Zuivering van endogene Drosophila Transient Receptor Potential Channels

In dit protocol demonstreren we het zuiveringsproces om gezuiverde TRP-kanalen over de volledige lengte te verkrijgen, wat de noodzakelijke eerste stap is om elektrofysiologische eigenschappen te bestuderen en structurele informatie te verkrijgen over het Drosophila TRP-kanaal over de volledige lengte. Op basis van het bemonsteringsmechanisme van het INAD-eiwitcomplex en met behulp van goedkope nikkelparels met een veel hogere capaciteit, kan voldoende hoeveelheid TRP-kanalen uit vliegenkoppen worden gezuiverd. De procedure wordt gedemonstreerd door Yuyang Liu, een technicus uit ons lab.

Transformeer om te beginnen de pGEX 4T-1 TRP 1261-1265 plasmide in E.coli BL21-cellen, met behulp van de calciumchloride warmteschoktransformatiemethode. Ent een enkele kolonie in 10 milliliter Luria Bertani medium en groei 's nachts bij 37 graden Celsius. Voeg de 10 milliliter zaaicultuur toe aan een liter Luria Bertani medium en incubeer bij 37 graden Celsius.

Nadat de optische dichtheid van de cellen 0,5 heeft bereikt, koelt u de cellen af tot 16 graden Celsius en voegt u 0,1 millimolaire isopropyl-bèta-D-1-thiogalactopyranoside toe. Na overexpressie pelleteert u een liter gekweekte cellen door centrifugatie en resuspendeert u in 40 milliliter fosfaat-gebufferde zoutoplossing. Laad de geresuspendeerde cellen in een hogedrukhomogenisator, voorgekoeld tot vier graden Celsius.

Verhoog langzaam de homogenisatordruk tot 800 bar. Open het inlaatlipje en laat de geresuspendeerde cellen cirkelvormig door een klep met smalle spleten gaan. Laad vijf milliliter glutathionparels in een zwaartekrachtstroomkolom en was de kralen met 50 milliliter fosfaat-gebufferde zoutoplossingsbuffer, voor een totaal van drie keer.

Centrifugeer het cellysaat uit de hogedrukhomogenisator op 48, 384 maal G.Voeg ongeveer 40 milliliter van het supernatant van het gecentrifugeerde cellysaat toe aan de gebalanceerde glutathionparels in de zwaartekrachtstroomkolom en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 graden Celsius. Resuspendeer de glutathion kralen om de 10 minuten. Open na 30 minuten incubatie het tabblad kolomuitlaat om de kralen en doorstroomfractie te scheiden.

Gooi de doorstroomfractie weg en spoel de resterende glutathionparels twee keer af, met 50 milliliter fosfaat-gebufferde zoutoplossingsbuffer. Voeg 15 milliliter elutiebuffer toe aan de glutathionparels en resuspenseer de kralen elke 10 minuten. Eluteer het GST-gelabelde TRP 1261-1275-fragment in een conische buis van 50 ml en laad het in een kolom met grootte-uitsluiting.

Verzamel vijf milliliter van de geëlueerde eiwitten per buis en concentreer de gezuiverde fragmenten tot één milliliter door centrifugatie in een ultrafiltratiespinkolom in een gekoelde centrifuge. Om het His-tagged NORPA 863-1095-fragment te zuiveren, volgt u de eerder gedemonstreerde procedure met behulp van nikkelparels. Verzamel volwassen vliegen in conische centrifugebuizen van 50 milliliter en vries ze gedurende 10 minuten in vloeibare stikstof.

Schud de bevroren buizen krachtig met de hand en breng het mengsel over op drie, sequentieel gestapelde, voorgekoelde roestvrijstalen zeven. Schud de zeven en veeg de vliegenkoppen met een borstel van de zeef van 40 mazen. Breng ze over in vijf milliliter conische buizen en bewaar ze bij min 80 graden Celsius.

Homogeniseer 0,5 gram koppen in vloeibare stikstof met behulp van een voorgekoelde vijzel en stamper. Los de gehomogeniseerde koppen op in vijf milliliter 10X lysisbuffer, gevolgd door centrifugatie bij 20, 817 maal G bij vier graden Celsius gedurende 20 minuten. Het spin-down supernatant wordt verder 100.000 keer G gecentrifugeerd bij vier graden Celsius gedurende 60 minuten.

Voeg een milliliter nikkelparels toe aan de zwaartekrachtstroomkolom en was de kralen drie keer met 10 milliliter dubbel gedestilleerd water op vier graden Celsius. Breng de kralen in evenwicht met 10 kolomvolumes lysisbuffer, drie keer bij vier graden Celsius. Voeg 500 microliter 600 micromolair gezuiverd His-tagged NORPA 863-1095-eiwit toe aan de nikkelkolom en incubeer de kolom.

Resuspend de kralen elke 10 minuten. Open de kolomuitlaatkraan om de kralen en doorstroomfractie te scheiden en was de nikkelparels met 10 milliliter koude lysisbuffer. Voeg vervolgens koud supernatant van Drosophila-hoofdhomogenaat toe aan de nikkelkolom.

Was na incubatie de kralen met 10 milliliter lysisbuffer en voeg 500 microliter 600 micromolaire GST-gelabelde TRP 1261-1275-eiwit toe aan de kralen. Verzamel de geëlueerde fractie uit de zwaartekrachtkolom. Was de nikkelparels met 10 milliliter bindingsbuffer.

Voeg vervolgens de elutiebuffer toe en verzamel de elutiefractie uit de kolom met de zwaartekrachtstroom. Concentreer de fracties die zijn geëlueerd uit drosophila TRP-kanaalzuivering, met behulp van een ultrafiltratiespinkolom van vier milliliter. Injecteer het monster in de kolom met grootte-uitsluiting en elueerde de eiwitten met een redelijk debiet.

GST-gelabeld TRP 1261-1275 fragment werd tot expressie gebracht in E.coli-cellen en gezuiverd met behulp van glutathionkorrels en een maatuitsluitingskolom. Op dezelfde manier werd het His-tagged NORPA 863-1095-fragment uitgedrukt en gezuiverd met behulp van nikkelparels en een kolom met grootte-uitsluiting. Het geëlueerde TRP-kanaal is gescheiden van het overmatige GST-gelabelde TRP 1261-1275-peptide, door grootte-exclusiechromatografie.

Als bijproduct worden de INAD, ePKC, NORPA 863-1095 complexen verkregen na TRP 1261-1275 peptide competitie. Het belangrijkste om te onthouden bij het proberen van dit protocol, is homogeniseren van de vliegenkoppen in vloeibare stikstof en het homogenaat oplossen in buffer met een reinigingsmiddel genaamd DDM. Na deze procedure kunnen we ook het hele INAD-eiwitcomplex zuiveren dat kan worden gebruikt om de assemblage- en regulatiemechanismen te bestuderen.

Een mogelijke toekomstige toepassing van deze methode zal zijn om de structurele informatie van het endogene Drosophila TRP-kanaal te bestuderen met behulp van Cryo-EM-technieken. Daarnaast is het meten van de elektrofysiologische eigenschappen van gezuiverde endogene Drosophila TRP-kanalen in kunstmatig dubbellaags lipidemembraan ook haalbaar.