Name: Alizarine rode kleuring gebruiken om chemisch geïnduceerd botverlies bij zebravislarven te detecteren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: Leer alizarine rode kleuring om chemisch geïnduceerd botverlies bij zebravislarven te detecteren. Deze methode genereert een permanente registratie van skeletveranderingen voor toxicologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (81872646; 81811540034; 81573173) en de Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD).

Alle dierprocedures die hier worden beschreven, zijn beoordeeld en goedgekeurd door het Animal Care Institute van de ethische commissie van de Soochow University.
1. Vishouderij en embryocollectie 14
<ol><li>Voer vis drie keer per dag; ervoor zorgen dat de zebravissen op 28,5 ± 0,5 °C worden gehouden met een licht/donkercyclus van 14:10 uur.</li>
	<li>Scheid de mannelijke en vrouwelijke volwassen vissen door isolatieborden in paaitanks in een 2: 1 man/vrouw verhouding in de avond.</li>
	<li>Verwijder de volgende ochtend om 9:00 uur de isolatieborden en haal de embryo's 2 uur later op.</li>
	<li>Plaats de embryo's vóór het experiment in een biochemische incubator die op 28,5 °C wordt gehouden.</li>
</ol>2. Blootstelling aan chemische stoffen
<ol><li>Bereid de moedervoorraad voor: weeg loodacetaattrihydraat (5 g) en los het op in ultrapuur water (50 ml) met roeren. LET OP: PbAc is giftig. Draag geschikte stofmaskers, beschermende kleding en handschoenen. Voer het experiment uit onder een zuurkast.</li>
	<li>Selecteer en verdeel zebravisembryo's willekeurig in schone 6-well-platen (30 embryo's per put in 3 ml zebravisbroedwater; zie tabel 1 voor de samenstelling). Behandel de embryo's met PbAc (0, 5, 10, 20 mg/L) van 2 tot 120 uur na de bevruchting (hpf). OPMERKING: De concentraties van PbAc werden gekozen op basis van de experimenten met het vinden van het dosisbereik. De resultaten toonden aan dat de LC50 van loodacetaat op zebravisembryo's 41,044 mg / L was bij 120 pkf. Daarom werd de hoogste concentratie ingesteld op de helft van de LC50 en een reeks oplossingen bereid door 2-voudige verdunning.</li>
	<li>Voer de larven twee keer per dag vanaf 5 dagen na de bevruchting (dpf). Houd de zebravisembryo's op 28,5 ± 0,5 °C met een licht/donkercyclus van 14:10 uur.</li>
	<li>Ververs het Pb-vrije medium (zebravisbroedwater) elke 24 uur tot 9 dpf. OPMERKING: Na voltooiing van de experimenten werden alle loodhoudende oplossingen in een aangewezen vloeistoftank gegoten en behandeld door het experimentmanagementcentrum.</li>
</ol>3. Alizarine rode kleuring
OPMERKING: Draag geschikte stofmaskers, beschermende kleding en handschoenen tijdens het hele kleuringsproces. De samenstellingen van alle oplossingen zijn weergegeven in tabel 1.
<ol><li>Specifieke kleuringsstappen OPMERKING: Het verfproces werd uitgevoerd in een 24-well plaat bij kamertemperatuur. Nadat elke oplossing is toegevoegd, plaatst u de 24-wells plaat op de schudtafel op een lage snelheid.<ol><li>Verwijder willekeurig 10 zebravislarven uit elke groep op 9 dpf en fixeer de vis in 1 ml 2% paraformaldehyde / 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing gedurende 2 uur.</li>
		<li>Decanteer de oplossing en was de zebravislarven met 100 mM Tris-HCl (pH 7,5)/10 mM MgCl2 gedurende 10 min.</li>
		<li>Decanteer de oplossing en incubeer de larven in de volgende oplossingen gedurende elk 5 minuten voor destaining: watervrije ethanol (EtOH) oplossing (80% EtOH/100 mM Tris-HCl (pH 7,5)/10 mM MgCl2, 50% EtOH/100 mM Tris-HCl (pH=7,5) en 25% EtOH/100mM Tris-HCl (pH=7,5).</li>
		<li>Decanteer de oplossing, verwijder het pigment door te bleken met een oplossing bestaande uit 3% H2O2 en 0,5% KOH en observeer eenmaal per 10 minuten totdat het pigment volledig is verwijderd.</li>
		<li>Spoel de zebravislarven meerdere keren af met 25% glycerine/0,1% KOH gedurende 10 minuten elk totdat er geen bubbels zijn. OPMERKING: Het is belangrijk om bubbels te vermijden; anders verschijnen de bubbels in het zebravislichaam als een zwart gezichtsveld onder de microscoop, wat van invloed zal zijn op waarnemingen en kwantitatieve analyse.</li>
		<li>Kleur de larven door 50 minuten in 1 ml 0,01% alizarine te weken.</li>
		<li>Decanteer de oplossing en voeg 1 ml 50% glycerine / 0,1% KOH toe gedurende 10 minuten om de achtergrond vrij te maken. Bewaar de vissen in verse 50% glycerine/0,1% KOH voor latere observatie.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Beeldacquisitie
<ol><li>Breng elke keer één larve over op de glasglaas, waarbij de larve in het midden van de vloeistofdruppel blijft.</li>
	<li>Observeer de larven onder een stereomicroscoop.</li>
	<li>Schakel de camera in, open de software (zie de tabel met materialen) en behoud de standaardinstellingen.</li>
	<li>Klik op AE en kies een geschikte belichtingstijd (60 ms in dit experiment) om het beste beeld te verkrijgen.</li>
	<li>Leg alle afbeeldingen vast onder dezelfde instellingen. Sla de afbeeldingen op in .tif indeling voor latere analyse.</li>
</ol>5. Beeldanalyse
OPMERKING: Zie het aanvullende bestand voor een voorbeeld met een set voorbeeldgrafieken voor beeldanalyse.
<ol><li>Dubbelklik op het ImageJ-pictogram en analyseer de afbeeldingen die zijn opgeslagen in stap 4.5.<ol><li>Klik op Bestand | Open om de afbeeldingen te openen die zijn opgeslagen in stap 4.5.</li>
		<li>Klik op Afbeelding | Typ, selecteer 8-bits.</li>
		<li>Klik op Bewerken | Omkeren.</li>
		<li>Klik op Analyseren | Kalibreren, selecteer Ongekalibreerde OD in de pop-upinterface, vink Algemene kalibratie linksonder in de onderste interface aan en klik op OK.</li>
		<li>Klik op Analyseren | Schaal instellen | Klik op Schaal verwijderen in de pop-upinterface, vink hieronder Algemeen aan en klik op OK.</li>
		<li>Klik op Analyseren | Stel Metingen in, selecteer het itemgebied in de pop-upinterface, vink de limiet tot drempel hieronder aan (om alleen het geselecteerde bereik te meten) en klik op OK.</li>
		<li>Klik op Afbeelding | Aanpassen| Drempel, schuif de schuifregelaar in het midden van de pop-upinterface om de juiste drempel te selecteren (wijzig de drempel voor elke afbeelding) zodat alle doelen die in één afbeelding moeten worden getest, zijn geselecteerd en klik op Instellen.</li>
		<li>Klik op Analyseren | Meten. Noteer de datums van elke groep.</li>
	</ol></li>
	<li>Gebruik eenrichtings-ANOVA gevolgd door tukey's meervoudige vergelijkingstest om de verschillen te analyseren en stel het significantieniveau in op p < 0,001 (***).</li>
</ol>

<ol><li>Compston, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+the+registration+of+agents+for+prevention+and+treatment+of+glucocorticoid-induced+osteoporosis%3A+an+update+from+the+Group+for+the+Respect+of+Ethics+and+Excellence+in+Science%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoporosis+International%22%5BJournal%5D)">Recommendations for the registration of agents for prevention and treatment of glucocorticoid-induced osteoporosis: an update from the Group for the Respect of Ethics and Excellence in Science.</a> Osteoporosis International. 19 (9), 1247-1250 (2008).</li>
<li>Rachner, T. D., Gobel, A., Jaschke, N. P., Hofbauer, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+preventing+bone+loss+induced+by+aromatase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Challenges in preventing bone loss induced by aromatase inhibitors.</a> Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 105 (10), (2020).</li>
<li>Kataba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+exposure+to+environmentally+relevant+lead+levels+induces+oxidative+stress+and+neurobehavioral+alterations+in+larval+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Acute exposure to environmentally relevant lead levels induces oxidative stress and neurobehavioral alterations in larval zebrafish (Danio rerio).</a> Aquatic Toxicology. 227, 105607(2020).</li>
<li>Morin, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+fracture+prevalence+and+in+bone+mineral+density+between+Chinese+and+White+Canadians%3A+the+Canadian+Multicentre+Osteoporosis+Study+%28CaMos%29%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Osteoporosis%22%5BJournal%5D)">Differences in fracture prevalence and in bone mineral density between Chinese and White Canadians: the Canadian Multicentre Osteoporosis Study (CaMos).</a> Archives of Osteoporosis. 15 (1), 147(2020).</li>
<li>Lee, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+lead+poisoning+magnifies+bone+detrimental+effects+in+an+ovariectomized+rat+model+of+postmenopausal+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Chronic lead poisoning magnifies bone detrimental effects in an ovariectomized rat model of postmenopausal osteoporosis.</a> Experimental Toxicologic Pathology. 68 (1), 47-53 (2016).</li>
<li>Theppeang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associations+of+bone+mineral+density+and+lead+levels+in+blood%2C+tibia%2C+and+patella+in+urban-dwelling+women%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Associations of bone mineral density and lead levels in blood, tibia, and patella in urban-dwelling women.</a> Environmental Health Perspectives. 116 (6), 784-790 (2008).</li>
<li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoporosis+in+a+Chinese+population+due+to+occupational+exposure+to+lead%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+Industrial+Medicine%22%5BJournal%5D)">Osteoporosis in a Chinese population due to occupational exposure to lead.</a> American Journal Industrial Medicine. 51 (6), 436-442 (2008).</li>
<li>Guadalupe-Grau, A., Fuentes, T., Guerra, B., Calbet, J. A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise+and+bone+mass+in+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Exercise and bone mass in adults.</a> Sports Medicine. 39 (6), 439-468 (2009).</li>
<li>Ottani, V., Raspanti, M., Ruggeri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+structure+and+functional+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Collagen structure and functional implications.</a> Micron. 32 (3), 251-260 (2001).</li>
<li>Kelly, W. L., Bryden, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+differential+stain+for+cartilage+and+bone+in+whole+mount+preparations+of+mammalian+fetuses+and+small+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">A modified differential stain for cartilage and bone in whole mount preparations of mammalian fetuses and small vertebrates.</a> Stain Technology. 58 (3), 131-134 (1983).</li>
<li>Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+high+content%2C+in+vivo+model+of+glucocorticoid-induced+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis.</a> Biotechnology Journal. 1 (6), 651-655 (2006).</li>
<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li>
<li>Fernandez, I., Gavaia, P. J., Laize, V., Cancela, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fish+as+a+model+to+assess+chemical+toxicity+in+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Fish as a model to assess chemical toxicity in bone.</a> Aquatic Toxicology. 194, 208-226 (2018).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+GH%2FIGF+axis+in+arsenite-induced+developmental+toxicity+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+Environmental+Safety%22%5BJournal%5D)">Role of GH/IGF axis in arsenite-induced developmental toxicity in zebrafish embryos.</a> Ecotoxicology Environmental Safety. 201, 110820(2020).</li>
<li>Bergen, D. J. M., Kague, E., Hammond, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+an+emerging+model+for+osteoporosis%3A+a+primary+testing+platform+for+screening+new+osteo-active+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as an emerging model for osteoporosis: a primary testing platform for screening new osteo-active compounds.</a> Frontiers in Endocrinology. 10, 6(2019).</li>
<li>Charles, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+quantitative+micro-computed+tomographic+analysis+in+zebrafish+to+define+gene+function+during+skeletogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Utility of quantitative micro-computed tomographic analysis in zebrafish to define gene function during skeletogenesis.</a> Bone. 101, 162-171 (2017).</li>
<li>Hammond, C. L., Moro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+transgenic+reporters+to+visualize+bone+and+cartilage+signaling+during+development+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Using transgenic reporters to visualize bone and cartilage signaling during development in vivo.</a> Frontiers in Endocrinology. 3, 91(2012).</li>
<li>Bensimon-Brito, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+in+vivo+staining+with+alizarin+red+S--a+valuable+approach+to+analyse+zebrafish+skeletal+mineralization+during+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Revisiting in vivo staining with alizarin red S--a valuable approach to analyse zebrafish skeletal mineralization during development and regeneration.</a> BMC Developmental Biology. 16, 2(2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

De zebravis is een geschikt model voor het bestuderen van botmetabolismeziekte. In vergelijking met knaagdiermodellen zijn zebravismodellen relatief snel vast te stellen en is het meten van de ernst van de ziekte eenvoudiger. Bij wild-type zebravislarven treedt mineralisatie van het hoofdskelet op bij 5 dpf en het axiale skelet bij 7 dpf15. Schedelbotten zoals PS, OP, CB en NC zijn dus goed ontwikkeld met 9 dpf. Nadat de larven volledig waren vastgehouden en gebleekt, werden de zachte weefsels ver...

Recente studies hebben bevestigd dat osteoporose als gevolg van glucocorticoïden, aromataseremmers en overmatig alcoholgebruik vaak voorkomt 1,2. Lood (Pb) is een giftig metaal dat voorkomt in planten, bodem en aquatische omgevingen3. Hoewel de nadelige effecten van Pb op het menselijk lichaam veel aandacht hebben getrokken, moet de onomkeerbare impact ervan op het bot verder worden onderzocht. Loodintoxicatie veroorzaakt een breed scala aan pathologische veranderingen in zowel het zich ontwikkelende als het volwassen skelet, wat van invloed is op normale levensactiviteiten. Studies hebben een verband gevonden tussen chronische Pb-blootstelling en botschade4, waaronder aangetaste botstructuren 5,6, verminderde botmineraaldichtheid en zelfs een verhoogd risico op osteoporose7.
Gemineraliseerd weefsel is van groot belang voor botsterkte8, en botmineralisatiematrixafzetting is een kritische index van botvorming9. Alizarine rood heeft een hoge affiniteit voor calciumionen en alizarine rode kleuring is een standaardprocedure voor het beoordelen van botvorming10. Volgens deze methode wordt gemineraliseerd weefsel rood gekleurd, terwijl al het andere weefsel transparant blijft. Het bevlekte gebied wordt vervolgens gekwantificeerd door digitale beeldanalyse11.
Zebravis is een belangrijk modelorganisme dat veel wordt gebruikt in geneesmiddelenontdekkings- en ziektemodellen. Genetische studies bij zebravissen en mensen hebben overeenkomsten aangetoond in de onderliggende mechanismen van skeletmorfogenese op moleculair niveau12. Bovendien is high-throughput screening van geneesmiddelen of biomolecuulen haalbaarder in grote klauwen zebravissen dan muizenmodellen, waardoor de mechanistische studie van proosteogene of osteotoxische moleculenwordt vergemakkelijkt 13. Differentiële kleuring van het skelet in toto10 wordt vaak gebruikt bij het bestuderen van skeletdysplasie bij kleine gewervelde dieren en zoogdierfoetussen. Alizarine rode kleuring werd uitgevoerd om de botontwikkelingstoxiciteit van chemicaliën in zebravislarven te onderzoeken. Hierin gebruikten we lood als voorbeeld om een protocol te beschrijven voor het detecteren van door loodacetaat geïnduceerde botdefecten bij zebravislarven.

<table><tbody><tr><td>1 M Tris-HCl (pH=7.5)</td><td>Solarbio, Beijing, China</td><td>21</td><td>voor het vasthouden</td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyde Fix Solution</td><td>BBI, Shanghai, China</td><td>14</td><td>voor het fixeren van weefsels</td></tr><tr><td>10x PBS buffer</td><td>BBI, Shanghai, China</td><td>15</td><td>voor het fixeren</td></tr><tr><td>35% H2O2</td><td>Yonghua, Jiangsu, China</td><td>8</td><td>pigmentverwijdering</td></tr><tr><td>50 mL Centrifuge tube</td><td>AKX, Jiangsu, China</td><td>4</td><td></td></tr><tr><td>95% Anhydrous ethanol</td><td>Enox, Jiangsu, China</td><td>2</td><td>ontkleuring</td></tr><tr><td>Alizarin red (Purity 99.5%)</td><td>Solarbio, Beijing, China</td><td>1</td><td>kleuring</td></tr><tr><td>Biochemical incubator</td><td>Yiheng, Shanghai, China</td><td>3</td><td>kweek van zebravis-embryo's</td></tr><tr><td>Electronic scale</td><td>Sartorius, Duitsland</td><td>5</td><td>wegen van de vaste grondstoffen</td></tr><tr><td>Glycerin (Purity 99.5%)</td><td>BBI, Shanghai, China</td><td>7</td><td>opslag van de gekleurde vissen</td></tr><tr><td>ImageJ (software)</td><td>VS</td><td>9</td><td>digitale analyse</td></tr><tr><td>KOH (Purity 99.9%)</td><td>Sigma, Amerika</td><td>10</td><td>bleekvloeistof</td></tr><tr><td>Lead acetate trihydrate (Purity 99.5%)</td><td>Aladdin, Shanghai, China</td><td>11</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 (Purity 99.9%)</td><td>Aladdin, Shanghai, China</td><td>12</td><td>reinigingsvloeistof</td></tr><tr><td>NIS-Elements F (software)</td><td>Nikon, Japan</td><td>13</td><td>waarnemen en foto's maken</td></tr><tr><td>Pipe</td><td>AKX, Jiangsu, China</td><td>18</td><td>verwijdering van embryo's en oplossing</td></tr><tr><td>plates (24-well)</td><td>Corning, Amerika</td><td>17</td><td>container voor het kleuren van embryo's</td></tr><tr><td>plates (6-well)</td><td>Corning, Amerika</td><td>16</td><td>container voor het fokken van embryo's</td></tr><tr><td>Shaking table</td><td>Beyotime, China</td><td>19</td><td>mengen van de oplossing</td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Nikon, Japan</td><td>20</td><td>waarnemen en foto's maken</td></tr><tr><td>Zebrafish</td><td>Zebrafish Experiment Center of Soochow University, Suzhou, China</td><td>22</td><td>experimenteel dier</td></tr></tbody></table>

alizarine rode kleuring gebruiken om chemisch geïnduceerd botverlies bij zebravislarven te detecteren

Using Alizarin Red Staining to Detect Chemically Induced Bone Loss in Zebrafish Larvae

Chemisch geïnduceerd botverlies als gevolg van blootstelling aan lood (Pb) kan een reeks nadelige effecten op zowel menselijke als dierlijke skeletsystemen veroorzaken. De specifieke effecten en mechanismen bij zebravissen blijven echter onduidelijk. Alizarine rood heeft een hoge affiniteit voor calciumionen en kan helpen bij het visualiseren van het bot en het illustreren van de minerale massa van het skelet. In deze studie wilden we loodacetaat (PbAc) -geïnduceerd botverlies in zebravislarven detecteren door alizarine rode kleuring te gebruiken. Zebravisembryo's werden behandeld met een reeks PbAc-concentraties (0, 5, 10, 20 mg / L) tussen 2 en 120 uur na de bevruchting. Whole-mount skeletkleuring werd uitgevoerd op larven 9 dagen na de bevruchting en het totale gekleurde gebied werd gekwantificeerd met behulp van ImageJ-software. De resultaten gaven aan dat de gemineraliseerde weefsels rood gekleurd waren en dat het gekleurde gebied aanzienlijk afnam in de PbAc-blootstellingsgroep, met een dosisafhankelijke verandering in botmineralisatie. Dit artikel presenteert een kleuringsprotocol voor het onderzoeken van skeletveranderingen in PbAc-geïnduceerde botdefecten. De methode kan ook worden gebruikt bij zebravislarven voor de detectie van botverlies veroorzaakt door andere chemicaliën.

Alizarine rode kleuring is een gevoelige en specifieke methode voor het meten van veranderingen in botmineralisatie bij zebravislarven. In deze studie hebben we waargenomen dat PbAc nadelige effecten had op zebravislarven, waaronder dood, misvorming, verminderde hartslag en verkorting van de lichaamslengte. Bovendien werden de minerale skeletgebieden van zebravislarven geëvalueerd om PbAc-geïnduceerd botverlies te onderzoeken. Bij 9 dpf (figuur 1A) zijn veel botten van het hoofdskelet gemine...

Hier hebben we alizarine rode kleuring gebruikt om aan te tonen dat blootstelling aan loodacetaat een botmassaverandering veroorzaakt bij zebravislarven. Deze kleuringsmethode kan worden aangepast aan het onderzoek naar botverlies bij verlies van zebravislarven veroorzaakt door andere gevaarlijke toxische stoffen.

Alizarine rode kleuring gebruiken om chemisch geïnduceerd botverlies bij zebravislarven te detecteren

Chemically induced bone loss due to lead (Pb) exposure could trigger an array of adverse impacts on both human and animal skeletal systems. However, the ...

Deze methode kan helpen bij het detecteren van de bottoxiciteit veroorzaakt door chemicaliën in zebravissen. Alizarine Rode kleuring van vast weefsel genereert een permanent record van skeletveranderingen die vergelijkingen van verschillende exemplaren kunnen vergemakkelijken. Deze techniek kan nuttig zijn om osteoporose in het zebravismodel te bestuderen, omdat een van de kenmerken van osteoporose de afname van de botmassa is.Verwijder 10 zebravislarven willekeurig uit elke groep negen dagen na de bevruchting en fixeer de vis in één milliliter van 2% paraform aldehyde en 1X PBS gedurende twee uur. Decanteer de oplossing en was de zebravislarve met 100 millimol Tris HCL met een pH van 7,5 of 10 millimol magnesiumchloride. Voor het ontkleuren decanteert u de oplossing en incubeert u de larve gedurende vijf minuten in een reeks oplossingen zoals beschreven in het manuscript.Na de laatste incubatie decanteert u de oplossing en verwijdert u het pigment door te bleken met een oplossing bestaande uit 3% waterstofperoxide en 0,5% kaliumhydroxide. Observeer eens in de 10 minuten totdat het pigment volledig is verwijderd. Spoel de zebravislarve meerdere keren met 25% glycerine, 0,1% kaliumhydroxide gedurende 10 minuten elk totdat er geen bubbels zijn.Kleur in de larve door te weken in een milliliter van 0,01% Alizarine. Decanteer de oplossing en voeg een milliliter van 50% glycerine of 0,1% kaliumhydroxide toe om de achtergrond te verwijderen. Bewaar de vis in verse 50% glycerine of 0,1% kaliumhydroxide voor latere observatie.Breng één larve per keer over op de glasglaas en houd de larve in het midden van de vloeistofdruppel. Observeer de larve onder een stereomicroscoop. Schakel de camera in.Open de software en behoud de standaardinstellingen. Klik op AE en kies een geschikte belichtingstijd om de beste afbeelding te verkrijgen. Leg alle afbeeldingen vast onder dezelfde instellingen.Sla de afbeeldingen op in dot tiff-indeling voor latere analyse. Dubbelklik op het imageJ-pictogram. Om de opgeslagen afbeeldingen te analyseren, klikt u op bestand, vervolgens op openen, klikt u vervolgens op afbeelding en typt u en selecteert u acht-bits.Klik op bewerken en keer om. Klik op analyseren en vervolgens kalibreren. Selecteer Niet-gekalibreerde OD in de pop-upinterface.Controleer de algemene kalibratie linksonder in de onderste interface en klik op OK. Klik op analyseren, stel schaal in en verwijder vervolgens schaal. Controleer hieronder globaal en klik op OK.Klik op analyseren en stel vervolgens metingen in. Selecteer het itemgebied in de pop-upinterface. Controleer de limiet tot de drempel hieronder om alleen het geselecteerde bereik te meten en klik op OK.Klik op afbeelding, pas aan, drempel en schuif de schuifregelaar in het midden van de pop-upinterface. De juiste drempelwaarde selecteren zodat alle te testen doelen in één afbeelding worden geselecteerd. En klik op instellen.Klik op analyseren, meet vervolgens, sla de datums op. Alizarine Red Staining is een gevoelige en specifieke methode voor het meten van veranderingen in botmineralisatie bij zebravislarven. Negen dagen na de bevruchting zijn veel botten van het hoofdskelet zoals parasphenoïde, operculair, ceratobranchiaal en notochord gemineraliseerd en daarom rood gekleurd.Daarentegen lijken niet-benige structuren zoals otolieten bruinzwart. Digitale analyse uitgevoerd om het totale gebeitste gebied te kwantificeren, toonde een significante afname van het gekleurde gebied voor de 10 en 20 milligram per liter loodacetaatbehandelingsgroepen. De veranderingen in botmineralisatie toonden dosisafhankelijkheid.Voor een beter kleuringseffect en observatie is het belangrijk om het oorspronkelijke pigment van zebravislarven te verwijderen en de bubbels na het bleken te verwijderen.

using-alizarin-red-staining-to-detect-chemically-induced-bone-loss

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

This video demonstrates a staining technique for detecting the extent of mineralization or calcium deposition in cultured primary osteoblasts using Alizarin Red dye.

Alizarin Red Staining: A Technique to Visualize Mineralization by Cultured Osteoblasts

In this video, we describe a method for the detection of osteoblast-secreted calcium deposits using an anionic dye, Alizarin Red S. The cultured osteoblasts are first stained and then the dye is recovered for colorimetric quantification of calcium deposits or the degree of osteoblast mineralization.

In Vitro Mineralization Assay: A Colorimetric Method to Quantify Osteoblast Calcium Deposits on Bone Graft Substitute by Alizarin Red S Staining and Extraction

Omdat veel zebravismodellen van neurologische en niet-neurologische ziekten worden bestudeerd in de volwassen vissen dan het embryo / larven ontwikkelden we een kwantitatieve dwarslijn regeneratieve test die kan worden toegepast bij de zebravis ziektemodellen volwassene. De test betrokken resolutie bij de 1) neuromast en 2) individuele haar cel niveaus.

Een test voor laterale lijn Regeneration in Adult zebravis

In deze studie beschrijven we een eenvoudige methode om Evans Blue Dye (EBD) analyse uit te voeren op zebravislarven. Deze techniek is een krachtig hulpmiddel voor de karakterisering van de integriteit van skeletspieren en de afbakening van zebravismodellen van spierdystrofie, en is een waardevolle methode voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische behandelingen.

Analyse van de zebravis Larven skeletspieren Integriteit met Evans Blue Dye

Kleine laboratoriumvissen zijn populaire modellen geworden voor botonderzoek naar de mechanismen die ten grondslag liggen aan menselijke botaandoeningen en voor het screenen van botmodulerende geneesmiddelen. In dit rapport beschrijven we een protocol om het effect van alendronaat op botcellen bij medaka-larven met osteoporose-laesies te beoordelen.

Drug Treatment en<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging van Osteoblast osteoclasten Interacties in een Medaka Fish Osteoporosis Model

Het doel van dit protocol is te wijzigen van de doordringendheid van dodelijke skelet mutant fenotypen in zebrafish door selectief fokken. Dodelijke mutanten naar volwassenheid kunnen niet worden gekweekt en zelf gefokt, dus dit protocol beschrijft een methode voor het bijhouden en selecteren doordringendheid door meerdere generaties nakomelingen testen.

Zebravis dodelijke skelet Mutant doordringendheid verschuiven door nakomelingen testen

Hier beschrijven we 3 volwassen zebrafish letsel modellen en hun gecombineerd gebruik met immunosuppressieve medicamenteuze behandeling. Wij bieden begeleiding over de beeldvorming van het herstel van de weefsels en bot mineralisatie daarin opsporen.

Volwassen Zebrafish letsel modellen te bestuderen van de effecten van prednisolon in het herstel van botweefsel

Dit protocol beschrijft het oogsten en visualiseren van elasmoid schubben van zebravissen tijdens in vivo regeneratie. Bovendien wordt de ex vivo cultuur van deze schubben tot 7 dagen na de oogst gepresenteerd.

Zebravis Scale Regeneratie In Toto en Ex Vivo Kweek van Schubben

Dit protocol biedt een methode om cellulaire dynamica te bestuderen met behulp van een eenvoudige in vitro kweektechniek. Het biedt zebravisonderzoekers en -opvoeders de mogelijkheid om cellulaire processen te bestuderen, zoals die gerelateerd aan bothomeostase en basale celbiologie, door fluorescerende kernen en apoptotische cellen binnen de schalen te visualiseren.

In vitro kweektechniek voor het bestuderen van cellulaire dynamica in zebravisschubben

Dit protocol beschrijft een twee-foton-laserablatiebenadering die wordt uitgevoerd in zebravislarven, die als model dient om botregeneratie en de effecten van de immuunrespons op ablatie te bestuderen.

Twee-foton laser-gemedieerde ablatie van osteoblasten in zich ontwikkelende zebravislarven

Het hier beschreven protocol presenteert een eenvoudige en gemakkelijk te volgen procedure voor het kleuren en ontleden van craniofaciale kraakbeenderen in een 5 dagen oude zebravislarve. Het kan worden gebruikt om de anatomie, vorm en grootte van deze structuren onder verschillende ontwikkelingsomstandigheden te bestuderen.

Dissectie van Zebravis craniofaciale weefsels bij kleuring met Alcian Blue

Leer alizarine rode kleuring om chemisch geïnduceerd botverlies bij zebravislarven te detecteren. Deze methode genereert een permanente registratie van skeletveranderingen voor toxicologisch onderzoek.

Alizarine rode kleuring gebruiken om chemisch geïnduceerd botverlies bij zebravislarven te detecteren

Meer video's verkennen