Alizarine rode kleuring gebruiken om chemisch geïnduceerd botverlies bij zebravislarven te detecteren
28 december 2021
Hier hebben we alizarine rode kleuring gebruikt om aan te tonen dat blootstelling aan loodacetaat een botmassaverandering veroorzaakt bij zebravislarven. Deze kleuringsmethode kan worden aangepast aan het onderzoek naar botverlies bij verlies van zebravislarven veroorzaakt door andere gevaarlijke toxische stoffen.
Deze methode kan helpen bij het detecteren van de bottoxiciteit veroorzaakt door chemicaliën in zebravissen. Alizarine Rode kleuring van vast weefsel genereert een permanent record van skeletveranderingen die vergelijkingen van verschillende exemplaren kunnen vergemakkelijken. Deze techniek kan nuttig zijn om osteoporose in het zebravismodel te bestuderen, omdat een van de kenmerken van osteoporose de afname van de botmassa is.
Verwijder 10 zebravislarven willekeurig uit elke groep negen dagen na de bevruchting en fixeer de vis in één milliliter van 2% paraform aldehyde en 1X PBS gedurende twee uur. Decanteer de oplossing en was de zebravislarve met 100 millimol Tris HCL met een pH van 7,5 of 10 millimol magnesiumchloride. Voor het ontkleuren decanteert u de oplossing en incubeert u de larve gedurende vijf minuten in een reeks oplossingen zoals beschreven in het manuscript.
Na de laatste incubatie decanteert u de oplossing en verwijdert u het pigment door te bleken met een oplossing bestaande uit 3% waterstofperoxide en 0,5% kaliumhydroxide. Observeer eens in de 10 minuten totdat het pigment volledig is verwijderd. Spoel de zebravislarve meerdere keren met 25% glycerine, 0,1% kaliumhydroxide gedurende 10 minuten elk totdat er geen bubbels zijn.
Kleur in de larve door te weken in een milliliter van 0,01% Alizarine. Decanteer de oplossing en voeg een milliliter van 50% glycerine of 0,1% kaliumhydroxide toe om de achtergrond te verwijderen. Bewaar de vis in verse 50% glycerine of 0,1% kaliumhydroxide voor latere observatie.
Breng één larve per keer over op de glasglaas en houd de larve in het midden van de vloeistofdruppel. Observeer de larve onder een stereomicroscoop. Schakel de camera in.
Open de software en behoud de standaardinstellingen. Klik op AE en kies een geschikte belichtingstijd om de beste afbeelding te verkrijgen. Leg alle afbeeldingen vast onder dezelfde instellingen.
Sla de afbeeldingen op in dot tiff-indeling voor latere analyse. Dubbelklik op het imageJ-pictogram. Om de opgeslagen afbeeldingen te analyseren, klikt u op bestand, vervolgens op openen, klikt u vervolgens op afbeelding en typt u en selecteert u acht-bits.
Klik op bewerken en keer om. Klik op analyseren en vervolgens kalibreren. Selecteer Niet-gekalibreerde OD in de pop-upinterface.
Controleer de algemene kalibratie linksonder in de onderste interface en klik op OK. Klik op analyseren, stel schaal in en verwijder vervolgens schaal. Controleer hieronder globaal en klik op OK.
Klik op analyseren en stel vervolgens metingen in. Selecteer het itemgebied in de pop-upinterface. Controleer de limiet tot de drempel hieronder om alleen het geselecteerde bereik te meten en klik op OK.
Klik op afbeelding, pas aan, drempel en schuif de schuifregelaar in het midden van de pop-upinterface. De juiste drempelwaarde selecteren zodat alle te testen doelen in één afbeelding worden geselecteerd. En klik op instellen.
Klik op analyseren, meet vervolgens, sla de datums op. Alizarine Red Staining is een gevoelige en specifieke methode voor het meten van veranderingen in botmineralisatie bij zebravislarven. Negen dagen na de bevruchting zijn veel botten van het hoofdskelet zoals parasphenoïde, operculair, ceratobranchiaal en notochord gemineraliseerd en daarom rood gekleurd.
Daarentegen lijken niet-benige structuren zoals otolieten bruinzwart. Digitale analyse uitgevoerd om het totale gebeitste gebied te kwantificeren, toonde een significante afname van het gekleurde gebied voor de 10 en 20 milligram per liter loodacetaatbehandelingsgroepen. De veranderingen in botmineralisatie toonden dosisafhankelijkheid.
Voor een beter kleuringseffect en observatie is het belangrijk om het oorspronkelijke pigment van zebravislarven te verwijderen en de bubbels na het bleken te verwijderen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie maakt gebruik van alizarinerood-kleuring om aan te tonen dat blootstelling aan loodacetaat leidt tot veranderingen in de botmassa bij zebravissenlarven. De methode is aanpasbaar voor het onderzoeken van botverlies veroorzaakt door diverse schadelijke toxische stoffen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Toxicologie
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- Alizarine-roodkleuring is een techniek die wordt gebruikt om skeletstructuren te visualiseren.
- Zebravissen zijn een modelorganisme voor het bestuderen van botontwikkeling en toxiciteit.
- Loodacetaat staat erom bekend toxische effecten te hebben op biologische systemen.
- Osteoporose wordt gekenmerkt door een afname van de botmassa, wat gemodelleerd kan worden in zebravissen.
Doel van de studie
- Om de impact van loodacetaat op de botmassa in zebravislarven te beoordelen.
- Om een methode vast te stellen voor het detecteren van bottoxiciteit geïnduceerd door chemicaliën.
- Om vergelijkingen van skeletale veranderingen tussen specimenen te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Alizarineroodkleuring van gefixeerd zebravisweefsel.
- Fixatie van zebravislarven in paraformaldehyde en PBS.
- Wassen van larven met Tris-HCl of magnesiumchloride.
- Ontkleuringsprocedures zoals beschreven in het manuscript.
Belangrijkste resultaten
- Blootstelling aan loodacetaat leidde tot waarneembare veranderingen in de botmassa.
- De kleuringsmethode zorgde voor een permanent verslag van de skeletveranderingen.
- De resultaten ondersteunen het gebruik van zebravis als model voor het bestuderen van osteoporose.
- De methodologie maakt onderzoek naar andere gevaarlijke toxische stoffen mogelijk.
Conclusies
- Alizarinerood-kleuring is effectief voor het beoordelen van bottoxiciteit bij zebravisjes.
- De studie benadrukt het potentieel van zebravisjes in toxicologisch onderzoek.
- Verder onderzoek kan uitbreiden op de effecten van diverse toxicanten op de botgezondheid.
Veelgestelde Vragen
Industriële Relevantie voor Management
Deze methode maakt vroege detectie van chemisch geïnduceerd botverlies in zebravislarven mogelijk, wat bijdraagt aan mechanische risicoanalyse in de toxicologie en targetvalidatie voor skeletale gezondheidspaden. Door gemineraliseerde weefselveranderingen te kwantificeren via alizarineroodkleuring, biedt deze methode een reproduceerbare, dosisafhankelijke uitlezing voor het beoordelen van de effecten van verbindingen op botmineralisatie. De aanpak ondersteunt de voorspellende betrouwbaarheid bij lead-optimalisatie en preklinische veiligheidsscreenings voor bot-actieve verbindingen.
Strategische toepassingen in Biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek mogelijk naar therapeutische hypothesen met betrekking tot botmineralisatie en skeletintegriteit.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door een permanent, kwantificeerbaar verslag van skeletveranderingen over verschillende specimens te bieden.
- Voorspellende waarde: Faciliteert portfolio-triage door verbindingen met dosisafhankelijke effecten op de botmassa vroeg in de ontdekkingsfase te identificeren.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert kwantitatieve, drempelwaardegebaseerde metingen van het gekleurde oppervlak voor een objectieve vergelijking tussen behandelingsgroepen.
- Operationele waarde: Standaardiseert de monsterpreparatie en beeldprotocollen om reproduceerbaarheid en schaalbaarheid in multi-well formats te waarborgen.
- Klaarheid voor assay: Genereert digitale outputs die compatibel zijn met ImageJ-analyse, waardoor high-content screening van fenotypen van bottoxiciteit mogelijk wordt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Modelleert menselijk-relevante skeletale reacties op toxicanten, wat de translationele afstemming van biomarkers voor botverlies ondersteunt.
- Operationele waarde: Slaat een brug tussen discovery- en preklinische workflows door een geconserveerde, op gewervelden gebaseerde assay voor botmineralisatie te bieden.
- Risicobeperking: Informeert risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door signalen van botverlies te detecteren vóór mammalia-studies.
Integratie van pipeline & workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie via lead-identificatie tot preklinische veiligheidsbeoordeling, in het bijzonder voor verbindingen met potentiële off-targeteffecten op skeletsystemen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van chemische effecten op botontwikkeling en mineralisatieroutes in een gewervdenmodel.
- Screening: Maakt assay-standaardisatie en kwantitatieve read-outs mogelijk voor het detecteren van dosisafhankelijke veranderingen in het gekleurde oppervlak.
- Analytics: Biedt gekalibreerde, drempelgebaseerde oppervlaktemetingen die statistische vergelijking van botmineralisatie tussen verschillende condities mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan bij preklinische continuïteit door geconserveerde skeletale reacties op toxicanten in zebravislarven te modelleren.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor het screenen van diverse chemische bibliotheken op risico's voor bottoxiciteit.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit in botgerelateerde pathways te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid door gestandaardiseerde fixatie-, kleurings- en digitale kwantificatiestappen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroegtijdige, kwantitatieve signalen van vatbaarheid voor botverlies te leveren.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risicogebaseerde prioritering door risico's op skelettoxiciteit te identificeren vóór significante investeringen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in het hanteren van zebravis, histologie en fluorescentie-/colorimetrische beeldvorming.
- Afhankelijk van stereomicroscopie en software voor beeldanalyse (bijv. ImageJ) voor gestandaardiseerde kwantificering.
- Vereist standaardisatie van kleuringsprotocollen en drempelwaarden over teams heen voor reproduceerbare resultaten.
- Houdt rekening met aanpassingen bij uitbreiding naar andere modelsystemen of chemische klassen buiten loodacetaat.
- Beperkt door de noodzaak van pigmentverwijdering en stappen voor het helder maken van de achtergrond om nauwkeurige signaaldetectie te garanderen.
