Kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie evaluatie van microRNA-expressie in nier en serum van muizen met leeftijdsafhankelijke nierinsufficiëntie
29 april 2022
We presenteren een methode voor het evalueren van microRNA-expressie in de nieren en het serum van muizen met leeftijdsafhankelijke nierinsufficiëntie door kwantitatieve reverse-transcriptie polymerasekettingreactie.
Deze qRT-PCR-methode kan vragen beantwoorden met betrekking tot microRNA-expressieprofilering in serum van muizen in aandoeningen zoals leeftijdsafhankelijke nierinsufficiëntie. De techniek maakt de detectie van microRNA-expressie met hoge nauwkeurigheid en gevoeligheid mogelijk door een eenvoudig proces dat tijd bespaart en technische fouten voorkomt. Om te beginnen, snijd de huid van de buik met behulp van een pincet en een chirurgische schaar.
Snijd de spieren in het peritoneale membraan van de blaas naar de linkeronderrand van de ribben. Til het peritoneale membraan op met een pincet en maak een laterale incisie in de bovenrand met een chirurgische schaar. Vervolg de incisie langs de onderste rand van de ribben.
Identificeer de inferieure vena cava met behulp van twee PBS-bevochtigde wattenstaafjes. Steek een naald van 30 G die aan een spuit van 1 milliliter is bevestigd in de inferieure vena cava en trek aan de spuit. Trek de naald langzaam naar buiten om hemolyse te voorkomen.
Breng het bloed over naar een spitsbuis van 1 milliliter met heparine en meng door om te keren. Centrifugeer de spitsbuis gedurende 10 minuten op 3000 maal G bij kamertemperatuur. Breng het supernatant over in een verse microcentrifugebuis van 1,5 milliliter.
Neem 200 microliter serummonster en voeg 1.000 microliter fenol/op guanidine gebaseerd lysisreagens toe. Vortex het mengsel gedurende 5 seconden en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Voeg 200 microliter chloroform toe en meng door de buis 15 keer om te keren.
Incubeer het monster gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door centrifugatie. Breng het supernatant zonder de pellet te verstoren over in een verse microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Voeg 450 microliter 100% ethanol toe en vortex de buis gedurende 5 seconden.
Laad vervolgens 700 microliter van het monster op een membraanverankerde spinkolom en centrifugeer het. Gooi de doorstroom weg en voeg 700 microliter Wash Buffer 1 toe aan de kit. Centrifugeer opnieuw en gooi de doorstroom weg.
Herhaal het wassen met 500 microliter Wash Buffer 2 om sporenzouten te verwijderen. Voeg 500 microliter 80% ethanol toe, centrifugeer en gooi de doorstroom uit de verzamelbuis weg. Centrifugeer de spinkolom opnieuw en breng de kolom over naar een verse opvangbuis van 1,5 milliliter.
Voeg vervolgens 14 microliter RNase-vrij water toe en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Draai de kolom opnieuw gedurende 1 minuut op 15000 maal G bij kamertemperatuur. Bereid een mastermixoplossing en voeg 8 microliter per put toe in een 8-wells stripbuis.
Voeg 12 microliter van het geëxtraheerde totale RNA in elke buis toe en centrifugeer de buis gedurende 15 seconden bij 2000 maal G bij kamertemperatuur. Plaats de buis in een thermische cycler en start de incubatie om het cDNA te synthetiseren. Breng na incubatie het cDNA over naar een verse microcentrifugebuis.
Verdun het cDNA tienvoudig met gedestilleerd water. Vervolgens vortex, gevolgd door centrifugatie gedurende 5 seconden bij 2000 maal G bij kamertemperatuur. Bereid in een microcentrifugebuis de hoofdmixoplossing zoals beschreven in het tekstprotocol en vortex de oplossing.
Voeg 22,5 microliter aliquots toe in elk putje van een 96-well plaat, gevolgd door 2,5 microliter cDNA. Sluit de plaat af met een zelfklevende film en centrifugeer de plaat gedurende 30 seconden op 1000 keer G.Plaats de plaat in het real-time PCR-systeem. Wijzig de instellingen door een naam voor het experiment op te geven.
Selecteer vervolgens 96-well 0,2 milliliter als het experimenttype, vergelijkende CT als de kwantificeringsmethode, standaard als de systeemrun-modus en SYBR Green-reagentia als de reagentia voor het detecteren van de doelsequentie. Geef namen op voor het monster en het miRNA van het doel in elke put. Wijs dubbele monsters toe, kies een referentiemonster en endogene controle en selecteer geen enkele voor de kleurstof om als passieve referentie te gebruiken.
Om reagenskruisbesmetting te elimineren, stelt u negatieve reverse transcriptase en een niet-sjablooncontrole voor miRNA-expressie in. Zorg er vervolgens voor dat het reactievolume is ingesteld op 20 microliter en dat de PCR-cyclusomstandigheden gedurende 15 minuten zijn ingesteld op 95 graden Celsius, vervolgens 40 cycli van denaturatie bij 94 graden Celsius gedurende 15 seconden, gloeien op 55 graden Celsius gedurende 30 seconden en verlenging op 70 graden Celsius gedurende 30 seconden. Nadat het proces is voltooid, klikt u op analyseren om de qRT-PCR-gegevens te analyseren.
Controleer of de drempellijn die automatisch door het programma is geselecteerd, geschikt is voor elke put. Controleer de drempelwaarde van de endogene controle en doel miRNA's die in elk monster worden geanalyseerd. Bepaal de CT-waarden door het snijpunt van de versterkingscurve en de drempellijn.
miRNA qRT-PCR-gegevens voor het leeftijdsafhankelijke nierinsufficiëntiemodel toonden aan dat, in vergelijking met SAMR1-controlemuizen, het nierniveau van miRNA-7219-5p significant toenam bij SAMP1-experimentele muizen, terwijl het nierniveau van miRNA-7218-5p daalde. De expressieniveaus van miRNA-223-3p veranderden in geen van beide stammen. De serumspiegels van zowel miRNA-7219-5p als miRNA-7218-5p waren aanzienlijk verhoogd bij de SAMP1-muizen, terwijl de niveaus van miRNA-223-3p onveranderd waren.
U moet de naald in de inferieure vena cava inbrengen en bloed extraheren zonder het vat te penetreren. Deze methode kan worden gebruikt om belangrijke vragen te beantwoorden in de microRNA-expressieprofilering in muizenserum voor een breed scala aan pathologische aandoeningen.
Overzicht
Deze studie presenteert een methode voor kwantitatieve reverse-transcriptie polymerasekettingreactie (qRT-PCR) voor het evalueren van microRNA-expressie in de nieren en het serum van muizen met leeftijdsafhankelijke nierinsufficiëntie. De techniek maakt een hoge nauwkeurigheid en gevoeligheid mogelijk bij het detecteren van microRNA-expressie, wat onderzoek op dit gebied faciliteert.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Biologie
- MicroRNA-onderzoek
Achtergrond
- Micro-RNA's spelen een cruciale rol bij de genregulatie.
- Leeftijdsafhankelijke nierinsufficiëntie beïnvloedt de expressie van micro-RNA.
- Het begrijpen van micro-RNA-profielen kan inzicht bieden in nierziekten.
- qRT-PCR is een veelgebruikte methode voor het analyseren van RNA-expressie.
Doel van de studie
- Om de microRNA-expressie bij muizen met nierinsufficiëntie te evalueren.
- Om een betrouwbare qRT-PCR-methode vast te stellen voor serum- en niermonsters.
- Om specifieke microRNA's te identificeren die geassocieerd zijn met leeftijdsgerelateerde nierveranderingen.
Gebruikte methoden
- Verzamelen van serum- en niermonsters van muizen.
- Extractie van totaal RNA met behulp van een lysisreagens op basis van fenol/guanidine.
- cDNA-synthese gevolgd door qRT-PCR voor microRNA-kwantificering.
- Analyse van qRT-PCR-gegevens om de expressieniveaus van doelmicroRNA's te bepalen.
Belangrijkste resultaten
- Bij SAMP1-muizen namen de spiegels van miRNA-7219-5p in de nieren significant toe.
- De spiegels van miRNA-7218-5p in de nieren namen af bij SAMP1-muizen.
- De serumspiegels van miRNA-7219-5p en miRNA-7218-5p waren aanzienlijk verhoogd.
- De spiegels van miRNA-223-3p bleven ongewijzigd in beide stammen.
Conclusies
- De qRT-PCR-methode brengt de expressie van microRNA bij nierinsufficiëntie effectief in kaart.
- Specifieke microRNA's zijn geassocieerd met leeftijdsafhankelijke nierveranderingen.
- Deze methode kan worden toegepast om diverse pathologische aandoeningen te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie op directieniveau
Nauwkeurige microRNA-expressieprofilering in de nier en het serum maakt vroege detectie van leeftijdsafhankelijke mechanismen van nierinsufficiëntie mogelijk, wat de validatie van targets in preklinische modellen ondersteunt. Deze qRT-PCR-methode levert kwantitatieve, reproduceerbare gegevens die het voorspellende vertrouwen in biomarker-ontdekkingspipelines vergroten. Het vult een kritisch gat in de standaardisatie van miRNA-analyse voor translationeel nieronderzoek.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door de expressieveranderingen van miRNA-7218-5p en miRNA-7219-5p in de nier en het serum te kwantificeren.
- Operationele waarde: Biedt een betrouwbare methode voor het extraheren en evalueren van miRNA uit biologische muizenmonsters, waardoor de technische variabiliteit wordt verminderd.
- Strategische waarde: Ondersteunt de biologische risicoreductie van renale targets door miRNA-dysregulatiepatronen in leeftijdsafhankelijke impairmentsmodellen te verduidelijken.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve CT-waarden uit qRT-PCR, waardoor gestandaardiseerde meting van miRNA-expressie over verschillende monstertypes mogelijk wordt.
- Operationele waarde: Vestigt een reproduceerbare workflow voor miRNA-extractie uit serum en nier, cDNA-synthese en amplificatie.
- Strategische waarde: Faciliteert de gereedheid van assays voor screeningcampagnes gericht op miRNA-gemedieerde pathways in modellen van nierziekten.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Verduidelijkt de relatie tussen miRNA-niveaus in de nieren en het serum, wat de vertaling van biomarkers van weefsel naar biofluïda ondersteunt.
- Operationele waarde: Maakt longitudinale monitoring van miRNA-7218-5p en miRNA-7219-5p mogelijk in preklinische modellen van nierinsufficiëntie.
- Strategische waarde: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door mechanistische inzichten te bieden in ouderdomsgerelateerde nierveranderingen.
Integratie van Pijplijn & Workflow
Deze methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van het testen van doelhypotheses tot preklinische validatie, in het bijzonder voor renale fibrose en verouderingsgerelateerde pathways.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing door significante veranderingen in miRNA-expressie tussen controlegroepen en aangetaste muizenstammen te detecteren.
- Screening: Levert reproduceerbare kwantitatieve resultaten (CT-waarden) die vergelijking van miRNA-niveaus over verschillende experimentele condities mogelijk maken.
- Analytiek: Maakt gebruik van de vergelijkende CT-methode met endogene controles om expressiedata te normaliseren, wat betrouwbare vergelijkingen tussen monsters waarborgt.
- Translationeel onderzoek: Verbindt miRNA-veranderingen in de nier met detecteerbare veranderingen in het serum, ter ondersteuning van de ontwikkeling van non-invasieve biomarkers.
- Herbruikbaarheid binnen de organisatie: Stelt een gestandaardiseerd protocol vast voor miRNA-kwantificering dat kan worden hergebruikt in meerdere modellen van nierziekten.
Operationele & Bedrijfsmatige Impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in targetvalidatie door nauwkeurige, gevoelige detectie van veranderingen in de miRNA-expressie.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie tussen laboratoria door het definiëren van duidelijke stappen voor RNA-extractie en qRT-PCR.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door mechanistische data te leveren voor risicoreductie van miRNA-gestuurde renale pathways.
- Impact op portfolio: Maakt risicogebaseerde prioritering van targets mogelijk op basis van consistente miRNA-dysregulatie in preklinische modellen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in RNA-behandeling, reverse transcriptie en qRT-PCR-instrumentatie.
- Afhankelijk van toegang tot fenol/guanidine-lysereagentia, spin-kolommen en real-time PCR-systemen met SYBR Green-detectie.
- Noodzaakt standaardisatie van endogene controles en referentiemonsters over teams heen voor comparatieve CT-analyse.
- Houdt rekening met adaptaties bij het toepassen van het protocol op verschillende muizenstammen of monstervolumes.
- Omvat praktische beperkingen, zoals de noodzaak voor zorgvuldige bloedafname om hemolyse te voorkomen en juiste incubatietijden tijdens de extractie.
