Name: Gecontroleerde semi-geautomatiseerde lasergeïnduceerde verwondingen voor het bestuderen van spinale regeneratie bij zebravislarven (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Leer een gecontroleerde laserverwondingstechniek voor spinale regeneratieonderzoek bij Danio rerio larven. Deze methode minimaliseert schade aan omliggend weefsel en verbetert reproduceerbaarheid.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door de BBSRC (BB/S0001778/1). CR wordt gefinancierd door het Princess Royal TENOVUS Scotland Medical Research Scholarship Programme. We danken David Greenald (CRH, University of Edinburgh) en Katy Reid (CDBS, University of Edinburgh) voor het vriendelijke geschenk van transgene vis (zie aanvullend bestand). We bedanken Daniel Soong (CRH, University of Edinburgh) voor de vriendelijke toegang tot de 3i spinning-disk confocal.

Alle dierstudies werden uitgevoerd met goedkeuring van het Britse ministerie van Binnenlandse Zaken en volgens zijn voorschriften, onder projectlicentie PP8160052. Het project werd goedgekeurd door de University of Edinburgh Institutional Animal Care and Use Committee. Voor experimentele analyses werden zebravislarven tot 5 dagen oud van beide geslachten gebruikt van de volgende beschikbare transgene lijnen: Tg (Xla.Tubb: DsRed;mpeg1: GFP), Tg (Xla.Tubb: DsRed), Tg (betaactin: utrophin-mCherry), Tg (Xla.Tubb: GCaMP6s) en Tg (mnx1: gfp) (zie aanvullend bestand 1 met betrekking tot het genereren van de transgene zebravislijnen). Een schema van het protocol met behulp van het geautomatiseerde zebravislarvenverwerkingsplatform is weergegeven in figuur 1. Alle aangepaste software, scripts en gedetailleerde experimentele protocollen die in dit werk worden gebruikt, zijn beschikbaar op https://github.com/jasonjearly/micropointpy/.
1. Monstervoorbereiding
<ol><li>Sorteer de embryo's 5 uur na de bevruchting voor het juiste ontwikkelingsstadium21. Gooi dode eieren en slecht ontwikkelde en overontwikkelde embryo's weg.</li>
	<li>Verdoof de larven 3 dagen na de bevruchting (dpf) door 2 ml 0,4% aminobenzoëzuur-ethylmethylester toe te voegen aan 50 ml visfaciliteitswater in een petrischaaltje van 90 mm. Gebruik dieren die zijn grootgebracht met fenylethiourea (PTU) (zie tabel met materiaal) om huidpigmentatie te voorkomen als dit een probleem is, wat niet het geval is voor ruggenmergletsels op 3 dpf-larven die in dit protocol worden beschreven. OPMERKING: Deze relatief hoge verdovingsconcentratie wordt gebruikt om bewegingen van de larven na de laserinslag te voorkomen.</li>
	<li>Screen de embryo's op fluorescerende reporterexpressie (Aanvullend dossier 1). OPMERKING: Een fluorescerende verslaggever voor het ruggenmerg (of een andere structuur van belang) is vaak nodig om de efficiëntie van het letsel te beoordelen. Het gebruik van tg (Xla.Tubb: DsRed) helpt bij het identificeren van het ruggenmerg.</li>
	<li>Breng de geselecteerde larven over in een plaat met 96 putten voor gebruik in het VAST-systeem (zie Tabel met materialen) met 300 μL visfaciliteitswater per put. Gebruik het medium met het verdovingsmiddel uit de 90 mm petrischaal direct. Zorg ervoor dat je maar één larve per put hebt. Maak een extra lege 96-well plaat om de laesielarven te verzamelen. OPMERKING: Als u een ander laserlaesiesysteem gebruikt, monteer de larven dan in 1% low-melting point (LMP) agarose-gel in een geschikte observatiekamer.</li>
</ol>2. Microscoop voorbereiding
<ol><li>Schakel alle systeemcomponenten in (VAST, microscoop, laser, pc), inclusief de laser voor ablatie.</li>
	<li>Zodra de hardware volledig is geïnitialiseerd, start u de microscoopsoftware, ImageJ / Fiji, een python integrated development environment (IDE) en de software voor geautomatiseerde zebravisbeeldvorming (VAST-systeem) als u dit platform gebruikt (zie Tabel met materialen).</li>
	<li>Stel de VAST-software in volgens de onderstaande stappen.<ol>
<li>Wanneer de VAST-software wordt gestart, kiest u Plate in het eerste venster en klikt u op de knop Gereed (Figuur 2A). Er verschijnt nog een klein venster met de vraag of het capillair leeg en schoon is. Controleer door naar de afbeelding van het capillair te kijken of er luchtbellen in zitten. Zo niet, klik dan op Ja. Als er bubbels zijn, klikt u op Nee en volgt u stap 2.3.2-2.3.3 (figuur 2B).</li>
		<li>Klik in het venster Large Particle (LP) Sampler op Prime om luchtbellen te verwijderen (Figuur 2C).</li>
		<li>Ga naar het hoofdvenster van de software (met de capillaire afbeelding) en klik met de rechtermuisknop op de afbeelding. Selecteer Lege capillaire afbeelding opnemen in het pop-upmenu (Afbeelding 2B).</li>
		<li>Ga in het venster LP Sampler naar het menu Bestand en selecteer de optie Script openen . Kies een bestand met het script dat overeenkomt met het uit te voeren experiment.</li>
		<li>Ga in het hoofdvenster van de VAST-software naar Bestand en kies Experiment openen. Kies het experimentbestand dat overeenkomt met het geplande experiment. OPMERKING: Zorg ervoor dat de vakjes Automatisch lossen en Bulkuitvoer naar afval NIET zijn aangevinkt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stel de microscoopsoftware in voor beeldvorming.<ol>
<li>Start de microscoopbeeldvormingssoftware (zie Tabel met materialen) om de hardware te initialiseren. Dit kan enkele minuten duren, afhankelijk van het systeem.</li>
		<li>Ga naar de acquisitie-instellingen en stel de microscoop in voor het afbeelden van de fluorofoor die in de larven tot expressie komt. Gebruik een 10x NA 0,5 waterdipobjectief om ervoor te zorgen dat het brandpuntsvolume lang genoeg langs de optische as is om de hele diepte van het ruggenmerg of het beoogde weefsel te laeseren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stel ImageJ/Fiji in voor laserlaesies.<ol>
<li>Ga naar het menu Bestand , kies Nieuw/Script om het scriptvenster te openen.</li>
		<li>Ga in het venster Nieuw naar het menu Bestand en kies Openen om het laserlaesiescript (Manual_MP_Operation.ijm) te laden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stel de Python IDE in.<ol>
<li>Start de Python IDE.</li>
		<li>Ga naar het menu Bestand en kies Bestand openen om het script te laden om de laser te beheren (Watch_for_ROIs_py3.py).</li>
		<li>Ga naar het menu Uitvoeren en kies Uitvoeren zonder foutopsporing om het script uit te voeren. Controleer of er een reeks berichten in het terminalpaneel wordt weergegeven, samen met wat ruis terwijl de laserverzwakker wordt geïnitialiseerd (afbeelding 2D).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Het uitvoeren van laserlaesies op het VAST-systeem
<ol><li>Centreer het capillair ten opzichte van het microscoopobjectief door het podium te verplaatsen door op de pijlknoppen in het hoofdvenster van de VAST-software te klikken (figuur 2B).</li>
	<li>Focus op de bovenkant van het capillair door door de oculairs te kijken en het doorgelaten licht van de microscoop te gebruiken. LET OP: Het capillair is erg fragiel en kan breken als het door het doel wordt aangeraakt. Beweeg de microscoopknop langzaam bij het in- en uitstellen.</li>
	<li>Plaats de 96-putplaten op de plaathouder van de LP Sampler van het VAST systeem. Plaats de plaat met larven op de linker houder en de plaat voor verzameling aan de rechterkant. Zorg ervoor dat de platen correct zijn georiënteerd: de A1-put moet zich in de linkervoorhoek van de houder bevinden.</li>
	<li>Klik in de VAST-software in het LP Sampler-venster op de knop Plaatsjabloon en selecteer alle putten met larven. Klik op de knop OK om het venster te valideren en te sluiten (afbeelding 2C).</li>
	<li>Klik in het LP Sampler-venster op de knop Plaat uitvoeren om te beginnen met het laden van een larve. OPMERKING: Na enige tijd moet de larve zichtbaar zijn in de capillaire positie (vooraf gedefinieerd in het experimentdefinitiebestand), waardoor het ruggenmerg kan worden verwond. Het VAST-baklampje gaat na een paar rotaties uit om de larve in te stellen met de zijdelingse zijde naar het microscoopobjectief gericht.</li>
	<li>Ga naar de microscoopsoftware en klik op de live-knop om de larve in beeld te brengen.</li>
	<li>Draai aan de focusknop van de microscoop totdat het centrale kanaal van het ruggenmerg zichtbaar is. OPMERKING: Het kan gemakkelijker zijn om eerst scherp te stellen met behulp van doorgelaten licht en vervolgens te verfijnen met fluorescentie.</li>
	<li>Maak een momentopname in fluorescentie en sla de afbeelding op in een speciale map.</li>
	<li>Open de afbeelding in ImageJ en pas indien nodig het contrast aan (met behulp van het menu Afbeelding/Aanpassen/Helderheid/contrast... in AfbeeldingJ).</li>
	<li>Klik op het regelgereedschap Region of Interest (ROI) en teken een korte lijn (20 μm) gecentreerd op het ruggenmerg (figuur 3A).</li>
	<li>Zet de microscoop in de 100% reflecterende spiegelstand.</li>
	<li>Laad het ImageJ-script en klik op de knop Uitvoeren . Gebruik de volgende parameters: Herhaling - 2; Voorbeeld - 1; Breedte - 40-micron; Demping - 89 (volledig laservermogen) (figuur 3C).</li>
	<li>Wanneer de laseropnamesequentie is voltooid, schakelt u over naar fluorescentiebeeldvorming op de beeldvormingssoftware en past u de focus indien nodig aan. OPMERKING: Een verschuiving in focus wordt vaak waargenomen als gevolg van staartverplaatsing tijdens laserblootstelling.</li>
	<li>Maak een nieuwe momentopname en sla deze op.</li>
	<li>Open deze nieuwe afbeelding in ImageJ en teken een nieuwe lijn die groter moet zijn dan het ruggenmerg zelf (~ 80 μm), beginnend onder de ventrale kant van het ruggenmerg in het bovenste deel van het notochord en naar de dorsale kant om te eindigen in de ruimte tussen het ruggenmerg en de huid (figuur 3B).</li>
	<li>Zet de microscoop in de 100% reflecterende spiegelstand.</li>
	<li>Ga naar het ImageJ-scriptvenster en klik op de knop Uitvoeren . Gebruik de volgende parameters: Herhaling - 2; Voorbeeld - 1; Breedte - 40 micron; Demping - 89 (Volledig laservermogen).</li>
	<li>Nadat de (langere) laseropnamesequentie is voltooid, controleert u de transsectiekwaliteit door fluorescentie en scherpstelling in beeld te brengen. Zorg ervoor dat er geen cel of axonen intact blijven op de plaats van de laesie, die moet verschijnen als een donker of als een zwak en homogeen fluorescerend gebied (figuur 3D, onderste paneel).</li>
	<li>Verzamel de laesielarven in de lege 96-putplaat (met dezelfde putcoördinaties als die van de oorspronkelijke put) door naar het hoofdvenster van de VAST-software te gaan en op de knop Verzamelen te klikken.</li>
	<li>Schakel het VAST-systeemlampje weer in door op het selectievakje Ladelampje linksonder in het venster te klikken.</li>
	<li>Herhaal stap 3.3-3.17 voor elke nieuwe larve die gewond raakt.</li>
</ol>4. Behandeling na laesie en aanvullende experimenten
<ol><li>Haal larven zo snel mogelijk uit de 96-putplaat en breng ze over naar een schone petrischaal met vers viswater zodat de larven zich na de laesie kunnen herstellen. Doe de petrischaal in een couveuse op 28 °C. OPMERKING: De schade blijft zich vaak voortplanten in het eerste uur na de laesie. De werkelijke omvang van de laesie moet dus worden beoordeeld door fluorescentiebeeldvorming na een vertraging van ongeveer 1 uur.</li>
</ol>5. Problemen oplossen
<ol><li>Als er luchtbellen aanwezig zijn in de buizen en het capillair van het VAST-systeem, klikt u op de prime-knop in het LP Sampler-venster om ze te verwijderen.</li>
	<li>Overweeg de mislukte laesies (zoals beoordeeld op basis van de resterende fluorescentie op de laesieplaats, afgezien van de verwachte resterende en homogene achtergrond), die te wijten kunnen zijn aan verschillende redenen die hieronder worden genoemd.<ol>
<li>Laag laservermogen: Wanneer dit gebeurt, probeer het dan met een hogere waarde. OPMERKING: Het VAST-systeem is uitgerust met een verflaser. Dit impliceert dat de concentratie van de kleurstofoplossing die wordt gebruikt voor het genereren van laserlicht in de loop van de tijd kan veranderen, wat leidt tot een afname van het laservermogen. Vervangen door een nieuwe oplossing lost het probleem meestal op22.</li>
		<li>Slechte kalibratie: Controleer in dit geval de kalibratie en het vermogen van het lasersysteem volgens stap 5.2.2.1-5.2.2.4. Indien niet correct gekalibreerd, wordt de laser niet naar de gewenste locatie geleid, wat leidt tot mislukte laesies of ongewenste schade in aangrenzende weefsels.<ol>
<li>Plaats een spiegelschuif bovenop de capillaire kamer. Focus op de gecoate kant (het moet het doel onder ogen zien). Gebruik een eerdere standaardinstelling in de dia om gemakkelijker scherp te stellen.</li>
			<li>Pas een patroon van laserablatie toe met behulp van een kalibratiescript.</li>
			<li>Beoordeel de kwaliteit van het patroon. De vlekken of lijnen moeten scherp lijken en niet wazig.</li>
			<li>Gebruik een helling met toenemend vermogen om te evalueren of het laservermogen is veranderd in vergelijking met de vorige sessies.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Larvale beweging tijdens laesies: Larven reageren anders op anesthesie; de laserlaesie kan dus tijdens het proces bewegingen van de staart veroorzaken, waardoor een succesvolle transsectie wordt voorkomen. Wanneer dit gebeurt, neemt u een extra iteratie van de laserlaesiestappen om het te voltooien terwijl u nog steeds schade aan de omliggende weefsels voorkomt.</li>
		<li>Slechte focus: Wanneer dit gebeurt, concentreer je dan op het midden van het centrale kanaal om de beste resultaten te krijgen.</li>
		<li>ROI-tekening, positie en grootte: de positie en grootte van de ROI zijn van cruciaal belang voor succesvolle transsecties. De ROI moet groter zijn dan het ruggenmerg en gecentreerd op het midden van het ruggenmerg. Om dit op te lossen, begin je de ROI van de ventrale kant van het ruggenmerg te trekken en ga je omhoog naar de dorsale kant om een succesvolle transsectie te verkrijgen. Dit is waarschijnlijk te wijten aan staartbewegingen veroorzaakt door de opeenvolging van laserschoten tijdens de ablatieprocedure.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Becker, C. G., Becker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+zebrafish+as+a+model+for+successful+central+nervous+system+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Restorative+Neurology+and+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration.</a> Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).</li>
<li>Ohnmacht, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+motor+neurons+are+regenerated+after+mechanical+lesion+and+genetic+ablation+in+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Spinal motor neurons are regenerated after mechanical lesion and genetic ablation in larval zebrafish.</a> Development. 143 (9), 1464-1474 (2016).</li>
<li>Anguita-Salinas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+dynamics+during+spinal+cord+regeneration+in+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cellular dynamics during spinal cord regeneration in larval zebrafish.</a> Developmental Neuroscience. 41 (1-2), 112-122 (2019).</li>
<li>Chapela, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+zebrafish+drug+screening+platform+boosts+the+discovery+of+novel+therapeutics+for+spinal+cord+injury+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A zebrafish drug screening platform boosts the discovery of novel therapeutics for spinal cord injury in mammals.</a> Scientific Reports. 9, 1-12 (2019).</li>
<li>Schlüßler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+mapping+of+spinal+cord+growth+and+repair+in+living+zebrafish+larvae+by+brillouin+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanical mapping of spinal cord growth and repair in living zebrafish larvae by brillouin imaging.</a> Biophysical Journal. 115 (5), 911-923 (2018).</li>
<li>Cavone, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+macrophage+subpopulation+signals+directly+to+progenitor+cells+to+promote+regenerative+neurogenesis+in+the+zebrafish+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A unique macrophage subpopulation signals directly to progenitor cells to promote regenerative neurogenesis in the zebrafish spinal cord.</a> Developmental Cell. 56 (11), 1617-1630 (2021).</li>
<li>Keatinge, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+gRNA+phenotypic+screening+in+zebrafish+reveals+pro-regenerative+genes+in+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">CRISPR gRNA phenotypic screening in zebrafish reveals pro-regenerative genes in spinal cord injury.</a> PLoS Genetics. 17 (4), 1-21 (2021).</li>
<li>National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://nc3rs.org.uk">https://nc3rs.org.uk</a> (2021).</li>
<li>Hui, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+wide+expression+profiling+during+spinal+cord+regeneration+identifies+comprehensive+cellular+responses+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Genome wide expression profiling during spinal cord regeneration identifies comprehensive cellular responses in Zebrafish.</a> PLOS ONE. 9 (1), 1-23 (2014).</li>
<li>Vasudevan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerated+interneurons+integrate+into+locomotor+circuitry+following+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Regenerated interneurons integrate into locomotor circuitry following spinal cord injury.</a> Experimental Neurology. 342, 1-10 (2021).</li>
<li>Becker, T., Becker, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+cell+interactions+allow+spinal+cord+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Dynamic cell interactions allow spinal cord regeneration in zebrafish.</a> Current Opinion in Physiology. 14, 64-69 (2020).</li>
<li>Wehner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+controls+pro-regenerative+Collagen+XII+in+functional+spinal+cord+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling controls pro-regenerative Collagen XII in functional spinal cord regeneration in zebrafish.</a> Nature Communications. 8 (126), 1-16 (2017).</li>
<li>Briona, L. K., Dorsky, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+transection+in+the+larval+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualised+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Spinal cord transection in the larval Zebrafish.</a> Journal of Visualised Experiments: JoVE. (87), (2014).</li>
<li>Kamei, C. N., Liu, Y., Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+regeneration+in+adult+Zebrafish+by+gentamicin+induced+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Kidney regeneration in adult Zebrafish by gentamicin induced injury.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), (2015).</li>
<li>Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP-induced+repair+of+zebrafish+spinal+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits.</a> Science. 305 (5681), 254-258 (2004).</li>
<li>Xu, Y., Chen, M., Hu, B., Huang, R., Hu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+mitochondrial+transport+in+single-axon+regeneration+of+zebrafish+mauthner+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of mitochondrial transport in single-axon regeneration of zebrafish mauthner cells.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11 (4), 1-12 (2017).</li>
<li>Nichols, E. L., Smith, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+regeneration+of+the+sensory+root+via+axonal+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Functional regeneration of the sensory root via axonal invasion.</a> Cell Reports. 30 (1), 9-17 (2020).</li>
<li>Ellström, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+injury+in+zebrafish+induced+by+near-infrared+femtosecond+laser+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Spinal cord injury in zebrafish induced by near-infrared femtosecond laser pulses.</a> Journal of Neuroscience Methods. 311, 259-266 (2016).</li>
<li>Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+exit+the+CNS+in+spinal+root+avulsion%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">Microglia exit the CNS in spinal root avulsion.</a> PLOS Biology. 17 (2), 1-30 (2019).</li>
<li>Early, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+high-resolution+in+vivo+screen+in+zebrafish+to+identify+chemical+regulators+of+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">An automated high-resolution in vivo screen in zebrafish to identify chemical regulators of myelination.</a> eLife. , 1-31 (2018).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the Zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>AndOr Micropoint Manual. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://andor.oxinst.com/downloads/view/andor-micropoint-manual">https://andor.oxinst.com/downloads/view/andor-micropoint-manual</a> (2021).</li>
<li>Knafo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensory+neurons+control+the+timing+of+spinal+microcircuit+selection+during+locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Mechanosensory neurons control the timing of spinal microcircuit selection during locomotion.</a> eLife. 6, 25260(2017).</li>
<li>Tsarouchas, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+control+of+proinflammatory+cytokines+Il-1%CE%B2+and+Tnf-%CE%B1+by+macrophages+in+zebrafish+spinal+cord+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Dynamic control of proinflammatory cytokines Il-1β and Tnf-α by macrophages in zebrafish spinal cord regeneration.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li>
<li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li>
<li>Howell, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHowell%2C+D+%22Statistical+methods+for+psychology%22">Statistical methods for psychology</a>. , Duxbury. 324-325 (2002).</li>
<li>Tukey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+individual+means+in+the+analysis+of+variance%5BTitle%5D)+AND+%22Biometrics%22%5BJournal%5D)">Comparing individual means in the analysis of variance.</a> Biometrics. 5 (2), 99-114 (1949).</li>
<li>Song, M., Mohamad, O., Chen, D., Yu, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+development+of+voltage-gated+Na%2B+and+K%2B+currents+regulates+functional+maturation+of+forebrain+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Coordinated development of voltage-gated Na+ and K+ currents regulates functional maturation of forebrain neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells and Development. 22 (10), 1551-1563 (2013).</li>
<li>Hong, S., Lee, P., Baraban, S., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+long-term%2C+multi-channel+and+non-invasive+electrophysiology+platform+for+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A novel long-term, multi-channel and non-invasive electrophysiology platform for Zebrafish.</a> Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).</li>
<li>Menelaou, E., McLean, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+control+of+locomotion+by+distinct+types+of+spinal+V2a+interneurons+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Hierarchical control of locomotion by distinct types of spinal V2a interneurons in zebrafish.</a> Nature Communications. 10, 1-12 (2019).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Er is dringend behoefte aan een dieper begrip van de processen die spelen tijdens regeneratie bij zebravissen. Dit diermodel biedt veel voordelen voor biomedisch onderzoek, in het bijzonder voor ruggenmergletsels1. De meeste studies hebben betrekking op handmatige laesies die een goed opgeleide operator vereisen en schade aan meerdere weefsels veroorzaken. Een laserlaesieprotocol wordt hier gepresenteerd, waardoor controle over de laesiekenmerken en verminderde schade aan de omliggende weefsels mo...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63259">Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae</a>. The title was&#160;updated.
The title was updated from:
Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
to:
Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63259">Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae</a>. The Title was&#160;updated.

Erratum:Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

In tegenstelling tot zoogdieren kunnen zebravissen (Danio rerio) hun centrale zenuwstelsel (CZS) herstellen na een verwonding1. Het gebruik van zebravislarven als model voor regeneratie van het ruggenmerg is relatief recent. Het is waardevol gebleken om de cellulaire en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan reparatie2 te onderzoeken. Dit komt door het gemak van manipulatie, de korte experimentele cyclus (elke week nieuwe larven), de optische transparantie van de weefsels en de kleine omvang van de larven, bij uitstek geschikt voor in vivo fluorescentiemicroscopie.
In het geval van regeneratie van het ruggenmerg zijn twee extra voordelen van het gebruik van larven de snelheid van herstel, een paar dagen in vergelijking met een paar weken voor volwassenen, en het gemak van het induceren van verwondingen met behulp van handmatige technieken. Dit is met succes gebruikt in vele studies3,4,5, waaronder recente onderzoeken6,7. Over het algemeen leidt dit tot een verhoogde zinvolle gegevensproductie, een hoog aanpassingsvermogen van experimentele protocollen en lagere experimentele kosten. Het gebruik van larven jonger dan 5 dagen na de bevruchting vermindert ook het gebruik van dieren volgens de 3R-principes in dieronderzoek8.
Na een dwarslaesie bij zebravislarven treden veel biologische processen op, waaronder ontstekingsreactie, celproliferatie, neurogenese, migratie van overlevende of nieuw gegenereerde cellen, reformatie van functionele axonen en een wereldwijde remodellering van neurale processen circuits en wervelkolomweefsels6,7,9,10 . Om met succes te worden georkestreerd, omvatten deze processen een fijn gereguleerde interactie tussen een reeks celtypen, extracellulaire matrixcomponenten en biochemische signalen11,12. Het ontrafelen van de details van deze belangrijke reorganisatie van een complex weefsel zoals het ruggenmerg vereist het gebruik en de ontwikkeling van nauwkeurige en gecontroleerde experimentele benaderingen.
Het primaire experimentele paradigma dat wordt gebruikt om spinale regeneratie bij zebravissen te bestuderen, is het gebruik van chirurgische middelen om weefselschade te induceren door resectie, steken of cryo-letsel3,13. Deze benaderingen hebben het nadeel dat specifieke training in microchirurgische vaardigheden vereist is, wat tijdrovend is voor elke nieuwe operator en het gebruik ervan in kortetermijnprojecten kan voorkomen. Bovendien veroorzaken ze meestal schade aan de omliggende weefsels, wat de regeneratie kan beïnvloeden.
Een andere benadering is om celbeschadiging chemisch te induceren14 of door genetische manipulaties15. Dit laatste zorgt voor zeer gerichte schade. Een dergelijke techniek vereist echter lang voorbereidend werk om nieuwe transgene vissen te genereren voordat een experiment wordt uitgevoerd, vernieuwd telkens wanneer een uniek celtype wordt gericht.
Er is dus behoefte aan een methode die gerichte maar veelzijdige laesies mogelijk maakt die geschikt zijn voor een verscheidenheid aan onderzoeken naar regeneratie. Een oplossing is om een laser te gebruiken om gelokaliseerde schade in het weefsel van belang te induceren16,17,18,19,20. Inderdaad, het gebruik van laser-geïnduceerde weefselschade biedt een robuuste aanpak voor het genereren van ruggenmerglaesies met veel voordelen. De microscopen uitgerust met dergelijke lasermanipulatiemodules maken het mogelijk om een aangepast gevormd gebied te specificeren waar celablatie zal plaatsvinden, met het extra voordeel van temporele controle. De grootte en positie van de laesie kunnen zo worden aangepast om eventuele vragen te beantwoorden.
Het ontbrekende kenmerk van de meeste laserlaesiesystemen is de mogelijkheid om verwondingen op een zeer reproduceerbare manier te induceren voor een reeks larven. Hier wordt een origineel protocol beschreven met behulp van een UV-laser om semi-geautomatiseerde precieze en gecontroleerde laesies in zebravislarven te induceren op basis van een microfluïdisch platform dat is ontworpen voor geautomatiseerde larvenverwerking21. Bovendien worden larven in het hier gepresenteerde systeem ingebracht in een glazen capillair, waardoor het dier vrij rond zijn rostrocaudale as kan draaien. De gebruiker kan kiezen welke kant van de larve aan de laser wordt gepresenteerd, terwijl fluorescentiebeeldvorming de laserstraal nauwkeurig kan richten en de schade na de laesie kan beoordelen.
Het hier beschreven protocol wordt gebruikt met een semi-geautomatiseerd zebravislarve beeldvormingssysteem in combinatie met een draaiende schijf uitgerust met een UV-laser (hierna aangeduid als het VAST-systeem). De belangrijkste punten van het protocol en de meeste claims van de techniek zijn echter geldig voor elk systeem dat is uitgerust met een laser die in staat is tot celablatie, inclusief laserscanmicroscopen met twee fotonen, spinning-disk microscopen voorzien van een UV-laser (FRAP-module) of videomicroscopen met een lasermodule voor fotomanipulatie. Een van de belangrijkste verschillen tussen het VAST-systeem en de conventionele monsterbehandeling zal zijn dat voor de laatste, het monteren van larven in agarose met een laag smeltpunt op glazen afdekkingsplaten / petrischalen met glazen bodem in plaats van ze in een 96-putplaat te laden, vereist is.
De voordelen van deze methode bieden kansen voor innovatief onderzoek naar de cellulaire en moleculaire mechanismen tijdens het regeneratieproces. Bovendien maakt de hoge datakwaliteit kwantitatief onderzoek in een multidisciplinaire context mogelijk.

<table><tbody><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope software Zen Blue 2.0</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ/FIJI</td><td>Open-Source</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Visual Studio Code</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope en accessoires</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ApoTome microscoop</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) dompelens</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dual AxioCam 506 m CCD camera's</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser scanning confocal microscoop LSM880</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spinning-disk module CSU-X1</td><td>Yokogawa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Staande microscoop Axio Examiner D1</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV laser</td><td>Micropoint</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VAST BioImager</td><td>Union Biometrica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Labware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>90 mm Petri-schaal</td><td>Thermo-Fisher</td><td>101R20</td><td></td></tr><tr><td>96-well plate</td><td>Corning</td><td>3841</td><td></td></tr><tr><td>Chemicaliën</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Click-It EdU Imaging Kit</td><td>Invitrogen</td><td>C10637</td><td></td></tr><tr><td>aminobenzoëzuur-ethylmethylester (MS222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>fenylthioureum (PTU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Antilichamen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-chicken Alexa Fluor 488</td><td>Jackson</td><td>703-545-155</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-mouse Cy3</td><td>Jackson</td><td>715-165-150</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>AB13970</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-tubulin geacetyleerd antilichaam</td><td>Sigma</td><td>T6793</td><td></td></tr><tr><td>Transgene zebravislijnen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tg(beta-actin:utrophin-mCherry)</td><td></td><td>N/A</td><td>Opgezet door David Greenhald, Universiteit van Edinburgh</td></tr><tr><td>Tg(mnx1:gfp)</td><td></td><td>N/A</td><td>Eerst beschreven in [Flanagan-Steet et al. 2005]</td></tr><tr><td>Tg(Xla.Tubb:DsRed)</td><td></td><td>N/A</td><td>Eerst beschreven in [Peri and Nusslein-Volhard 2008]</td></tr><tr><td>Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP)</td><td></td><td>N/A</td><td>Opgezet door Katy Reid, Universiteit van Edinburgh</td></tr><tr><td>Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s)</td><td></td><td>N/A</td><td>Opgezet door David Greenhald, Universiteit van Edinburgh</td></tr></tbody></table>

gecontroleerde semi-geautomatiseerde lasergeïnduceerde verwondingen voor het bestuderen van spinale regeneratie bij zebravislarven

Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

Zebravislarven bezitten slechts enkele dagen na de bevruchting een volledig functioneel centraal zenuwstelsel (CZS) met een hoog regeneratief vermogen. Dit maakt dit diermodel zeer nuttig voor het bestuderen van dwarslaesie en regeneratie. Het standaardprotocol voor het induceren van dergelijke laesies is om het dorsale deel van de romp handmatig te transecteren. Deze techniek vereist echter uitgebreide training en beschadigt extra weefsels. Er werd een protocol ontwikkeld voor lasergeïnduceerde laesies om deze beperkingen te omzeilen, waardoor een hoge reproduceerbaarheid en volledigheid van de dwarsdoorsnede van het ruggenmerg over veel dieren en tussen verschillende sessies mogelijk is, zelfs voor een ongetrainde operator. Bovendien is weefselschade voornamelijk beperkt tot het ruggenmerg zelf, waardoor verstorende effecten van het verwonden van verschillende weefsels, bijvoorbeeld huid, spieren en CZS, worden verminderd. Bovendien zijn hemi-laesies van het ruggenmerg mogelijk. Verbeterd behoud van weefselintegriteit na laserletsel vergemakkelijkt verdere dissecties die nodig zijn voor aanvullende analyses, zoals elektrofysiologie. Daarom biedt deze methode een nauwkeurige controle van de letselomvang die handmatig onhaalbaar is. Dit maakt nieuwe experimentele paradigma's in dit krachtige model in de toekomst mogelijk.

Validatie van ruggenmergtranssectie Structurele en functionele onderzoeken werden uitgevoerd om te beoordelen of het protocol een volledige ruggenmergtranssectie mogelijk maakt.
Ten eerste, om te verifiëren dat het verlies in fluorescentie op de laesieplaats te wijten was aan neuronale weefselbeschadiging en niet aan fluorescentiefotobleaching door de laserverlichting, werd immunostaining uitgevoerd met behulp van een antilichaam tegen geacetyleerde tubuline (zie Ta...

Het huidige protocol beschrijft een methode om weefselspecifieke en zeer reproduceerbare verwondingen bij zebravislarven te induceren met behulp van een laserlaesiesysteem in combinatie met een geautomatiseerd microfluïdisch platform voor het hanteren van larven.

Gecontroleerde semi-geautomatiseerde lasergeïnduceerde verwondingen voor het bestuderen van spinale regeneratie bij zebravislarven

Zebrafish larvae possess a fully functional central nervous system (CNS) with a high regenerative capacity only a few days after fertilization. This makes ...

De techniek die we hier voorstellen, stelt ons in staat om de beperkingen van handmatige laesieprotocollen te overwinnen door schade aan aangrenzende weefsels te verminderen en de reproduceerbaarheid te verbeteren, zelfs voor onervaren operators. Deze techniek stelt ons in staat om precies te kiezen waar we de laesie willen induceren zonder omliggende weefsels te beschadigen dankzij roterende glazen capillair in combinatie met een gerichte UV-laser. Er zijn veel stappen betrokken bij het bedienen van de VAST-apparatuur, dus ik zou aanraden om elke stap af te vinken om ervoor te zorgen dat alles correct wordt gedaan.Begin met het verdoven van de larven met behulp van het medium dat het verdovingsmiddel bevat en breng ze vervolgens over naar een plaat met 96 putten met 300 microliter medium per put. Schakel alle systeemcomponenten in, inclusief de laser voor ablatie. Start vervolgens de geautomatiseerde zebravisbeeldvorming of VAST-software, kies Plate in het eerste venster en klik op de knop Gereed.Er verschijnt een klein venster met de vraag of het capillair leeg en schoon is. Controleer de afbeelding van het capillair op eventuele luchtbellen binnenin. Als er geen luchtbellen in zitten, klikt u op Ja in het pop-upvenster.Ga vervolgens in het venster LP Sampler naar het menu Bestand en selecteer de optie Script openen. Kies een bestand met het script dat overeenkomt met het uit te voeren experiment. Ga vervolgens in het hoofdvenster van vast-software naar Bestand en kies Experiment openen.Kies het experimentbestand dat overeenkomt met het geplande experiment. Start ImageJ/Fiji-software, ga naar het menu Bestand en kies Nieuw script om het scriptvenster te openen. Ga vervolgens naar het menu Bestand en kies Openen om het laserlaesiescript te laden.Om vervolgens de Python IDE te starten, gaat u naar het menu Bestand en kiest u Bestand openen om het script te laden om de laser te beheren. Klik vervolgens op het menu Uitvoeren en kies Uitvoeren zonder foutopsporing om het script uit te voeren. Zorg ervoor dat er een reeks berichten in het terminalpaneel wordt weergegeven, samen met wat ruis terwijl de laserverzwakker wordt geïnitialiseerd.Klik in het hoofdvenster van de VAST-software op de pijlknoppen om het podium te verplaatsen en het capillair ten opzichte van het microscoopobjectief te centreren. Kijk door de oculairs en focus op de bovenkant van het capillair met behulp van het doorgelaten licht van de microscoop. Plaats een 96-well plaat met de larven op de linker plaathouder van de LP sampler.Plaats vervolgens een andere plaat voor verzameling op de rechterplaathouder van de sampler. Zorg ervoor dat de A1-put van de plaat zich in de linkervoorhoek van de houder bevindt. Klik in het LP Sampler-venster van de VAST-software op de knop Plaatsjabloon en selecteer alle putten die larven bevatten.Klik op de knop OK om het venster te valideren en te sluiten. Klik vervolgens op de knop Plaat uitvoeren in het LP Sampler-venster om te beginnen met het laden van de larve. Ga vervolgens naar de microscoopsoftware en klik op de live-knop om de larve in beeld te brengen.Draai de focusknop van de microscoop aan totdat het centrale kanaal van het ruggenmerg zichtbaar is. Maak een momentopname in fluorescentie en sla de afbeelding op in een map. Open de afbeelding in ImageJ en pas indien nodig het contrast aan.Klik op het lijngereedschap van het interessegebied en teken een korte lijn gecentreerd op het ruggenmerg. Schakel de microscoop naar de 100% reflecterende spiegelpositie. Laad het ImageJ-script en stel Herhaling in op 2, Voorbeeld op 1, Breedte op 40 micron en Demping op 89.Nadat u alle parameters hebt ingesteld, klikt u op de knop OK. Wanneer de laseropnamesequentie is voltooid, schakelt u over naar fluorescentiebeeldvorming op de beeldvormingssoftware en past u de focus aan. Maak een nieuwe momentopname en sla deze op.Open deze nieuwe afbeelding in ImageJ en teken een nieuwe lijn die groter is dan het ruggenmerg zelf. Schakel de microscoop naar de 100% reflecterende spiegelpositie. Ga naar het scriptvenster ImageJ en stel Herhaling in op 2, Voorbeeld op 1, Breedte op 40 micron en Demping op 89.Nadat u alle parameters hebt ingesteld, klikt u op de knop OK. Wanneer de laseropnamesequentie is voltooid, controleert u de transsectiekwaliteit door fluorescentie en scherpstelling in beeld te brengen. Zorg ervoor dat er geen cellen of axonen intact blijven op de plaats van de laesie.Ga naar het hoofdvenster van de VAST-software en klik op de knop Verzamelen om de laesielarven in de lege 96-putplaat te verzamelen. Klik vervolgens op het selectievakje-ladelampje om het VAST-systeemlampje weer in te schakelen. Haal de larve zo snel mogelijk uit de 96-putplaat en breng ze over naar een schone petrischaal met vers viswater zodat de larve na de laesie kan herstellen.Zet de petrischaal in een couveuse op 28 graden Celsius. Geacetyleerde tubuline immunokleuring en calciumbeeldvorming geven aan dat laserlaesie de continuïteit van spinale weefsel volledig verstoort. Een intact ruggenmerg is te zien in deze afbeelding.Een volledige verstoring van de axonen tussen de caudale en rostrale zijden van de laesie bevestigt de volledige transsectie van het ruggenmerg. Een voorbeeld van onvolledige transsectie wordt hier getoond. Het getransceerde ruggenmerg op een NBTG cAMP 6-S larve is op deze afbeelding te zien.De rechthoeken tonen de ROIs die worden gebruikt om de fluorescentie-intensiteit in de rostrale en caudale zijden van de laesies te kwantificeren. Het grafische beeld geeft de fluorescentie-intensiteitsverandering in de loop van de tijd weer in de rostrale en caudale analyse-ROI's. De maximale intensiteitsprojectie fluorescentiebeelden van een NBT:dsRed larve vóór de laserlaesie, na drie uur, 24 uur en 48 uur van de laserlaesie worden hier weergegeven.Na 24 uur na het letsel begonnen de wonden te sluiten, wat leidde tot een gedeeltelijk herstel van de oorspronkelijke structuur van het ruggenmerg na 48 uur. Een gedeeltelijke functionele herverbinding werd bevestigd na 48 uur na het letsel met behulp van calciumbeeldvorming. De verhouding tussen de amplitude van de pieken in het caudale gebied en het rostrale gebied vertoonde een toename tussen 3, 24 en 48 uur na het letsel.Macrofaag rekrutering werd waargenomen na laserlaesies met behulp van NBT:dsRed mpeg1 GFP larven laser laesies. Er werd geen verschil waargenomen in het aantal gelabelde cellen tussen handmatige en laserlaesies. Tenzij vis minder dubbel gelabelde cellen vertoonde dan laesievissen in beide laesieomstandigheden.Laserlaesie induceert minder spier- en huidbeschadiging dan handmatige laesie. Het is van cruciaal belang om te controleren of de laesie volledig is of niet. Er mag geen intacte cel of structuur zichtbaar zijn in het laesiegebied, alleen een donkere achtergrond.Om spinale regeneratie te bestuderen, gebruiken we veel methoden, waaronder immuno-histochemie en calciumbeeldvorming. Belangrijk is dat we ook elektrofysiologie kunnen doen, omdat het weefsel bestand is tegen dissectie, in tegenstelling tot handmatig laesiedieren. Deze nieuwe techniek stelt ons in staat om de structurele en functionele weefselorganisatie in het ruggenmerg na een blessure kwantitatief te bestuderen door reproduceerbare en gecontroleerde laesies mogelijk te maken.

controlled-semi-automated-laser-induced-injuries-for-studying-spinal

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Hier beschrijven we een methode voor het monteren van zebravis embryo's voor de lange termijn imaging, twee-foton beeldvorming en weefsel-schade technieken en time-lapse confocale beeldvorming.

Twee-foton axotomy en time-lapse confocale imaging in levende zebravis embryo&#39;s

De werkwijze omvat de hier gepresenteerde precieze schade van levende zebravis embryo's met hoge energie laserpulsen en de analyse van deze letsels en hun herstel met de tijd. We laten ook zien hoe genetisch enkel label of groepen van skeletspiercellen kunnen worden gevolgd tijdens en na de laser-licht veroorzaakte schade.

Laser toegebrachte schade van zebravis Embryonale skeletspier

This video demonstrates a procedure to induce retinal degeneration in adult zebrafish using laser injury. The laser targets photoreceptor cells in the retina, triggering cell death and a degenerative process. This damage activates Müller glia (MG) cells, leading to their dedifferentiation into stem cell progenitors that aid in retinal regeneration.

Modeling Retinal Degeneration and Regeneration in Zebrafish Using a Focal Laser Injury

Source: Volpe, B. A., et al. Confocal Microscope-Based Laser Ablation and Regeneration Assay in Zebrafish Interneuromast Cells. J. Vis. Exp. (2020) This video demonstrates monitoring interneuromast cell recovery in zebrafish using confocal microscopy, tracking cell death and repair through time-lapse fluorescence imaging.

Monitoring Recovery of Laser-Ablated Interneuromast Cells in Zebrafish Using Confocal Microscopy

Hoewel het perifere zenuwstelsel (PNS) in staat is om significant herstel na een blessure, is weinig bekend over de cellulaire en moleculaire mechanismen die dit fenomeen regeren. Met behulp van levende, transgene zebravis en een reproduceerbare zenuw doorsnijding test, kunnen we dynamische gliacel gedrag te bestuderen tijdens zenuw degeneratie en regeneratie.

Motor Nerve doorsnijding en Time-lapse beeldvorming van gliacellen Gedrag Live zebravis

Na spinale doorsnijding, volwassen zebravissen hebben functioneel herstel van zes weken na het letsel. Om te profiteren van larvale transparantie en sneller herstel nemen, presenteren we een methode voor het doorsnijden van de larvale ruggenmerg. Na doorsnijding, zien we zintuiglijke herstel vanaf 2 dagen na het letsel, en C-bocht beweging door 3 dagen na het letsel.

Spinal Cord doorsnijding in het larvale zebravis

Om licht te werpen op de cellulaire en moleculaire mechanismen van neurogenese en regeneratie bij volwassen zebravissen, ontwikkelden we een protocol voor invasieve chirurgie dat mechanische verwondingen veroorzaakt in het volwassen telencephalon van de zebravis en daaropvolgend bewaken van veranderingen in de 'gestoken' hemisfeer door middel van immunohistochemie of in situ hybridisatie.

Steekwond Letsel van de zebravis Adult Telencephalon: Een methode om Onderzoek gewervelde Brain Neurogenese and Regeneration

Gegevensmanipulaties om gerichte stress of dood in individuele cellen te veroorzaken, zijn relatief moeilijk te bereiken. Hier wordt een ablatie-aanpak met een resolutie van één cel beschreven om selectief stress te veroorzaken en individuele cellen in celkweek en levende dieren te doden, gebaseerd op een standaard confocale UV-laser.

Triggering Cell Stress en Dood met behulp van conventionele uv laser confocale microscopie

De zebravis is een populaire diermodel te bestuderen van de mechanismen van Retina degeneratie/regeneratie in gewervelden. Dit protocol beschrijft een methode om gelokaliseerde letsel verstoren het buitenste netvlies met minimale schade aan het innerlijke netvlies veroorzaken. Vervolgens controleren we in vivo de retinale morfologie en de reactie hierop van Müller, glia hele netvlies regeneratie.

Müller Glia cel activatie in een Laser-geïnduceerde Retina degeneratie en regeneratie Model in de zebravis

Laserablatie is een breed toepasbare technologie voor het bestuderen van regeneratie in biologische systemen. Het gepresenteerde protocol beschrijft het gebruik van een standaard laserscanning confocale microscoop voor laserablatie en de daaropvolgende time-lapse beeldvorming van het regenereren van interneuromastcellen in de zebravis laterale lijn.

Confocale Microscoop-gebaseerde Laser Ablatie en Regeneratie Test in Zebrafish Interneuromast Cellen

Dit protocol beschrijft een twee-foton-laserablatiebenadering die wordt uitgevoerd in zebravislarven, die als model dient om botregeneratie en de effecten van de immuunrespons op ablatie te bestuderen.

Twee-foton laser-gemedieerde ablatie van osteoblasten in zich ontwikkelende zebravislarven

Leer een gecontroleerde laserverwondingstechniek voor spinale regeneratieonderzoek bij Danio rerio larven. Deze methode minimaliseert schade aan omliggend weefsel en verbetert reproduceerbaarheid.

Gecontroleerde semi-geautomatiseerde lasergeïnduceerde verwondingen voor het bestuderen van spinale regeneratie bij zebravislarven (Video) | JoVE Journal

Gecontroleerde semi-geautomatiseerde lasergeïnduceerde verwondingen voor het bestuderen van spinale regeneratie bij zebravislarven

Meer video's verkennen