Functionele beoordeling van kinesine-7 CENP-E in spermatocyten met behulp van in vivo remming, immunofluorescentie en flowcytometrie

Meiose is een evolutionair geconserveerde gebeurtenis bij eukaryoten, die essentieel is voor gametogenese en seksuele voortplanting. Ons protocol biedt een effectieve methode voor studies van meiotische deling en spermatogenese. We hebben een reeks protocollen beschreven voor de analyse van spermatocyten.

Deze techniek kan worden toegepast voor observatie van meiotische spoel, homologe chromosomen en de subcellulaire organellen in spermatocyten. Deze methode kan worden gebruikt voor de analyse van meiotische deling, het genereren van genbewerking diermodellen en gentransfectie in weefsels of organen. Experimentatoren moeten een steriele omgeving behouden tijdens buikchirurgie en aandacht besteden aan de temperatuur, tijd en belangrijkste experimentele omstandigheden van dit protocol.

De procedure wordt gedemonstreerd door Miss Meng-Fei Xu, een postdoctorale van mijn laboratorium. Begin met de bouw van het GSK923295 gemedieerde centromeereiwit E- of CENP-E-remmingsmuismodel door de verdoofde muizenpoten vast te binden en op de wasbak te bevestigen. Gebruik na het desinfecteren van het operatiegebied een steriel scalpel om een opening van vijf millimeter in de buikholte van de muis te maken, gevolgd door het plaatsen van steriele chirurgische klemmen op de huid.

Trek vervolgens aan het epididymale vetkussen met een steriele ontleedtang om de teelballen te lokaliseren met behulp van een steriel pincet. Na het fixeren van de teelballen met een steriele tang onder een stereoscoop, injecteert u langzaam 10 microliter GSK923295 in seminifere tubuli in een eindconcentratie van 10 micromolair met behulp van 10 microliter Riodine. Als u klaar bent, duwt u de teelballen terug in de buikholte en hecht u de chirurgische plaats zoals beschreven in het tekstmanuscript.

Voor de gradiëntuitdroging van de verzamelde muizentestikels, incubeer het monster sequentieel in verschillende media zoals beschreven in het manuscript. Plaats na de seriële incubatie het weefsel op de bodem van de insluitdoos en voeg de gesmolten paraffine toe aan de doos. Voor de volledige stolling van de paraffine koelt u de monsters gedurende zes uur af bij vier graden Celsius.

Bevestig het monster later op de houder van het ultramicrotoom terwijl u de hoek tussen het monster en het mesoppervlak op 5 tot 10 graden houdt. Pas de plakdikte aan tot vijf micrometer om de vijf micrometer dikke secties voor te bereiden met behulp van een ultramicrotoom. Verspreid na de bereiding de monsterglijbaan in een waterbad van 40 graden Celsius voordat u de secties gedurende 12 uur in de schuifdroger bij 37 graden Celsius droogt.

Voer na 12 uur sequentiële incubatie van de dia's uit zoals eerder uitgelegd. Spoel vervolgens de dia's gedurende vijf minuten in gedestilleerd water, gevolgd door kleuring met Mayer's Hematoxylin-oplossing gedurende zes minuten bij kamertemperatuur. Spoel vervolgens de bevlekte dia's gedurende vijf minuten in stromend water en incubeer gedurende twee minuten met gedestilleerd water.

Incubeer de dia's gedurende drie seconden in 1% ethanolhydrochloride en spoel en laat water vervolgens gedurende twee minuten stromen. Bevlek het monster met 1% eosine gedurende 15 seconden, gevolgd door seriële incubatie. Als u klaar bent, sluit u de dia's af met 15 microliter neutrale gom en een dekplaat van 24 bij 50 millimeter.

Voor immunofluorescentie plaatst u de dia in de antigeenophaaloplossing om onder hoge druk gedurende vier minuten in een snelkookpan te koken voor het ophalen van antigeen. Koel de dia vervolgens op natuurlijke wijze af tot kamertemperatuur voordat u twee keer spoelt met gedestilleerd water gedurende vijf minuten en met PBS gedurende vijf minuten. Om de cellen te permeabiliseren, incubeert u de dia in 500 microliter van 0,25% Triton X-100 in PBS gedurende 10 minuten en spoelt u de dia's vervolgens drie keer vijf minuten met PBS.

Voor antigeenblokkering, incubeer het monster met 300 microliter 3% runderserumalbumine of BSA gedurende één uur en met de primaire antilichamen in 3% BSA in PBST gedurende 16 uur bij vier graden Celsius. Plaats de dia na de incubatie in een bevochtigde doos om uitdroging van de weefsels te voorkomen. Verwarm de dia's op natuurlijke wijze gedurende 30 minuten tot kamertemperatuur.

Gooi het primaire antilichaam weg, gevolgd door het spoelen van de dia in PBST gedurende vijf minuten driemaal. Verdun secundaire antilichamen met 3%BSA en PBST. Incubeer het monster vervolgens met verdunde secundaire antilichamen gedurende één tot twee uur bij 37 graden Celsius.

Nadat u het monster vijf keer vijf minuten in PBST hebt gespoeld, kleurt u de kernen gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur met 50 microliter DAPI. Monteer de cover-slip met het anti-fade montagemedium en sluit de coverslip af met nagellak. Voor flowcytometrie verzamelt u muistestikels in petrischalen van zes centimeter en snijdt u de teelballen in stukjes van één kubieke millimeter met behulp van een chirurgische schaar.

Verwerk vervolgens de teelballen in één milliliter 1% collagenase in een centrifugebuis van 1,5 milliliter gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius. Om spermatogene cellen neer te slaan, centrifugeert u het monster gedurende vijf minuten bij 1.000 G en gooit u het supernatant weg voordat u gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius een milliliter 0,25% trypsine EDTA-oplossing in het monster toevoegt. Centrifugeer het monster later gedurende vijf minuten bij 1.000 G.

Gooi het supernatant weg om de neergeslagen cellen te incuberen met één milliliter 70% koude ethanol gedurende meer dan acht uur bij vier graden Celsius. Na centrifugatie bij 1.000 G gedurende vijf minuten, verzamel celsedimenten en kleur de spermatogene cellen met 500 microliter propidiumjodide of PI-kleuringsoplossing bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten. Filter na de incubatie het monster met behulp van een scherm met 300 mazen om celresten te verwijderen en verzamel de cellen in een stroombuis om de cellen bij vier graden Celsius op te slaan.

Detecteer fluorescentiesignalen en lichtverstrooiing op de excitatiegolflengte op 488 nanometer met behulp van een flowcytometer. Analyseer het DNA-gehalte in het monster en de lichtverstrooiing met behulp van de ModFit MF LT 32-software. Na testiculaire injectie van GSK923295 was de spermatogene golf veranderd in de seminifere tubuli als gevolg van CENP-E-remming.

De spermatogene golf in de seminifere tubuli was echter regelmatig en georganiseerd in de controlegroep. Er werd waargenomen dat de verschillende homologe chromosomen niet waren uitgelijnd op de equatoriale plaat na CENP-E-remming. Bovendien leidde CENP-E-remming tot de toename van metafase I-spermatocyten in seminifere tubuli.

De immunofluorescentieanalyse toonde het verminderde aantal anti-synaptonemale complexe eiwit drie of SYCP3-positieve cellen per seminifere tubulus na CENP-E-remming. Aan de andere kant werden de SYP3-stippen per metafasecel en de SYP3-stretches per cel niet beïnvloed in de GSK92395 groepen. De afstanden van spindelpolen in metafase I spermatocyten werden vergroot als gevolg van CENP-E-remming.

De representatieve analyse toont aan dat CENP-E-remming resulteerde in de afname van de haploïde cellen in de GSK 923295-groep in vergelijking met controlegroep. De verhoudingen van de diploïde cellen en aneuploïdiecellen werden niet significant beïnvloed na CENP-E-remming. Omgekeerd namen de verhoudingen van de tetraploïde cellen in de GSK923295 groep toe dan in de controlegroep.

De transmissie-elektronenmicroscopieanalyse van de spermatogene cellen toonde de verstoorde organisatie van spermatogene cellen in de GSK923295 groep. De experimentator moet aandacht besteden aan de injectiepositie, medicijndosis, injectiemethode en hechtmethode tijdens buikchirurgie en testiculaire injectie. Deze techniek samen met in vivo elektroporatie gericht op de beoogde eiwitten en de genbewerkingstools kunnen worden gebruikt op het gebied van miotische deling en spermatogenese.