilt opslaan, klikt u op bestand, selecteert u Opslaan als en voert u de bestandsnaam in het vak bestandsnaam in. Klik op de knop Opslaan als type en selecteer tiff in het vervolgkeuzemenu.Verplaats de kamerschuif handmatig om nog twee tot drie foto's te maken op andere punten van de wond in dezelfde put. Verwijder na beeldvorming de PBS uit elke put en voeg één milliliter C2C12-medium toe. Monteer het cocultuursysteem van de putinzet door de inzetstukken met de O9-1-cellen handmatig in elke put van de kamerput te plaatsen.Duw de inserts voorzichtig naar beneden in de put, zodat de onderkant van de insert net boven de onderliggende C2C12-cellen zit. Breng de putinzetconstructies terug naar de incubator en laat de cellen in totaal negen tot 12 uur migreren. Om de optimale migratietijd te bepalen, controleert u de cellen zes uur na het maken van de wond en daarna om de twee tot drie uur.Beëindig het experiment wanneer de cellen in controleomstandigheden de wond volledig bedekken. Begin met het beëindigen van de migratietest en het deconstrueren van het systeem door de O9-1-celinzetstukken na negen tot 12 uur na de migratieperiode te verwijderen. Zuig het C2C12 medium voorzichtig aan.Voeg 0,5 milliliter PBS toe aan de kamerputten en maak definitieve beelden van cellen na migratie. Verwijder zorgvuldig alle PBS gemengd met medium en verwijder de plastic kamers uit de kamerputten met behulp van kitinstructies. De onderliggende dia met de C2C12-cellen verlaten.Voor immunostaining, incubeer de dia onmiddellijk met 4% paraform aldehyde gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder vervolgens paraformaldehyde en was de dia met 0,1% Triton X-100 met PBST gedurende 15 minuten op kamertemperatuur. Giet na 15 minuten PBST uit en was de dia twee keer met PBS gedurende elk 10 minuten.Maak vervolgens een hydrofobe grens met een hydrofobe pen rond de dia om te voorkomen dat oplossingen uit de dia morsen om verstoring van de hechtingscellen te voorkomen. Voeg vervolgens ongeveer 0,5 milliliter 1% BSA-blokkerende oplossing toe aan de glijbaan binnen de hydrofobe grens en incubeer de dia gedurende een uur bij kamertemperatuur in een bevochtigde schuifkamer. Verwijder aan het einde van de incubatie de blokkerende oplossing en voeg het falloïdine-antilichaam toe aan deze dia binnen de hydrofobe grens en incubeer 's nachts bij vier graden Celsius.Plaats de volgende dag de dia in een diahouder die beschermd is tegen blootstelling aan licht. Was de cellen driemaal met PBS gedurende 10 minuten elk op kamertemperatuur. Voeg DAPI-bevattend montagemedium toe, monteer de dia's met glazen afdekslips en leg de cellen vast met behulp van een standaard fluorescentiemicroscoop.In de huidige studie versnelde de toevoeging van recombinant Wnt5a aan co-kweekputten de myoblastmigratie met volledig herstel van sommige gebieden met negen uur. De migrerende myoblasten vertoonden in alle drie de omstandigheden een normale migrerende cellulaire morfologie, waaronder goed gevormde en uitstekende filopodia en lamellipodia en asymmetrische polarisatie van actinecytoskeletale projecties. Het paracriene effect van NCC-afgeleide Wnt5a op myoblastmigratie werd bestudeerd.Behandeling met 50 nanomolair siRNA tegen Wnt5a verminderde de Wnt5a-genexpressie met 64% in vergelijking met negatieve controle. De migratie van C2C12-mijlsexplosies met aanzienlijk verminderde na Wnt5a-knockdown in NCC's en de toevoeging van exogene recombinant Wnt5a redde dit migratietekort en morfologisch defect in deze myoblasten. Om de signaalontvangstcelmechanismen in het paracriene model beter te begrijpen, werd de ROR2-receptor neergehaald en werd de genexpressie verminderd met 54% Knockdown van ROR2 in myoblasten vermindert hun migratiecapaciteit ondanks de aanwezigheid van NCC's.Exogene recombinant Wnt5a slaagde er niet in om myoblastmigratie te redden na ROR2 knockdown, wat suggereert dat ROR2-depletie het vermogen van myoblasten om Wnt5a-signalen te ontvangen verstoort. Kweekcellen tot voldoende dichtheid kras met P10 tip slechts eenmaal gemonteerd en ongeassembleerd co-kweeksysteem met zorg zonder de onderliggende cel te verstoren. Deze techniek werd gebruikt als een proof of concept om een specifieke moleculaire signaleringsas binnen de complexe Wnt / PCP-route te bestuderen met relevantie voor neurale crestcel en tweede hartveldbiologie.

modeling-paracrine-noncanonical-wnt-signaling-in-vitro

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

This video describes a non-contact co-culture wound healing assay to evaluate the migratory capacity of murine myoblasts. This helps to understand signal-sending and signal-receiving components of the paracrine non-canonical Wnt signaling interactions in vitro.

Wound Assay to Evaluate the Migratory Capacity of Murine Myoblasts in Co-Culture

De zachte agar-kolonievormingstest is een methode die wordt gebruikt om cellulaire ankeronafhankelijke groei in vitro te bevestigen. Het doel van dit protocol is om een strenge methode te illustreren voor de detectie van het tumorigene potentieel van getransformeerde cellen en de tumoronderdrukkende effecten van eiwitten op getransformeerde cellen.

De Soft Agar Kolonie Formatie Assay

Deze video-artikel toont het gebruik van de dorsale wortel ganglia (DRG)/kankercelmodel in adenocarcinoom van de ductus pancreaticus.

In Vitro Modellering van kanker zoals Neurale Invasion: De dorsale wortel ganglion Model

Het gebruik van reporter muizen gekoppeld aan ganse berg en rubriek vlekken, microscopie en in vivo assays vergemakkelijkt de analyse van de onderliggende mechanismen van het normale patroon van de luchtwegen. Hier beschrijven we hoe deze technieken hebben bijgedragen aan de analyse van Wnt signalering gedurende tracheale ontwikkeling.

Studeren Wnt Signalering Tijdens patroonvorming van Conducting Airways

Epitheliële naar mesenchymale overgang (EMT) maakt het mogelijk dat kankers invasief worden. Om EMT te onderzoeken, wordt een op neurale stamcellen (NSC) gebaseerd in vitro model beschreven dat vrij is van serum en enzymen. Dit gestandaardiseerde systeem maakt een kwantitatieve en kwalitatieve beoordeling van celmigratie, gen- en eiwitexpressie mogelijk. Het model is geschikt voor geneesmiddelontdekking.

Een enzym en Serum-free neurale stamcel Cultuur Model voor EMT Investigation Geschikt voor Drug Discovery

Deze video artikel beschrijft een eenvoudige in vivo methodiek die gebruikt kunnen worden om systematisch en efficiënt te karakteriseren componenten van complexe signaalwegen en regulatorische netwerken in vele ongewervelde embryo's.

De kracht van eenvoud: Sea Urchin Embryo&#39;s als<em&gt; In Vivo</em&gt; Developmental Modellen voor het bestuderen van complexe Cell-to-cell signaling Network Interactions

Deze test maakt gebruik van embryonale stamcellen van muizen gedifferentieerd in embryoïde lichamen gekweekt in 3D-collageengel om de biologische processen te analyseren die kiemende angiogenese in vitro beheersen. De techniek kan worden toegepast voor het testen van medicijnen, het modelleren van ziekten en voor het bestuderen van specifieke genen in de context van deleties die embryonaal dodelijk zijn.

In vitro Driedimensionale kiemtest van angiogenese met behulp van embryonale stamcellen van muizen voor vaatziektemodellering en drugstests

Dit artikel beschrijft in vivo en in vitro methodologie om de thymische vestigingsprogenitors te karakteriseren door de analyse van de kinetiek van generatie, fenotype en aantallen van hun T-cel nakomelingen.

Karakterisering van Thymic Settling voorouders in de Mouse Embryo behulp<em&gt; In Vivo</em&gt; En<em&gt; In Vitro</em&gt; Testen

Het manuscript hier een eenvoudige set van methoden voor het analyseren van de afscheiding en de verspreiding van fluorescent gelabelde liganden in Xenopus. Dit verschaft een context voor het testen van het vermogen van andere eiwitten ligand distributie passen en waardoor experimenten inzicht in mechanismen reguleren morfogeen gradiënten kunnen leiden.

Met behulp van confocale Analyse<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Om Modulators van Wnt en Shh Morfogen Verlopen Onderzoek

Notch-signalering is een vorm van cellulaire communicatie die afhankelijk is van direct contact tussen cellen. Om Notch-signalering goed te induceren in vitro, moeten Notch-liganden aan cellen worden gepresenteerd in een geïmmobiliseerde toestand. Dit protocol beschrijft methoden voor in vitro stimulatie van Notch-signalering in voorlopers van muizenosteoclasten.

Stimulatie van Notch signalering in Mouse osteoclastvoorlopers

Leer een reproduceerbare methode om paracriene niet-canonische Wnt-signalering in vitro te evalueren met C2C12-myoblasten en O9-1-neurale kamcellen. Deze techniek maakt functionele en moleculaire analyses van Wnt5a-signalering mogelijk.

Modellering Paracriene Niet-canonische Wnt Signalering In Vitro

Meer video's verkennen