Isolatie en karakterisering van intact fycobilisoom in cyanobacteriën

Het is een eenvoudig en snel protocol waarmee mensen die niet bekend zijn met cyanobacteriën op hun gemak fycobilisoom kunnen isoleren. Het voordeel van deze techniek is dat deze is aangepast aan een kleine schaal en het is gemakkelijk uit te voeren. Het is een eenvoudige, betrouwbare en efficiënte methode voor het isoleren van intacte fycobilisomen van model- en niet-modelcynobacteriën.

Begin met het overbrengen van de celcultuur van 0,8 OD bij 750 nanometer in een kolf van één liter en verdun deze in 500 milliliter B-HEPES-medium om de OD van 0,2 bij 750 nanometer te bereiken. Kweek de cultuur met constant roeren bij 30 graden Celsius totdat de OD 0,8 tot 1 bereikt, wat wijst op een late exponentiële groeifase. Centrifugeer de cultuur met een snelheid van 10.000 maal g gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur en gooi het supernatant weg.

Suspensie van de celkorrels en tweemaal gewassen met 0,75 molaire kaliumfosfaatbuffer, pH zeven. Pellet de cellen in een centrifugebuis van 50 milliliter door centrificatie bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg en resuspend de cellen met 0,75 molaire kaliumfosfaatbuffer.

Meet het natte gewicht van de pellet met een elektronische balans en resuspend het natte gewicht van één gram van de pellet in vijf milliliter van de buffer. Voeg een milliliter celsuspensie en 0,4 tot 0,6 gram 0,1 millimeter glasparels toe aan een injectieflacon met schroefdop van twee milliliter. Breek de cellen gedurende 30 seconden door een kralenklopper.

Laat de buizen twee minuten afkoelen in een waterbad op kamertemperatuur. Centrifugeer na lysis de injectieflacons gedurende 10 seconden bij kamertemperatuur met een snelheid van 500 maal g. Verzamel het supernatant met een pipet in een centrifugebuis van 15 milliliter.

Was de kralen één keer met 0,5 milliliter van 0,75 molaire kaliumfosfaatbuffer en breng ze vervolgens over naar dezelfde centrifugebuis. Voeg Triton X-100 toe aan de gelyseerde celsuspensie en incubeer op een schommelende shaker bij kamertemperatuur en 40 RPM gedurende 20 minuten of totdat de oplossing homogeen wordt. Centrifugeer de buisjes gedurende 20 minuten bij 17, 210 maal g en bewaar het supernatant zonder de bovenste Triton-micellaag maximaal een uur bij kamertemperatuur.

Maak vier concentraties sucrose in 0,75 molaire kaliumfosfaatbuffer bij pH zeven. Breng 2,8 milliliter van twee molaire sucrosebuffer aan op de bodem van de centrifugebuis van 40 milliliter en leg er drie lagen sucrose-oplossingen overheen. Voeg ten slotte drie milliliter PBS toe die de supernatantfractie bevat en centrifugeer de resulterende gradiënten.

Condenseer bij ultracentrificatie de gefractioneerde PBS en fycobiliproteïnen tussen de lagen en observeer de blauwe banden in Syn6803 en interfaces. Verwijder de sucrose door de fracties herhaaldelijk te concentreren en te verdunnen met 0,75 molaire kaliumfosfaatbuffer en membraan de centrifugaalfiltereenheden. Voor het meten van PBS-fluorescentie verdunt u het geconcentreerde PBS-monster met een molaire kaliumfosfaatbuffer van 0,75 molaire kaliumfosfaat tot een volume van maximaal 500 microliter.

Voeg het verdunde PBS-monster toe aan een transparante glazen buis en vries de buis in vloeibare stikstof totdat deze volledig bevroren is. Verplaats de bevroren buis naar een transparante dewar container voorgevuld met vloeibare stikstof. Complete cellysis toont de bovennatuurlijke en donkerblauwgroene kleur vóór centrificatie.

De sucrosedichtheidsgradiëntscheiding van geïsoleerde PBS toont verschillende fracties van gedissocieerde fycobiliproteïnen en de laagste fractie vertegenwoordigt de intacte PBS. De absorptiespectra van de gedissocieerde en intacte PBS van JSC one en Syn6803 hebben dezelfde piek op 622 nanometer, overeenkomend met het phycocyanine. Bovendien piekt de fycoerythrinabsorptie op 571 nanometer in zowel gedissocieerde als intacte PBS van JSC-1.

De emissiespectra van de gedissocieerde PBS hebben één sterke piek op ongeveer 650 nanometer in Syn6803 en JSC-1, wat de emissie van fycocyanine vertegenwoordigt. De maximale pieken van de fluorescerende emissie op 651 nanometer en 684 nanometer laten zien dat de energie die door phycocyanine wordt geoogst, efficiënt werd overgedragen aan allophycocyanine en terminale emitters, die ApcD en ApcE zijn, in de kern. De figuur toont zink gekleurd SDS-PAGE onder UV-bestraling waarbij de phycobiliproteïne-subeenheden sterk fluorescerend zijn en de ApcE zwakke fluorescentie vertoonde, aangegeven met de pijl.

Kumasi blauwe kleuring laat zien dat de bovenste fracties andere niet-PBS wateroplosbare eiwitten bevatten en de intacte PBS en Syn6803 toont een prominente ApcE-band, aangegeven met een pijl, die ontbreekt in de gedissocieerde PBS-fracties. Ultracentrifugatie toont aan dat de sucrosegradiënt bereid in een verhouding van 1:3 bredere banden vertoont dan de gradiënt gemaakt in een verhouding van 1:10. Het is belangrijk om de cellen te lysisen en de supernatanten volledig te solucleren om meer fycobilisomen te verkrijgen.

Andere methoden, zoals cryo-EM of gemengde spectrometrie, kunnen worden gebruikt om de eiwitstructuur of de eiwitsamenstelling van fycobilisomen te bestuderen.