Name: Zuivering van endogene Drosophila Transient Receptor Potential Channels (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Leer de zuivering van volledige TRP-kanalen uit Drosophila voor elektrofysiologisch onderzoek. Deze methode gebruikt INAD-eiwitcomplexen en nikkelparels om structurele inzichten te verkrijgen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (nr. 31870746), Shenzhen Basic Research Grants (JCYJ20200109140414636) en natural science foundation van de provincie Guangdong, China (nr. 2021A1515010796) aan W. L. Wij danken LetPub (www.letpub.com) voor haar taalkundige hulp bij de voorbereiding van dit manuscript.

1. Zuivering van GST-gelabelde TRP- en His-tagged NORPA-fragmenten
<ol><li>Zuiveren GST-tagged TRP 1261-1275 fragment<ol>
<li>Transformeer de pGEX 4T-1 TRP 1261-1275plasmide 10 in Escherichia coli (E. coli) BL21 (DE3) cellen met behulp van de CaCl2 heat-shock transformatiemethode21. Ent een enkele kolonie in 10 ml Luria Bertani (LB) medium en groei 's nachts bij 37 °C. Versterk vervolgens de 10 ml zaaicultuur in 1 L LB-medium bij 37 °C.</li>
		<li>Nadat de optische dichtheid (OD600) van de cellen 0,5 heeft bereikt, koelt u de cellen af tot 16 °C en voegt u 0,1 mM isopropyl toe β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG; eindconcentratie) om de overexpressie van het doeleiwit te induceren en incubeert u gedurende 18 uur bij 16 °C.</li>
		<li>Na overexpressie pellet 1 L gekweekte cellen door centrifugatie bij 3.993 × g gedurende 20 minuten en resuspensie in 40 ml fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) buffer.</li>
		<li>Laad de geresuspendeerde cellen in een hogedrukhomogenisator die is voorgekoeld bij 4 °C. Verhoog langzaam de homogenisatordruk tot 800 bar. Open de inlaatkraan en laat de geresuspendeerde cellen cirkelvormig door een klep met zeer smalle spleten gaan. OPMERKING: De cellen worden gehomogeniseerd door de hoge schuifkrachten veroorzaakt door een grote drukval en cavitatie.</li>
		<li>Laad 5 ml glutathionkorrels op een zwaartekrachtstroomkolom en was de kralen met 50 ml PBS-buffer voor een totaal van drie keer.</li>
		<li>Centrifugeer het cellysaat uit de hogedrukhomogenisator bij 48.384 x g. Voeg het supernatant van het gecentrifugeerde cellysaat (40 ml) toe aan de gebalanceerde glutathionkorrels in de zwaartekrachtstroomkolom en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 °C. Resuspend de glutathion kralen om de 10 min.</li>
		<li>Open na 30 minuten incubatie de kolomuitlaatkraan om de kralen en doorstroomfractie te scheiden. Gooi de doorstroomfractie weg. Spoel de resterende glutathionparels tweemaal met 50 ml PBS-buffer.</li>
		<li>Voeg 15 ml el elutiebuffer toe aan de glutathionparels en incubeer gedurende 30 minuten. Resuspend de kralen om de 10 minuten.</li>
		<li>Elueerde na 30 minuten incubatie het GST-gelabelde TRP 1261-1275-fragment in een conische buis van 50 ml en belasting in een kolom met grootte-uitsluiting (voorbereidingsgraad), die in evenwicht wordt gebracht met behulp van 50 mM Tris (pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) buffer.</li>
		<li>Houd het elutiedebiet van de kolom met grootte-uitsluiting op 3 ml/min. Verzamel de geëlueerde eiwitten met een snelheid van 5 ml / buis.</li>
		<li>Identificeer de piek van het doeleiwit in de kolom met grootte-uitsluiting door de UV-absorptiesignalen bij 280 nm te analyseren en te verifiëren door SDS-PAGE-gelanalyse (elektroforeseparameters: 150 V voor de stapelgel; 200 V voor de oplossende gel). Kleur de gel met Coomassie blue R250.</li>
		<li>Concentreer het gezuiverde GST-gelabelde TRP 1261-1275-fragment van de maatuitsluitingskolom tot 1 ml met behulp van een 15 ml ultrafiltratiespinkolom gecentrifugeerd bij 3.000 x g bij 4 °C in een gekoelde centrifuge op een bureau.</li>
		<li>Bepaal de concentratie geconcentreerd eiwit met behulp van de Beer-Lambert Law. Meet de UV-absorptie van GST-gelabeld TRP 1261-1275 fragment bij 280 nm met behulp van een spectrofotometer.</li>
		<li>Verkrijg de extinctiecoëfficiënt bij 280 nm door de eiwitsequenties te importeren in het Protparam-programma (https://web.expasy.org/protparam/). Typisch, 1 L cultuur van GST-gelabelde TRP 1261-1275 levert 1 ml van 600 μM eiwit (6 x 10-7 mol). Zie tabel 1 voor de benodigde materialen.</li>
	</ol></li>
	<li>Zuivering van his-tagged NORPA 863-1095 fragment<ol>
<li>Transformeer de pETM.3C NORPA 863-1095plasmide 20 in E. coli BL21 (DE3) cellen met behulp van de CaCl2 heat-shock transformatiemethode21. Ent een enkele kolonie in 10 ml LB-medium en groei 's nachts bij 37 °C. Versterk vervolgens de zaaicultuur van 10 ml in 1 L LB-medium bij 37 °C.</li>
		<li>Nadat de OD600 van de cellen 0,5 heeft bereikt, koelt u de cellen af tot 16 °C en voegt u 0,1 mM IPTG (eindconcentratie) toe om de overexpressie van het doeleiwit te induceren en incubeert u bij 16 °C gedurende 18 uur.</li>
		<li>Na overexpressie pellet 1 L gekweekte cellen door centrifugatie bij 3.993 x g gedurende 20 minuten en resuspensie in 40 ml bindingsbuffer. Laat vervolgens de geresuspendeerde cellen in een hogedrukhomogenisator bij 4 °C lyseren, zoals beschreven in stap 1.1.4.</li>
		<li>Laad 5 ml Ni-kralen in een zwaartekrachtstroomkolom en was drie keer met 50 ml bindingsbuffer.</li>
		<li>Centrifugeer het cellysaat uit de hogedrukhomogenisator bij 48.384 x g. Voeg het supernatant van het gecentrifugeerde cellysaat toe aan de gebalanceerde Ni-kralen in de zwaartekrachtstroomkolom en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 °C. Resuspend de Ni-kralen elke 10 min.</li>
		<li>Open na 30 minuten incubatie de kolomuitlaatkraan om de kralen en doorstroomfractie te scheiden. Gooi de doorstroomfractie weg en was de resterende Ni-kralen twee keer met 50 ml wasbuffer.</li>
		<li>Voeg 15 ml el elutibuffer toe aan de Ni-kralen en incubeer gedurende 30 minuten. Resuspend de Ni-kralen elke 10 min.</li>
		<li>Verzamel na 30 minuten incubatie het geëlueerde His-tagged NORPA 863-1095-fragment in een conische buis van 50 ml en laad het in een kolom met grootte-uitsluiting (bereidingsklasse), die in evenwicht wordt gebracht met behulp van 50 mM Tris (pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT).</li>
		<li>Houd het elutiedebiet van de kolom met grootte-uitsluiting op 3 ml/min. Verzamel het geëlueerde eiwit met een snelheid van 5 ml / buis.</li>
		<li>Identificeer de piek van het doeleiwit in de kolom met grootte-uitsluiting door de UV-absorptiesignalen bij 280 nm te analyseren en te verifiëren door SDS-PAGE-gelanalyse (elektroforeseparameters: 150 V voor de stapelgel; 200 V voor de oplossende gel). Kleur de gel met Coomassie blue R250.</li>
		<li>Concentreer het gezuiverde His-tagged NORPA 863-1095-fragment van de maat-uitsluitingskolom tot 1 ml met behulp van een 15 ml ultrafiltratiespinkolom gecentrifugeerd bij 3.000 x g bij 4 °C in een gekoelde centrifuge op een bureau.</li>
		<li>Bepaal de concentratie geconcentreerd eiwit met behulp van de Beer-Lambert Law. Meet de UV-absorptie van het HIS-tagged NORPA 863-1095 fragment bij 280 nm met behulp van een spectrofotometer.</li>
		<li>Verkrijg de extinctiecoëfficiënt bij 280 nm door de eiwitsequenties te importeren in het Protparam-programma (https://web.expasy.org/protparam/). Typisch, 1 L cultuur van His-tagged NORPA 863-1095 fragment levert 1 ml van 600 μM eiwit (6 x 10-7 mol). Zie tabel 2 voor de benodigde materialen.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Bereiding van Drosophila-koppen
<ol><li>Verzamel volwassen vliegen in conische centrifugatiebuizen van 50 ml met behulp van de CO 2-anesthesiemethode22,23; onmiddellijk invriezen in vloeibare stikstof gedurende 10 min en bewaren in een -80°C vriezer.</li>
	<li>Nadat u een voldoende aantal vliegen hebt verzameld, schudt u de bevroren conische buizen van 50 ml krachtig met de hand om de benen, hoofden, vleugels en lichamen van de vliegen te scheiden. Breng het mengsel over in drie opeenvolgend gestapelde voorgekoelde roestvrijstalen zeven (respectievelijk 20/30/40 maaswijdte) en schud de zeven.</li>
	<li>Aangezien de koppen vervolgens niet door de zeef met 40 mazen kunnen, gebruikt u een borstel om de vliegenkoppen van de zeef met 40 mazen te vegen, brengt u ze over in conische buizen van 50 ml en bewaart u ze bij −80 °C.</li>
	<li>Verzamel de vliegen en hun hoofden continu en bewaar ze in een vriezer van -80 °C totdat ze de vereiste hoeveelheid bereiken die nodig is voor experimenten (0,5 g). Typisch, om 0,5 g koppen te verzamelen, is 35 ml vliegen in een conische buis van 50 ml nodig. Zie tabel 3 voor de benodigde materialen.</li>
</ol>3. Drosophila TRP kanaalzuivering
<ol><li>Weeg in totaal 0,5 g koppen en homogeniseer volledig in vloeibare stikstof met behulp van een voorgekoelde vijzel-stamper. Los de gehomogeniseerde koppen op in 10x v/g lysisbuffer (5 ml), incubeer in een schudder bij 4 °C gedurende 20 minuten en centrifugeer vervolgens bij 20,817 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C.</li>
	<li>Verzamel het spin-down supernatant ("20817 g S", figuur 4) en centrifugeer het verder bij 100.000 x g gedurende 60 minuten bij 4 °C. Gebruik het spin-down supernatant ("100.000 g S", figuur 4) voor de volgende pull-down assay.</li>
	<li>Voeg 1 ml Ni-kralen toe aan de zwaartekrachtstroomkolom en was de kralen met 10 ml dubbel gedestilleerd H2O (ddH2O) bij 4 °C gedurende in totaal drie keer. Breng de kralen in evenwicht met 10 kolomvolumes lysisbuffer driemaal bij 4 °C.</li>
	<li>Voeg 500 μL 600 μM gezuiverd His-tagged NORPA 863-1095 eiwit (3 x 10-7 mol) toe aan de Ni-kolom en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 °C. Resuspend de kralen om de 10 minuten.</li>
	<li>Open de kolomuitlaatkraan om de kralen en doorstroomfractie te scheiden. Neem de doorstroomfractie voor SDS-PAGE-analyse (NORPA F, figuur 4). In dit gedeelte worden de aaseiwitten geïmmobiliseerd op de Ni-kralen.</li>
	<li>Was de Ni-kralen met 10 kolomvolumes lysisbuffer (10 ml) op 4 °C en bewaar de wasfractie voor SDS-PAGE-analyse (Was 1, figuur 4A). Herhaal de bovenstaande stappen en bewaar het monster voor SDS-PAGE-analyse (Wash 2, Figuur 4A). In deze sectie worden de overmatige aaseiwitten op de Ni-kralen verwijderd.</li>
	<li>Voeg het supernatant van Drosophila-hoofdhomogenaat na 100.000 x g centrifugatie toe aan de Ni-kolom bij 4 °C, waar het NORPA 863-1095-fragment met his-label is geïmmobiliseerd.</li>
	<li>Incubeer het supernatant met de Ni-kralen bij 4 °C gedurende 30 min. Resuspend de kralen om de 10 minuten. Open vervolgens de kolomuitlaatkraan om de kralen en doorstroomfractie te scheiden.</li>
	<li>Verzamel het supernatant voor SDS-PAGE analyse (Dro head lysis F, Figuur 4A). In deze sectie worden de INAD-eiwitcomplexen (INAD/TRP/ePKC) in de hoofdhomogenaten opgevangen door de geïmmobiliseerde NORPA 863-1095-fragmenten op de Ni-kralen.</li>
	<li>Was de Ni-kralen met 10 kolomvolumes lysisbuffer (10 ml) bij 4 °C en houd het supernatant uit de neerslag van de zwaartekracht voor SDS-PAGE-analyse (Wash 3, figuur 4A). Herhaal de bovenstaande stappen en verzamel het supernatant voor SDS-PAGE-analyse (Wash 4, Figuur 4A). In deze sectie worden de ongebonden eiwitten op de Ni-kralen verwijderd.</li>
	<li>Voeg 500 μL 600 μM GST-gelabeld TRP 1261-1275 eiwit (3 x 10-7 mol) toe aan de Ni-kralen en incubeer gedurende 20 minuten bij 4 °C. Resuspend de kralen om de 10 minuten.</li>
	<li>Verzamel de geëlueerde fractie uit de zwaartekrachtkolom (TRP E1, figuur 4B), die het endogene Drosophila TRP-kanaal bevat. Herhaal de bovenstaande stappen en verzamel de elutifractie (TRP E2, figuur 4B). In deze stap, door de GST-gelabelde TRP 1261-1275-fragmenten als concurrent te gebruiken, worden de TRP-kanalen geëlueerd uit de gevangen INAD-eiwitcomplexen (INAD / TRP / ePKC) op de Ni-kralen.</li>
	<li>Was de Ni-kralen met 10 kolomvolumes bindingsbuffer (10 ml; Tabel 1) bij 4 °C en verzamel de wasfractie voor SDS-PAGE-analyse (Was 5, figuur 4B).</li>
	<li>Voeg 500 μL el el elutibuffer (tabel 1) toe aan de Ni-kralen en incubeer gedurende 20 minuten bij 4 °C. Verzamel de elutiefractie uit de kolom met de zwaartekrachtstroom (NORPA E1, figuur 4B). Herhaal de bovenstaande stappen en verzamel de elutiedractie (NORPA E2, figuur 4B).</li>
	<li>Eluuteer met behulp van de elutibuffer het His-tagged NORPA 863-1095-fragment vergezeld van de INAD/ePKC-eiwitcomplexen. Resuspendeer vervolgens de Ni-kralen in 500 μL bindingsbuffer.</li>
	<li>Neem de resuspended Ni-kralen om de SDS-PAGE (gekleurd door Coomassie blue R250) uit te voeren om de efficiëntie van de elutie te analyseren en te evalueren of de eluutbuffer werkt (kralen, figuur 4B). Zie tabel 4 voor de benodigde materialen.</li>
</ol>4. Grootte-uitsluiting kolom zuivering van Drosophila TRP kanaal
<ol><li>Installeer een kolom met grootte-uitsluiting (analytische kwaliteit) op het eiwitzuiveringssysteem. Breng de kolom in evenwicht met de kolombuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM DTT, 0,75 mM DDM), die wordt gefilterd door een filter van 0,45 μm.</li>
	<li>Concentreer de TRP E1- en E2-fractie uit stap 3.14 met behulp van een ultrafiltratiespinkolom van 4 ml, gecentrifugeerd bij 3.000 x g bij 4 °C in een gekoelde centrifuge.</li>
	<li>Spoel de monsterlus af met de kolombuffer en laad het monster in de monsterlus. Injecteer het monster in de kolom met grootte-uitsluiting en eluteer de eiwitten met een juiste stroomsnelheid (0,5 ml / min).</li>
	<li>Identificeer de piek van het doeleiwit door absorptie bij 280 nm en voer een SDS-PAGE-gel uit om het gezuiverde endogene Drosophila TRP-kanaal te detecteren (figuur 5). Zie tabel 5 voor de benodigde materialen.</li>
</ol>

<ol><li>Tsunoda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multivalent+PDZ-domain+protein+assembles+signalling+complexes+in+a+G-protein-coupled+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade.</a> Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+TRP+channels+by+protons+and+phosphoinositide+depletion+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors.</a> Current Biology: CB. 20 (3), 189-197 (2010).</li>
<li>Chyb, S., Raghu, P., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyunsaturated+fatty+acids+activate+the+Drosophila+light-sensitive+channels+TRP+and+TRPL%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Polyunsaturated fatty acids activate the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL.</a> Nature. 397 (6716), 255-259 (1999).</li>
<li>Hardie, R. C., Franze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photomechanical+responses+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors.</a> Science. 338 (6104), 260-263 (2012).</li>
<li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calmodulin+binds+to+Drosophila+TRP+with+an+unexpected+mode%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Calmodulin binds to Drosophila TRP with an unexpected mode.</a> Structure. 29 (4), 330-344 (2021).</li>
<li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+intracellular+Ca2%2B+chelation+on+the+light+response+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology.+A%2C+Sensory%2C+Neural%2C+and+Behavioral+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of intracellular Ca2+ chelation on the light response in Drosophila photoreceptors.</a> Journal of Comparative Physiology. A, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 177 (6), 707-721 (1995).</li>
<li>Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calmodulin+regulation+of+Drosophila+light-activated+channels+and+receptor+function+mediates+termination+of+the+light+response+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo.</a> Cell. 91 (3), 375-383 (1997).</li>
<li>Hardie, R. C., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositide-mediated+phototransduction+in+Drosophila+photoreceptors%3A+the+role+of+Ca2%2B+and+trp%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositide-mediated phototransduction in Drosophila photoreceptors: the role of Ca2+ and trp.</a> Cell Calcium. 18 (4), 256-274 (1995).</li>
<li>Delgado, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+opening+of+the+TRP+channel+in+isolated+membrane+patches+excised+from+photosensitive+microvilli+from+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Light-induced opening of the TRP channel in isolated membrane patches excised from photosensitive microvilli from Drosophila photoreceptors.</a> Neuroscience. 396, 66-72 (2019).</li>
<li>Lev, S., Katz, B., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+activity+of+the+TRP-like+channel+depends+on+its+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Channels+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">The activity of the TRP-like channel depends on its expression system.</a> Channels (Austin). 6 (2), 86-93 (2012).</li>
<li>Hardie, R. C., Raghu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+heterologously+expressed+Drosophila+TRPL+channels%3A+Ca2%2B+is+not+required+and+InsP3+is+not+sufficient%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Activation of heterologously expressed Drosophila TRPL channels: Ca2+ is not required and InsP3 is not sufficient.</a> Cell Calcium. 24 (3), 153-163 (1998).</li>
<li>Gutorov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+transient+receptor+potential+C+channel+activity+by+cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Modulation of transient receptor potential C channel activity by cholesterol.</a> Frontiers in Pharmacology. 10, 1487(2019).</li>
<li>Yagodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thapsigargin+and+receptor-mediated+activation+of+Drosophila+TRPL+channels+stably+expressed+in+a+Drosophila+S2+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Thapsigargin and receptor-mediated activation of Drosophila TRPL channels stably expressed in a Drosophila S2 cell line.</a> Cell Calcium. 23 (4), 219-228 (1998).</li>
<li>Guo, W., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+structural+studies+on+canonical+TRP+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Recent progress in structural studies on canonical TRP ion channels.</a> Cell Calcium. 83, 102075(2019).</li>
<li>Li, X., Fine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRP+channel%3A+The+structural+era%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">TRP channel: The structural era.</a> Cell Calcium. 87, 102191(2020).</li>
<li>Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+TRPV1+ion+channel+determined+by+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy.</a> Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).</li>
<li>Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1+structures+in+distinct+conformations+reveal+activation+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms.</a> Nature. 504 (7478), 113-118 (2013).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+INAD+scaffold+is+a+dynamic%2C+redox-regulated+modulator+of+signaling+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The INAD scaffold is a dynamic, redox-regulated modulator of signaling in the Drosophila eye.</a> Cell. 145 (7), 1088-1101 (2011).</li>
<li>Ye, F., Liu, W., Shang, Y., Zhang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+exquisitely+specific+PDZ%2Ftarget+recognition+revealed+by+the+structure+of+INAD+PDZ3+in+complex+with+TRP+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">An exquisitely specific PDZ/target recognition revealed by the structure of INAD PDZ3 in complex with TRP channel.</a> Structure. 24 (3), 383-391 (2016).</li>
<li>Ye, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unexpected+INAD+PDZ+tandem-mediated+plc%CE%B2+binding+in+Drosophila+photo+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">An unexpected INAD PDZ tandem-mediated plcβ binding in Drosophila photo receptors.</a> eLife. 7, (2018).</li>
<li>Rahimzadeh, M., Sadeghizadeh, M., Najafi, F., Arab, S., Mobasheri, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+heat+shock+step+on+bacterial+transformation+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Impact of heat shock step on bacterial transformation efficiency.</a> Molecular Biology Research Communications. 5 (4), 257-261 (2016).</li>
<li>Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22Drosophila%3A+A+laboratory+handbook.+Second+Edition%22">Drosophila: A laboratory handbook. Second Edition</a>. 80 (2), The Quarterly Review of Biology. (2005).</li>
<li>Nicolas, G., Sillans, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immediate+and+latent+effects+of+carbon+dioxide+on+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Immediate and latent effects of carbon dioxide on insects.</a> Annual Review of Entomology. 34 (1), 97-116 (1989).</li>
<li>Arachea, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergent+selection+for+enhanced+extraction+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins.</a> Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).</li>
<li>Hellmich, U. A., Gaudet, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology+of+TRP+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Experimental+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Structural biology of TRP channels.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. 223, 963-990 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

INAD, dat vijf PDZ-domeinen bevat, is de kernorganisator van Drosophila-fototransductiemachines. Eerdere studies toonden aan dat INAD PDZ3 bindt aan de TRP-kanaal C-terminale staart met een voortreffelijke specificiteit (KD = 0,3 μM)18. INAD PDZ45 tandem interageert met NORPA 863-1095 fragment met een extreem hoge binding affiniteit (KD = 30 nM). Deze bevindingen bieden een solide biochemische basis voor het ontwerpen van de affiniteitszuivering plus concurrentiestra...

Fototransductie is een proces waarbij geabsorbeerde fotonen worden omgezet in elektrische codes van neuronen. Het geeft uitsluitend opsinen en de volgende G-eiwit-gekoppelde signaleringscascade door bij zowel gewervelde als ongewervelde dieren. In Drosophila organiseert scaffold protein inactivation-no-after-potential D (INAD) met behulp van zijn vijf PDZ-domeinen een supramoleculair signaleringscomplex, dat bestaat uit een transient receptor potential (TRP) kanaal, fosfolipase Cβ/No receptor potential A (PLCβ/NORPA) en oogspecifiek eiwitkinase C (ePKC)1. De vorming van dit supramoleculaire signaleringscomplex garandeert de juiste subcellulaire lokalisatie, hoge efficiëntie en specificiteit van Drosophila-fototransductiemachines. In deze complexe, lichtgevoelige TRP fungeren kanalen als downstream effectoren van NORPA en bemiddelen calciuminstroom en de depolarisatie van fotoreceptoren. Eerdere studies toonden aan dat de opening van het Drosophila TRP-kanaal wordt gemedieerd door protonen, verstoring van de lokale lipidenomgeving of mechanische kracht 2,3,4. Het Drosophila TRP-kanaal interageert ook met calmodulin5 en wordt gemoduleerd door calcium door zowel positieve als negatieve feedback 6,7,8.
Tot nu toe waren elektrofysiologische studies over het gatingmechanisme van Drosophila TRP- en TRP-achtige (TRPL) kanalen gebaseerd op weggesneden membraanpleisters, hele-cel opnames van gedissocieerde wild-type Drosophila-fotoreceptoren en hetero-uitgedrukte kanalen in S2-, SF9- of HEK-cellen 2,9,10,11,12,13, maar niet op gezuiverde kanalen. De structurele informatie van het drosophila TRP-kanaal over de volledige lengte blijft ook onduidelijk. Om de elektrofysiologische eigenschappen van gezuiverd eiwit in een gereconstitueerde membraanomgeving te bestuderen en structurele informatie te verkrijgen over het Drosophila TRP-kanaal over de volledige lengte, is het verkrijgen van gezuiverde TRP-kanalen over de volledige lengte de noodzakelijke eerste stap, vergelijkbaar met de methodologieën die worden gebruikt in TRP-kanaalstudies van zoogdieren 14,15,16,17.
Onlangs werd op basis van het assemblagemechanisme van INAD-eiwitcomplex 18,19,20 voor het eerst een affiniteitszuiverings- plus concurrentiestrategie ontwikkeld om het TRP-kanaal te zuiveren van Drosophila-hoofdhomogenaten door streptavidin-kralen 5. Gezien de lage capaciteit en de dure kosten van streptavidin-kralen, wordt hier een verbeterd zuiveringsprotocol geïntroduceerd dat his-tagged aaseiwit en bijbehorende goedkope Ni-kralen met een veel hogere capaciteit gebruikt. De voorgestelde methode zal helpen om het gatingmechanisme van het TRP-kanaal vanuit structurele hoeken te bestuderen en de elektrofysiologische eigenschappen van het TRP-kanaal te meten met gezuiverde eiwitten.

<table><tbody><tr><td>Bacteriestammen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3) Competent Cells</td><td>Novagen</td><td>69450</td><td>Eiwitoverbesturing</td></tr><tr><td>Experimentmodellen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D.melanogaster: W1118 stam</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>BDSC:3605</td><td>Drosophila kopvoorbereiding</td></tr><tr><td>Materiaal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20/30/40 mesh roestvrijstalen zeef</td><td>Jiufeng metal mesh company</td><td>GB/T6003.1</td><td>Drosophila kopvoorbereiding</td></tr><tr><td>30% Acrylamide-N,N&prime;-Methylenebisacrylamide(29:1)</td><td>Lablead</td><td>A3291</td><td>SDS-PAGE gelvoorbereiding</td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfaat</td><td>Invitrogen</td><td>HC2005</td><td>SDS-PAGE gelvoorbereiding</td></tr><tr><td>Cocktail proteaseremmer</td><td>Roche</td><td>05892953001</td><td>Proteaseremmer</td></tr><tr><td>Coomassie briljantblauw R-250</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100472-0025</td><td>SDS-PAGE gelkleuring</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sangon Biotech</td><td>A620058-0100</td><td>Grootte-uitsluiting kolom buffervoorbereiding</td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraazijnzuur dinatriumzout (EDTA)</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500838-0500</td><td>Grootte-uitsluiting kolom buffervoorbereiding</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610235-0005</td><td>SDS-PAGE buffervoorbereiding</td></tr><tr><td>Glutathione Sepharose 4 Fast Flow kralen</td><td>Cytiva</td><td>17513202</td><td>Affiniteitschromatografie</td></tr><tr><td>Imidazool</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500529-0001</td><td>Elutie buffervoorbereiding voor Ni-kolom</td></tr><tr><td>Isopropyl-bèta-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600168-0025</td><td>Inductie van eiwitoverbelasting</td></tr><tr><td>LB Broth Poeder</td><td>Sangon Biotech</td><td>A507002-0250</td><td>E.coli. celcultuur</td></tr><tr><td>L-Glutathione gereduceerd (GSH)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>G4251-100G</td><td>Elutie buffervoorbereiding voor glutathionkralen</td></tr><tr><td>Ni-Sepharose excel kralen</td><td>Cytiva</td><td>17371202</td><td>Affiniteitschromatografie</td></tr><tr><td>N-Dodecyl bèta-D-maltoside (DDM)</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610424-001</td><td>Detergentine voor eiwitzuivering</td></tr><tr><td>N,N,N',N'-Tetramethylethyleendiamine (TEMED)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>T9281-100ML</td><td>SDS-PAGE gelvoorbereiding</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sangon Biotech</td><td>E607008-0500</td><td>Homogenisatie buffer voor E.coli. cel</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Lablead</td><td>P0754-25G</td><td>Proteaseremmer</td></tr><tr><td>Voorgekleurde eiwitmarker</td><td>Thermo Scientific</td><td>26619/26616</td><td>Voorgekleurde eiwitladder</td></tr><tr><td>Grootte-uitsluiting kolom (voorbereidingsgraad)</td><td>Cytiva</td><td>28989336</td><td>HiLoad 26/60 Superdex 200 PG kolom</td></tr><tr><td>Grootte-uitsluiting kolom (analysegraad)</td><td>Cytiva</td><td>29091596</td><td>Superose 6 Increase 10/300 GL kolom</td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501218-0001</td><td>Eiwitzuiveringsbuffervoorbereiding</td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfaat (SDS)</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500228-0001</td><td>SDS-PAGE gel/buffervoorbereiding</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-aldrich</td><td>T1503-10KG</td><td>Eiwitzuiveringsbuffervoorbereiding</td></tr><tr><td>Ultrafiltratiespinkolom</td><td>Millipore</td><td>UFC901096/801096</td><td>Eiwitconcentratie</td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analytische weegschaal</td><td>DENVER</td><td>APX-60</td><td>Metage van Drosophila kop</td></tr><tr><td>Bureauhogesnelheids gekoelde centrifuge voor 15mL en 50mL kegelcentrifugatiebuizen</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>Eiwitconcentratie</td></tr><tr><td>Bureauhogesnelheids gekoelde centrifuge 1.5mL centrifugatiebuizen</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>Centrifugeren van Drosophila koplysaat na homogenisatie</td></tr><tr><td>Lege zwaartekrachtstroomkolom (inwendige diameter = 1.0cm)</td><td>Bio-Rad</td><td>738-0015</td><td>TRP eiwitzuivering</td></tr><tr><td>Lege zwaartekrachtstroomkolom (inwendige diameter = 2.5cm)</td><td>Bio-Rad</td><td>738-0017</td><td>Aas en concurrent eiwitzuivering uit E.coli.</td></tr><tr><td>Geldocumentatiesysteem</td><td>Bio-Rad</td><td>Universal Hood II Gel Doc XR System</td><td>SDS-PAGE beeldvorming</td></tr><tr><td>Hogesnelheids gekoelde centrifuge</td><td>Beckman coulter</td><td>Avanti J-26 XP</td><td>Centrifugeren van E.coli. cellen/cellisaatje</td></tr><tr><td>Hogedrukhomogenisator</td><td>UNION-BIOTECH</td><td>UH-05</td><td>Homogenisatie van E.coli. cellen</td></tr><tr><td>Vloeibare stikstoftank</td><td>Taylor-Wharton</td><td>CX-100</td><td>Drosophila kopvoorbereiding</td></tr><tr><td>Eiwitzuiveringssysteem</td><td>Cytiva</td><td>AKTA purifier</td><td>Eiwitzuivering</td></tr><tr><td>Koelkast (-80&deg;C)</td><td>Thermo</td><td>900GP</td><td>Drosophila kopvoorbereiding</td></tr><tr><td>Spectrofotometer</td><td>MAPADA</td><td>UV-1200</td><td>OD600 meting van E.coli. cellen</td></tr><tr><td>Spectrofotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 2000c</td><td>Bepaling van eiwitconcentratie</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman coulter</td><td>Optima XPN-100 Ultracentrifuge</td><td>Ultracentrifugeren</td></tr></tbody></table>

zuivering van endogene drosophila transient receptor potential channels

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Drosophila fototransductie is een van de snelst bekende G-eiwit-gekoppelde signaalroutes. Om de specificiteit en efficiëntie van deze cascade te garanderen, bindt het calcium (Ca2+)-permeabele kationkanaal, transient receptor potential (TRP), zich stevig aan het steigereiwit, inactivatie-no-after-potential D (INAD), en vormt een groot signaleringseiwitcomplex met oogspecifiek eiwitkinase C (ePKC) en fosfolipase Cβ/No-receptorpotentiaal A (PLCβ/NORPA). De biochemische eigenschappen van het Drosophila TRP-kanaal blijven echter onduidelijk. Op basis van het assemblagemechanisme van het INAD-eiwitcomplex werd een aangepaste affiniteitszuivering plus concurrentiestrategie ontwikkeld om het endogene TRP-kanaal te zuiveren. Ten eerste werd het gezuiverde histidine (His)-gelabelde NORPA 863-1095-fragment gebonden aan Ni-kralen en gebruikt als lokaas om het endogene INAD-eiwitcomplex uit Drosophila-hoofdhomogenaten naar beneden te halen. Vervolgens werd overmatig gezuiverd glutathion S-transferase (GST)-gelabeld TRP 1261-1275-fragment toegevoegd aan de Ni-kralen om te concurreren met het TRP-kanaal. Ten slotte werd het TRP-kanaal in het supernatant gescheiden van het overmatige TRP 1261-1275-peptide door grootte-uitsluitingschromatografie. Deze methode maakt het mogelijk om het gatingmechanisme van het Drosophila TRP-kanaal te bestuderen vanuit zowel biochemische als structurele hoeken. De elektrofysiologische eigenschappen van gezuiverde Drosophila TRP-kanalen kunnen ook in de toekomst worden gemeten.

In dit artikel wordt een eiwitzuiveringsmethode gedemonstreerd om het endogene Drosophila TRP-kanaal te zuiveren (figuur 1).
Ten eerste worden recombinante eiwitexpressie en -zuivering toegepast om het aas en concurrerende eiwitten te verkrijgen. Vervolgens wordt een GST-gelabeld TRP 1261-1275-fragment uitgedrukt in E. coli BL21 (DE3) -cellen in LB-medium en gezuiverd met glutathionparels en een kolom met grootte-uitsluiting (<strong class="xfig"...

Op basis van het assemblagemechanisme van het INAD-eiwitcomplex werd in dit protocol een aangepaste affiniteitszuivering plus concurrentiestrategie ontwikkeld om het endogene Drosophila TRP-kanaal te zuiveren.

Zuivering van endogene Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, ...

In dit protocol demonstreren we het zuiveringsproces om gezuiverde TRP-kanalen over de volledige lengte te verkrijgen, wat de noodzakelijke eerste stap is om elektrofysiologische eigenschappen te bestuderen en structurele informatie te verkrijgen over het Drosophila TRP-kanaal over de volledige lengte. Op basis van het bemonsteringsmechanisme van het INAD-eiwitcomplex en met behulp van goedkope nikkelparels met een veel hogere capaciteit, kan voldoende hoeveelheid TRP-kanalen uit vliegenkoppen worden gezuiverd. De procedure wordt gedemonstreerd door Yuyang Liu, een technicus uit ons lab.Transformeer om te beginnen de pGEX 4T-1 TRP 1261-1265 plasmide in E.coli BL21-cellen, met behulp van de calciumchloride warmteschoktransformatiemethode. Ent een enkele kolonie in 10 milliliter Luria Bertani medium en groei 's nachts bij 37 graden Celsius. Voeg de 10 milliliter zaaicultuur toe aan een liter Luria Bertani medium en incubeer bij 37 graden Celsius.Nadat de optische dichtheid van de cellen 0,5 heeft bereikt, koelt u de cellen af tot 16 graden Celsius en voegt u 0,1 millimolaire isopropyl-bèta-D-1-thiogalactopyranoside toe. Na overexpressie pelleteert u een liter gekweekte cellen door centrifugatie en resuspendeert u in 40 milliliter fosfaat-gebufferde zoutoplossing. Laad de geresuspendeerde cellen in een hogedrukhomogenisator, voorgekoeld tot vier graden Celsius.Verhoog langzaam de homogenisatordruk tot 800 bar. Open het inlaatlipje en laat de geresuspendeerde cellen cirkelvormig door een klep met smalle spleten gaan. Laad vijf milliliter glutathionparels in een zwaartekrachtstroomkolom en was de kralen met 50 milliliter fosfaat-gebufferde zoutoplossingsbuffer, voor een totaal van drie keer.Centrifugeer het cellysaat uit de hogedrukhomogenisator op 48, 384 maal G.Voeg ongeveer 40 milliliter van het supernatant van het gecentrifugeerde cellysaat toe aan de gebalanceerde glutathionparels in de zwaartekrachtstroomkolom en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 graden Celsius. Resuspendeer de glutathion kralen om de 10 minuten. Open na 30 minuten incubatie het tabblad kolomuitlaat om de kralen en doorstroomfractie te scheiden.Gooi de doorstroomfractie weg en spoel de resterende glutathionparels twee keer af, met 50 milliliter fosfaat-gebufferde zoutoplossingsbuffer. Voeg 15 milliliter elutiebuffer toe aan de glutathionparels en resuspenseer de kralen elke 10 minuten. Eluteer het GST-gelabelde TRP 1261-1275-fragment in een conische buis van 50 ml en laad het in een kolom met grootte-uitsluiting.Verzamel vijf milliliter van de geëlueerde eiwitten per buis en concentreer de gezuiverde fragmenten tot één milliliter door centrifugatie in een ultrafiltratiespinkolom in een gekoelde centrifuge. Om het His-tagged NORPA 863-1095-fragment te zuiveren, volgt u de eerder gedemonstreerde procedure met behulp van nikkelparels. Verzamel volwassen vliegen in conische centrifugebuizen van 50 milliliter en vries ze gedurende 10 minuten in vloeibare stikstof.Schud de bevroren buizen krachtig met de hand en breng het mengsel over op drie, sequentieel gestapelde, voorgekoelde roestvrijstalen zeven. Schud de zeven en veeg de vliegenkoppen met een borstel van de zeef van 40 mazen. Breng ze over in vijf milliliter conische buizen en bewaar ze bij min 80 graden Celsius.Homogeniseer 0,5 gram koppen in vloeibare stikstof met behulp van een voorgekoelde vijzel en stamper. Los de gehomogeniseerde koppen op in vijf milliliter 10X lysisbuffer, gevolgd door centrifugatie bij 20, 817 maal G bij vier graden Celsius gedurende 20 minuten. Het spin-down supernatant wordt verder 100.000 keer G gecentrifugeerd bij vier graden Celsius gedurende 60 minuten.Voeg een milliliter nikkelparels toe aan de zwaartekrachtstroomkolom en was de kralen drie keer met 10 milliliter dubbel gedestilleerd water op vier graden Celsius. Breng de kralen in evenwicht met 10 kolomvolumes lysisbuffer, drie keer bij vier graden Celsius. Voeg 500 microliter 600 micromolair gezuiverd His-tagged NORPA 863-1095-eiwit toe aan de nikkelkolom en incubeer de kolom.Resuspend de kralen elke 10 minuten. Open de kolomuitlaatkraan om de kralen en doorstroomfractie te scheiden en was de nikkelparels met 10 milliliter koude lysisbuffer. Voeg vervolgens koud supernatant van Drosophila-hoofdhomogenaat toe aan de nikkelkolom.Was na incubatie de kralen met 10 milliliter lysisbuffer en voeg 500 microliter 600 micromolaire GST-gelabelde TRP 1261-1275-eiwit toe aan de kralen. Verzamel de geëlueerde fractie uit de zwaartekrachtkolom. Was de nikkelparels met 10 milliliter bindingsbuffer.Voeg vervolgens de elutiebuffer toe en verzamel de elutiefractie uit de kolom met de zwaartekrachtstroom. Concentreer de fracties die zijn geëlueerd uit drosophila TRP-kanaalzuivering, met behulp van een ultrafiltratiespinkolom van vier milliliter. Injecteer het monster in de kolom met grootte-uitsluiting en elueerde de eiwitten met een redelijk debiet.GST-gelabeld TRP 1261-1275 fragment werd tot expressie gebracht in E.coli-cellen en gezuiverd met behulp van glutathionkorrels en een maatuitsluitingskolom. Op dezelfde manier werd het His-tagged NORPA 863-1095-fragment uitgedrukt en gezuiverd met behulp van nikkelparels en een kolom met grootte-uitsluiting. Het geëlueerde TRP-kanaal is gescheiden van het overmatige GST-gelabelde TRP 1261-1275-peptide, door grootte-exclusiechromatografie.Als bijproduct worden de INAD, ePKC, NORPA 863-1095 complexen verkregen na TRP 1261-1275 peptide competitie. Het belangrijkste om te onthouden bij het proberen van dit protocol, is homogeniseren van de vliegenkoppen in vloeibare stikstof en het homogenaat oplossen in buffer met een reinigingsmiddel genaamd DDM. Na deze procedure kunnen we ook het hele INAD-eiwitcomplex zuiveren dat kan worden gebruikt om de assemblage- en regulatiemechanismen te bestuderen.Een mogelijke toekomstige toepassing van deze methode zal zijn om de structurele informatie van het endogene Drosophila TRP-kanaal te bestuderen met behulp van Cryo-EM-technieken. Daarnaast is het meten van de elektrofysiologische eigenschappen van gezuiverde endogene Drosophila TRP-kanalen in kunstmatig dubbellaags lipidemembraan ook haalbaar.

purification-endogenous-drosophila-transient-receptor-potential

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Deze procedure maakt gebruik van een blauw licht geactiveerd algen kanaal en cel-specifieke genetische expressie tools om synaptische potentialen op te roepen met lichtpulsen op de neuromusculaire junctie (NMJ)...

Channelrhodopsin2 Mediated Stimulatie van synaptische Potentials op Drosophila Neuromusculaire verbindingen

In situ patch clamp opnamen worden gebruikt voor elektrofysiologische karakterisatie van neuronen in intacte circuits. In de Drosophila genetische model patch clamping is moeilijk omdat de CNS is klein en omgeven door een robuuste mantel. Dit artikel beschrijft de procedure om de schede en schoon neuronen voor latere patch clamp opnamen te verwijderen.

Bereiding van<em&gt; Drosophila</em&gt; Centraal Neuronen voor<em&gt; In situ</em&gt; Patch clamping

This video demonstrates an experimental protocol to investigate the prolonged depolarizing afterpotential (PDA) in white-eyed Drosophila. The fly's eye is exposed to intense blue light pulses to convert the photopigment rhodopsin to metarhodopsin, initiating a signaling cascade that opens positive ion channels and causes membrane depolarization. Because blue light prevents the reconversion of metarhodopsin to rhodopsin, the continuous influx of positive ions results in sustained depolarization,...

Investigating Prolonged Depolarizing Afterpotential (PDA) in Drosophila Photoreceptors

Source: Wagner, K. et al., Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins. J. Vis. Exp. (2022).This video demonstrates the visualization of membrane protein trafficking in Drosophila photoreceptor cells using eGFP-tagged TRPL proteins. It details the preparation of transgenic flies for imaging, the capture of fluorescence images of photoreceptor cells, and the quantification of TRPL trafficking by measuring relative eGFP fluorescence in the...

Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells

Whole-cell opnames van Drosophila melanogaster fotoreceptoren maken het mogelijk om spontaan donkere stoten, kwantumstoten, macroscopische reacties op licht en spanningsrelaties onder verschillende omstandigheden te meten. In combinatie met D. melanogaster genetische manipulatie instrumenten, deze methode maakt het mogelijk om de alomtegenwoordige inositol-lipide signalering weg en zijn doel, het TRP kanaal te onderzoeken.

Elektrofysiologische methode voor opname van volledige spanningsklemmen van<em&gt; Drosophila</em&gt; Photoreceptors

Het doel van dit protocol is om een ​​eenvoudige en goedkope aanpak te geven voor het verzamelen van Drosophila embryo's op middelgrote schaal (0,5-1 g) en het bereiden van eiwit extracten die kunnen worden toegepast in stroomafwaartse proteomische toepassingen, zoals affiniteitszuivering-massaspectrometrie (AP-MS ).

Middelgrote voorbereiding van<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo Extracten voor Proteomische Experimenten

Dit artikel biedt een methode om te testen de monosynaptic verbindingen tussen neuronen door tetrodotoxine en het tetrodotoxine-resistente natrium-kanaal, NaChBac.

Behandeling van Monosynaptic verbindingen in Drosophila met behulp van resistente tetrodotoxine natrium kanalen

Dit artikel wordt beschreven specifieke methoden voor biochemische hoeveelheid wasmiddel-ontbindend TRPV1 spectroscopische p.a.. De gecombineerde protocollen bieden biochemische en biofysische hulpmiddelen die kunnen worden aangepast om de structurele en functionele studies voor zoogdieren ionenkanalen in een membraan-gecontroleerde omgeving.

Zuivering en reconstructie van TRPV1 spectroscopische p.a.

Dit protocol beschrijft een methode om vast te leggen van de aflopende elektrische activiteit van het centrale zenuwstelsel van Drosophila melanogaster zodat de kosten-efficiënte en handige testen van farmacologische agenten, genetische mutaties van neurale eiwitten, en/of de rol van onontgonnen fysiologische trajecten.

Elektrofysiologische opname van de activiteit van het centrale zenuwstelsel van derde-Instar Drosophila Melanogaster

Hier worden niet-invasieve methoden beschreven voor de lokalisatie van fotoreceptormembraaneiwitten en de beoordeling van retinale degeneratie in het drosophila samengestelde oog met behulp van eGFP-fluorescentie.

Onderzoek naar membraaneiwithandel in drosophila-fotoreceptorcellen met behulp van eGFP-gelabelde eiwitten

We presenteren een protocol om bi-stabiele fotopigmenten elektrofysiologisch te karakteriseren: (i) het benutten van de ladingsverplaatsingen binnen de fotopigmentmoleculen na fotonabsorptie en hun enorme hoeveelheid in de fotoreceptoren, en (ii) het benutten van de absorptie-spectraverschillen van rhodopsine en metarhodopsine fotopigmenttoestanden. Deze protocollen zijn nuttig om te screenen op mutaties die bi-stabiele fotopigmentsystemen beïnvloeden.

Elektrofysiologische methoden voor het meten van fotopigmentniveaus in Drosophila-fotoreceptoren

Leer de zuivering van volledige TRP-kanalen uit Drosophila voor elektrofysiologisch onderzoek. Deze methode gebruikt INAD-eiwitcomplexen en nikkelparels om structurele inzichten te verkrijgen.

Zuivering van endogene Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Meer video's verkennen