Autofluorescentie beeldvorming om cellulair metabolisme te evalueren

ADH en FAD zijn endogene moleculen die autofluorescentie vertonen bij verschillende excitatie- en emissiegolflengten. Vanwege hun gebruik als co-enzymen van metabole reacties, kan autofluorescentiemicroscopie het cellulaire metabolisme beoordelen. Autofluorescentie beeldvorming van NADH en FAD vereist geen exogene labels en is een niet-destructieve methode met subcellulaire resolutie.

Autofluorescentiemicroscopie kan worden gebruikt op levende monsters en voor tijdsverloopstudies. Autofluorescentie beeldvorming kan breed worden toegepast op alle levende cellen of weefsels. Autofluorescente beeldvorming is gebruikt op neuron-, kankercel-, tumor-, in-vivo-, stamcel- en immuuncellen.

Linghao Hu, een afgestudeerde student van het Quantitative Optical Imaging Laboratory aan de Texas A & M University, demonstreert de procedure. Start het experiment door alle componenten van de multi-foton fluorescentielevensmicroscoop in te schakelen, inclusief de laserbron en de detectoren. Schakel voordat u het monster plaatst de felle veldlamp in en zorg ervoor dat het licht in het oculair gaat.

Kies vervolgens een objectief voor de celbeeldvorming. Als u geen luchtdoel gebruikt, brengt u één druppel van het juiste onderdompelingsmedium bovenop het doel aan. Plaats de schaal met glazen bodem op de monsterhouder op het microscooppodium.

Centreer vervolgens het monster met het doel met behulp van de X / Y-faseregeling Zorg ervoor dat het monster is beveiligd en niet zal bewegen tijdens het afbeelden. Als je klaar bent, kijk je in het oculair en beweeg je het objectief omhoog om je op de cellen te concentreren. Als de microscoop zich in een behuizing bevindt, sluit u de deur van de lichtbak.

Open vervolgens de beeldacquisitiesoftware en klik op het tabblad Multi-photon Imaging om de multi-fotonbeeldvormingsparameters in te stellen zoals beschreven in het manuscript. Stel de versterking van de detector in op de optimale waarde voor de fluorescentielevensbeeldvorming of FILM. Wijzig vervolgens de verblijftijd van de laserbesteding bij elke pixel van het monster in de gewenste waarde.

Voor nicotinamide adeninefosfaat dinucleotide, of NADPH, stel de multi-fotonenlaser in op 750 nanometer. Controleer vervolgens of de stroomregeling voor de laser op nul is ingesteld, zodat de cellen niet worden beschadigd bij het openen van de sluiter op de laser. Stel een emissiefilter in op 400 tot 500 nanometer.

Wanneer de parameters zijn ingesteld, begint u met het maken van beelden op een focus- of liveweergave-manier om de beeldinstellingen te optimaliseren. Verhoog het laservermogen langzaam van drie naar acht milliwatt en zorg ervoor dat de cellen scherp zijn. Eenmaal aangepast, registreert u het maximale gebruikte vermogen.

Gebruik de geregistreerde maximale vermogensinstelling voor de beeldvorming op andere segmenten van de petrischaal. Verzamel een NADPH-FILM-beeld met een beeldintegratietijd van 60 seconden en controleer of het beeld een voldoende aantal fotonen heeft, zoals een piek van 100 fotonen voor een cytoplasmapixel binnen de fluorescentielevensvervalcurve. Als het aantal fotonen te laag is, verhoogt u het laservermogen of de duur van de beeldacquisitie.

Voor de flavine adenine dinucleotide, of FAD, beeldvorming, stel de multi-fotonlaser in op 890 nanometer en wacht tot de laser op de nieuwe golflengte in stand is. Zorg ervoor dat de vermogensregeling voor de laser in eerste instantie op nul is ingesteld. Stel een emissiefilter in op 500 tot 600 nanometer.

Om de beeldinstellingen te optimaliseren, begint u met het maken van beelden op een focus- of liveweergave-manier door het laservermogen te verhogen tot 5 tot 10 milliwatt en het maximale gebruikte vermogen vast te leggen. Gebruik dezelfde energie-instelling voor de FAD-beeldvorming van volgende gezichtsvelden. Verzamel het FAD-FILM-beeld met een beeldintegratietijd van 60 seconden en controleer of het beeld voldoende fotonen heeft binnen de fluorescentielevensduurvervalcurve.

Als het aantal fotonen te laag is, verhoogt u het laservermogen of de duur van de beeldacquisitie en herhaalt u de beeldvorming voor nog eens vier tot vijf gezichtsvelden of FOV's, waarbij elk beeld op twee FOV's afstand staat. Om een 80-millimolaire natriumcyanideoplossing te maken, lost u 130,24 milligram natriumcyanide op in 25 milliliter PBS. Zuig uit de kweekschaal 100 microliter kweekmedium op om te vervangen door 100 microliter natriumcyanideoplossing om een vier millimolaire concentratie cyanide in het gerecht te verkrijgen.

Plaats de cellen vijf minuten in een couveuse om de cellen te laten reageren met de cyanide-oplossing. Na de cyanideblootstelling, verkrijg NADPH- en FAD-beelden van de cellen zoals eerder beschreven. De studie berekende de fluorescentielevensduurparameters met behulp van de gemeten instrumentresponsfunctie, of IRF, van ureum.

De parameters werden gemiddeld over de pixels van het cytoplasma van elke cel die werd gebruikt voor segmentatie. Individuele cellen werden geïdentificeerd en gemaskeerd om achtergrondgeluiden te elimineren. Vervolgens werd de kern geïdentificeerd en geprojecteerd op het celmasker.

Verder werden de cellen gefilterd om de gemaskeerde gebieden te verwijderen die niet passen bij de grootte van typische cellen. De multi-foton fluorescentie lifetime imaging van NADPH en FAD maakte visualisatie van celmorfologie en metabolisme voor en na cyanidebehandeling mogelijk. Er werd waargenomen dat nadph-levensduur afneemt met cyanidebehandeling, terwijl de FAD-levensduur toeneemt na cyanidebehandeling.

De representatieve box plot gaf aan dat de optische redoxverhouding van MCF7-cellen afnam na behandeling met cyanide. De blootstelling aan cyanide verminderde de amplitudegewogen NADPH-levensduur van MCF7-cellen. De korte en lange levensduur nam af voor NADPH, maar nam toe voor NADPH alfa.

Voor FAD nam de amplitudegewogen levensduur van MCF7-cellen toe na blootstelling aan cyanide. Zowel de korte als de lange levensduur namen toe voor FAD, maar daalden voor FAD alpha one. Het is belangrijk om voldoende laservermogen naar de monsters te hebben, maar onthoud dat te veel vermogen schade aan de cellen kan veroorzaken.

Omdat autofluorescentie beeldvorming niet schadelijk is voor de cellen, kunnen latere biochemische assays op dezelfde monsters worden gebruikt.