Name: Karakterisering van bloeduitgroei endotheelcellen (BOEC) uit perifeer bloed van varkens (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Leer hoe je bloeduitgroei endotheelcellen (BOEC) genereert uit perifeer varkensbloed voor weefselengineering en celtherapie. Dit protocol optimaliseert celviabiliteit en proliferatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen de financiering van NIH / NHLBI R00 HL129068 erkennen.

Alle dierstudies werden goedgekeurd door de respectievelijke Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) aan het Medical College of Wisconsin en Mayo Clinic.
OPMERKING: In deze studie werden Yorkshire/Landrace/Duroc gedomesticeerde varkens (Sus domesticus), mannelijk en vrouwelijk, 40-80 kg, 3-6 maanden oud, gebruikt.
1. Inzameling van perifeer bloed van varkens
<ol><li>Bereid materialen voor.<ol><li>Verdun heparineoplossing tot 100 E/ml in steriele zoutoplossing.</li>
		<li>Voeg 3-4 ml heparine-oplossing toe aan elk van de twee conische buisjes van 50 ml en twee spuiten van 60 ml.</li>
		<li>Zuig onverdunde heparine-oplossing (1.000 E / ml) in een verlengbuis.</li>
		<li>Sluit een naald van 19 G aan op het ene uiteinde van de met heparine gevulde verlengbuis en een heparinehoudende spuit van 60 ml op het andere uiteinde.</li>
	</ol></li>
	<li>Verdoof een varken volgens institutioneel beleid<ol><li>Dien een IM-injectie van atropine (0,05 mg / kg), tiletamine / zolazepam (2-5 mg / kg) en xylazine (2 mg / kg) toe om anesthesie te induceren. OPMERKING: adequate anesthesie wordt bereikt zodra het dier bewusteloos is en de mandibulaire spieren niet-stijf zijn.</li>
		<li>Leg het dier in rugligging en leg opgerolde handdoeken aan beide zijden om stabiliteit te bieden.</li>
		<li>Breng een oogheelkundige zalf aan op de ogen om uitdroging te voorkomen terwijl u onder narcose bent.</li>
		<li>Bied thermische ondersteuning tijdens anesthesie, inclusief dekens, verwarmingspads en / of verwarmde proceduretafel.</li>
	</ol></li>
	<li>Reinig het femorale liesgebied met betadine scruboplossing.</li>
	<li>Prik de dijbeenader of slagader door met de naald van 19 G en trek langzaam (~ 1-2 ml / s) 50 ml bloed in de spuit. OPMERKING: Te snel tekenen kan de cellen beschadigen.</li>
	<li>Laat de naald op zijn plaats, knik onmiddellijk de verlengbuis en koppel de spuit van 60 ml los</li>
	<li>Breng het bloed langzaam over naar een heparine-bevattende 50 ml conische buis.</li>
	<li>Sluit de conische buis van 50 ml stevig af, keer een paar keer voorzichtig om om te mengen en plaats op ijs.</li>
	<li>Sluit de resterende heparine-bevattende spuit van 60 ml aan op de verlengbuis, maak de verlengbuis los en trek langzaam nog eens 50 ml bloed in de spuit.</li>
	<li>Verwijder onmiddellijk de naald uit de slagader of ader en trek langzaam het resterende bloed uit de verlengbuis in de spuit.</li>
	<li>Koppel de spuit van 60 ml los van de verlengbuis en breng het bloed langzaam over naar de resterende heparinehoudende conische buis van 50 ml.</li>
	<li>Sluit de conische buis van 50 ml stevig af, keer een paar keer voorzichtig om om te mengen en plaats op ijs.</li>
	<li>Oefen hemostase uit op het femorale liesgebied van het varken.</li>
	<li>Herstel het varken volgens het institutionele beleid. Houd het dier voortdurend in de gaten totdat het weer voldoende bewustzijn heeft om sternale lighouding te behouden en terug te keren naar de reguliere huisvesting / kennel.</li>
</ol>2. Isolatie van mononucleaire cellen
<ol><li>Verdun het bloed 1:1 met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) in vier conische buisjes van 50 ml. OPMERKING: Dit werk moet worden uitgevoerd in een celkweekkap met behulp van een aseptische techniek om besmetting van de celcultuur te voorkomen.</li>
	<li>Voeg 25 ml kant-en-klare dichtheidsgradiëntoplossing op kamertemperatuur toe aan acht conische buizen van 50 ml.</li>
	<li>Pipetteer zeer langzaam 25 ml bloed/zoutoplossing langs de binnenkant van elke dichtheidsgradiëntoplossing met een conische buis van 50 ml door de buis in een scherpe hoek ten opzichte van de pipetpunt te houden. OPMERKING: De bloedoplossing moet voorzichtig bovenop de dichtheidsgradiëntoplossing worden gelegd en een goed gedefinieerde interface behouden.</li>
	<li>Centrifugeer de buizen gedurende 30 minuten op 560 x g en kamertemperatuur (RT). OPMERKING: Voor het beste resultaat schakelt u indien mogelijk de centrifugerem uit.</li>
	<li>Gebruik een dunne pipet om de buffy coat (troebele laag mononucleaire cellen boven de dichtheidsgradiëntoplossing en onder het heldere plasma) voorzichtig uit elke buis te verzamelen en gelijkmatig te verdelen in twee nieuwe conische buizen van 50 ml. Gooi de dichtheidsgradiëntoplossing met buizen weg. OPMERKING: Verzamel zoveel mogelijk van de buffy coat terwijl je zo min mogelijk van de dichtheidsgradiëntoplossing en het plasma verzamelt.</li>
</ol>3. Wassen en plateren van cellen
<ol><li>Bestrijk een 6-well plaat met fibronectine.<ol><li>Maak een stamoplossing van menselijk plasmafibronectine door het te verdunnen tot 1 mg / ml in steriel water. Bewaar de aliquots bij -20 °C.</li>
		<li>Maak 3,6 ml van een werkoplossing van fibronectine door 600 μL fibronectine-stamoplossing te verdunnen in 3 ml PBS.</li>
		<li>Breng 600 μL van de fibronectine-werkoplossing over in elke put van een 6-putplaat en schommel zachtjes tot een gelijkmatige laag.</li>
		<li>Wacht 30 minuten tot de fibronectine de putjes bedekt en zuig de oplossing voorzichtig uit elk putje.</li>
	</ol></li>
	<li>Terwijl u wacht tot de fibronectine is gecoacht, wast u de mononucleaire cellen<ol><li>Vul de buizen bij met maximaal 45 ml PBS</li>
		<li>Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 560 x g en 4 °C met lage rem. Zuig het supernatant uit beide buizen.</li>
		<li>Resuspendeer elke celpellet in 25 ml PBS.</li>
		<li>Herhaal dit om een tweede keer te wassen.</li>
	</ol></li>
	<li>Resuspendeer elke celpellet in 5 ml PBS en voeg 15 ml 0,8% ammoniumchlorideoplossing toe aan elke buis. OPMERKING: Deze stap is om de resterende rode bloedcellen te lyseren.</li>
	<li>Incubeer gedurende 10 minuten op ijs.</li>
	<li>Was de cellen zoals voorheen door de buizen bij te vullen met PBS en gedurende 5 minuten te centrifugeren bij 560 x g en 4 °C met lage rem. Zuig het supernatant uit beide buizen.</li>
	<li>Resuspendeer elke celkorrel in 25 ml PBS en herhaal om een tweede keer te wassen.</li>
	<li>Resuspendeer elke celpellet in 6 ml EGM-2-kweekmedium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1x antibioticum / antimycotische oplossing met 10.000 U / ml penicilline, 10 mg / ml streptomycine en 25 μg / ml amfotericine. OPMERKING: EGM-2 kweekmedium bestaat uit EBM-2 kweekmedium aangevuld met 200 μL hydrocortison, 2 ml humane fibroblastgroeifactor (hFGF-B), 500 μL vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF), 500 μL recombinant analoog van insuline-achtige groeifactor (R3 IGF-1), 500 μL ascorbinezuur, 500 μL humane epidermale groeifactor (hEGF), 500 μL gentamicine/amfotericine en 500 μL heparine per 500 ml.</li>
	<li>Breng voorzichtig 2 ml van de celsuspensie over naar elk putje van de met fibronectine gecoate 6-putplaat en schommel zachtjes tot een gelijkmatige laag. OPMERKING: Het doel is om zoveel mogelijk cellen te zaaien om het aantal endotheelkolonies dat zich zal vormen te maximaliseren.</li>
</ol>4. Celkweek
<ol><li>Incubeer de cellen bij 37 °C, 5% CO2 en 100% vochtigheid.</li>
	<li>Voeg de volgende dag voorzichtig 1 ml vers kweekmedium toe aan elk putje. OPMERKING: het is belangrijk om voorzichtig te zijn om cellen die losjes aan de fibronectinecoating hechten niet te verstoren.</li>
	<li>Voer de volgende dag een halve kweekmediumverandering uit door voorzichtig 1,5 ml kweekmedium uit elke put te zuigen en te vervangen door 1,5 ml vers kweekmedium.</li>
	<li>Voer op elk van de volgende 5 dagen voorzichtig een volledige verandering van het kweekmedium uit naar elke put (2 ml vers kweekmedium per put).</li>
	<li>Verander daarna het kweekmedium drie keer per week voorzichtig.</li>
	<li>Visualiseer de celculturen regelmatig onder low power (4x objectief) lichtmicroscopie. OPMERKING: Aanhangende bloeduitgroei endotheelcel (BOEC) kolonies zullen 7-10 dagen na het plateren in de putten verschijnen. Niet-adherente celtypen zullen worden weggegooid met mediumveranderingen en andere adherente celtypen zullen geleidelijk verdwijnen naarmate de BOEC-kolonies groeien.</li>
	<li>Passeer de BOEC's in een met fibronectine gecoate T-75-kolf wanneer ~ 70% -80% samenvloeit en blijf drie keer per week van cultuurmedium veranderen. OPMERKING: De zaaidichtheid kan worden geregeld door kolonies in plaats daarvan in een T25-kolf te plaatsen. Volgende passages vereisen geen fibronectine-coating en veranderingen in het kweekmedium kunnen worden teruggebracht tot twee keer per week.</li>
	<li>Cellen uit de passages 1-3 kunnen worden gebruikt voor experimenten of worden overgebracht naar een vriesmedium en worden opgeslagen in vloeibare stikstof voor toekomstig gebruik.</li>
</ol>

<ol><li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+heterogeneity+of+the+endothelium%3A+II.+Representative+vascular+beds%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds.</a> Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).</li>
<li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+heterogeneity+of+the+endothelium%3A+I.+Structure%2C+function%2C+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Phenotypic heterogeneity of the endothelium: I. Structure, function, and mechanisms.</a> Circulation Research. 100 (2), 158-173 (2007).</li>
<li>Pober, J. S., Tellides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Participation+of+blood+vessel+cells+in+human+adaptive+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Participation of blood vessel cells in human adaptive immune responses.</a> Trends in Immunology. 33 (1), 49-57 (2012).</li>
<li>Navarro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelial+cell+protein+C+receptor%3A+its+role+in+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">The endothelial cell protein C receptor: its role in thrombosis.</a> Thrombosis Research. 128 (5), 410-416 (2011).</li>
<li>Hasstedt, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+molecule+1%3A+a+novel+risk+factor+for+venous+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion molecule 1: a novel risk factor for venous thrombosis.</a> Blood. 114 (14), 3084-3091 (2009).</li>
<li>Ormiston, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+culture+of+blood+outgrowth+endothelial+cells+from+human+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Generation and culture of blood outgrowth endothelial cells from human peripheral blood.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (106), e53384(2015).</li>
<li>Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+circulating+endothelial+cells+and+endothelial+outgrowth+from+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood.</a> Journal of Clinical Investigation. 105 (1), 71-77 (2000).</li>
<li>Martin-Ramirez, J., Hofman, M., Biggelaar, M. V. D., Hebbel, R. P., Voorberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+outgrowth+endothelial+cells+from+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Establishment of outgrowth endothelial cells from peripheral blood.</a> Nature Protocols. 7 (9), 1709-1715 (2012).</li>
<li>Gulati, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+origin+and+function+of+cells+with+endothelial+phenotype+obtained+from+adult+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Diverse origin and function of cells with endothelial phenotype obtained from adult human blood.</a> Circulation Research. 93 (11), 1023-1025 (2003).</li>
<li>Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+endothelial+cells%3A+utility+from+ambiguity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Blood endothelial cells: utility from ambiguity.</a> The Journal of Clinical Investigation. 127 (5), 1613-1615 (2017).</li>
<li>Medina, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+progenitors%3A+A+consensus+statement+on+nomenclature%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Endothelial progenitors: A consensus statement on nomenclature.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (5), 1316-1320 (2018).</li>
<li>Medina, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+endothelial+progenitor+cell+%28EPC%29+subtypes+reveals+two+distinct+cell+populations+with+different+identities%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medical+Genomics%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of endothelial progenitor cell (EPC) subtypes reveals two distinct cell populations with different identities.</a> BMC Medical Genomics. 3, 18(2010).</li>
<li>Jiang, A., Pan, W., Milbauer, L. C., Shyr, Y., Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+question+based+on+cross-platform+microarray+data+normalization%3A+are+BOEC+more+like+large+vessel+or+microvascular+endothelial+cells+or+neither+of+them%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioinformatics+and+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">A practical question based on cross-platform microarray data normalization: are BOEC more like large vessel or microvascular endothelial cells or neither of them.</a> Journal of Bioinformatics and Computational Biology. 5 (4), 875-893 (2007).</li>
<li>Pan, W., Shen, X., Jiang, A., Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-supervised+learning+via+penalized+mixture+model+with+application+to+microarray+sample+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Semi-supervised learning via penalized mixture model with application to microarray sample classification.</a> Bioinformatics. 22 (19), 2388-2395 (2006).</li>
<li>Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+identity%2C+phenotype%2C+and+fate+of+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (9), 1584-1595 (2008).</li>
<li>Fernandez, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+outgrowth+endothelial+cells+from+hereditary+haemorrhagic+telangiectasia+patients+reveal+abnormalities+compatible+with+vascular+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Blood outgrowth endothelial cells from hereditary haemorrhagic telangiectasia patients reveal abnormalities compatible with vascular lesions.</a> Cardiovascular Research. 68 (2), 235-248 (2005).</li>
<li>Critser, P. J., Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+colony-forming+cell+role+in+neoangiogenesis+and+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Organ+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Endothelial colony-forming cell role in neoangiogenesis and tissue repair.</a> Current Opinion in Organ Transplantation. 15 (1), 68-72 (2010).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+primary+aortic+endothelial+cells+from+miniature+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of primary aortic endothelial cells from miniature pigs.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59673(2019).</li>
<li>Chang Milbauer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+endothelial+systems+biology+of+sickle+stroke+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Genetic endothelial systems biology of sickle stroke risk.</a> Blood. 111 (7), 3872-3879 (2008).</li>
<li>Wei, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+endothelial+cell+gene+expression+by+African+Americans+versusCaucasian+Americans%3A+a+possible+contribution+to+health+disparity+in+vascular+disease+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medicine%22%5BJournal%5D)">Differential endothelial cell gene expression by African Americans versusCaucasian Americans: a possible contribution to health disparity in vascular disease and cancer.</a> BMC Medicine. 9 (1), 2(2011).</li>
<li>Hasstedt, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+molecule+1%3A+a+novel+risk+factor+for+venous+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%2C+The+Journal+of+the+American+Society+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion molecule 1: a novel risk factor for venous thrombosis.</a> Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 114 (14), 3084-3091 (2009).</li>
<li>Milbauer, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+outgrowth+endothelial+cell+migration+and+trapping+in+vivo%3A+a+window+into+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Blood outgrowth endothelial cell migration and trapping in vivo: a window into gene therapy.</a> Translational Research. 153 (4), 179-189 (2009).</li>
<li>Matsui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+gene+therapy+for+hemophilia+A+that+enhances+safe+delivery+and+sustained+in+vivo+factor+VIII+expression+from+lentivirally+engineered+endothelial+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Ex vivo gene therapy for hemophilia A that enhances safe delivery and sustained in vivo factor VIII expression from lentivirally engineered endothelial progenitors.</a> Stem Cells. 25 (10), 2660-2669 (2007).</li>
<li>De Meyer, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+correction+of+von+Willebrand+disease+type+3+blood-derived+endothelial+cells+with+lentiviral+vectors+expressing+von+Willebrand+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Phenotypic correction of von Willebrand disease type 3 blood-derived endothelial cells with lentiviral vectors expressing von Willebrand factor.</a> Blood. 107 (12), 4728-4736 (2006).</li>
<li>Bodempudi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+outgrowth+endothelial+cell-based+systemic+delivery+of+antiangiogenic+gene+therapy+for+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Blood outgrowth endothelial cell-based systemic delivery of antiangiogenic gene therapy for solid tumors.</a> Cancer Gene Therapy. 17 (12), 855-863 (2010).</li>
<li>Dudek, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+inhibition+of+tumour+angiogenesis+by+endothelial+cell-based+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Systemic inhibition of tumour angiogenesis by endothelial cell-based gene therapy.</a> British Journal of Cancer. 97 (4), 513-522 (2007).</li>
<li>Moubarik, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplanted+late+outgrowth+endothelial+progenitor+cells+as+cell+therapy+product+for+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Transplanted late outgrowth endothelial progenitor cells as cell therapy product for stroke.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 7 (1), 208-220 (2011).</li>
<li>Pislaru Sorin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+forces+enable+rapid+endothelialization+of+synthetic+vascular+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Magnetic forces enable rapid endothelialization of synthetic vascular grafts.</a> Circulation. 114 (1), 314(2006).</li>
<li>Satyananda, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+concepts+of+immune+modulation+in+xenotransplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">New concepts of immune modulation in xenotransplantation.</a> Transplantation. 96 (11), 937-945 (2013).</li>
<li>Klymiuk, N., Aigner, B., Brem, G., Wolf, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modification+of+pigs+as+organ+donors+for+xenotransplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">Genetic modification of pigs as organ donors for xenotransplantation.</a> Molecular Reproduction and Development. 77 (3), 209-221 (2010).</li>
<li>Ryczek, N., Hryhorowicz, M., Zeyland, J., Lipiński, D., Słomski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas+technology+in+pig-to-human+xenotransplantation+research%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas technology in pig-to-human xenotransplantation research.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 3196(2021).</li>
<li>Cooper, D. K., Koren, E., Oriol, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+engineered+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Genetically engineered pigs.</a> Lancet. 342 (8872), 682-683 (1993).</li>
<li>Cozzi, E., White, D. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+of+transgenic+pigs+as+potential+organ+donors+for+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">The generation of transgenic pigs as potential organ donors for humans.</a> Nature Medicine. 1 (9), 964-966 (1995).</li>
<li>Phelps, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+alpha+1%2C3-galactosyltransferase-deficient+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Production of alpha 1,3-galactosyltransferase-deficient pigs.</a> Science. 299 (5605), New York, N.Y. 411-414 (2003).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

BOEC's zijn een krachtig instrument dat kan worden gebruikt in verschillende wetenschappelijke en therapeutische benaderingen 7,8,16. BOEC's zijn gebruikt om EC-genexpressie te analyseren om de belangrijkste factoren op te helderen die verantwoordelijk zijn voor de ontwikkeling van vaatziekten en kanker 5,19,20,21.<sup class=...

Het endotheel is een zeer complexe, dynamische structuur en een essentieel onderdeel van de vaatwand. Het bekleedt het binnenoppervlak van bloedvaten om een fysieke interface te bieden tussen circulerend bloed en omliggende weefsels. Van deze heterogene structuur is bekend dat ze verschillende functies vervult, zoals angiogenese, ontsteking, vasoregulatie en hemostase 1,2,3,4. Menselijke navelstreng-endotheelcellen zijn een veel bestudeerd celtype om de functionaliteit van endotheelcellen te beoordelen. De patiëntspecifieke batchvariabiliteit, het inconsistente fenotype en de minimale splitsingsefficiëntie suggereren echter de noodzaak om een celbron te bepalen die al deze kenmerken zou kunnen verbeteren5.
Het verkrijgen van een homogene populatie van primaire endotheelcellen kan technisch een uitdaging zijn en primaire endotheelcellen bezitten geen hoge proliferatieve capaciteit6. Om vasculaire regeneratie te bestuderen en pathofysiologische processen te evalueren, hebben verschillende groepen daarom geprobeerd verschillende soorten endotheelcellen afgeleid van perifeer bloed te verkrijgen en te beoordelen, bijvoorbeeld endotheelvoorlopercellen (EPC's) of endotheelcellen met bloeduitgroei (BOECs)6,7,8,9 . De spilvormige vroege EPC's zijn afkomstig van hematopoëtische stamcellen (HSC's) en hebben een beperkte groeikracht en een beperkt angiogeen vermogen om volwassen endotheelcellen te produceren. Bovendien lijken ze sterk op inflammatoire monocyten. Bovendien is hun vermogen om verder te differentiëren in functionele, prolifererende, volwassen endotheelcellen nog steeds discutabel 6,7,9,10. De continue kweek van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) kan aanleiding geven tot een secundaire populatie van cellen die bekend staat als late-outgrowth EPC's, BOEC's of endotheelkolonievormende cellen (ECFC's)6,7,9,10. Medina et al. erkenden in 2018 de beperkingen van EPC's, de ambiguïteit van hun nomenclatuur, samen met een algemeen gebrek aan overeenstemming met veel verschillende celtypen die continu zijn gegroepeerd onder EPC's11. BOEC's daarentegen zijn erkend voor hun rol in vasculair herstel, gezondheid en ziekte, en celtherapie. Verdere studie en therapeutisch gebruik van deze cellen zal afhankelijk zijn van protocollen om deze celtypen consequent af te leiden uit circulerende voorlopercellen.
Primaire cellen zoals BOEC's kunnen worden gebruikt als surrogaat om zeer proliferatieve volwassen endotheelcellente verkrijgen 6. BOEC's zijn fenotypisch verschillend van vroege EPC's en vertonen typische endotheelkenmerken zoals kasseimorfologie en expressie van adherens junctions en caveolae12. Genprofilering door Hebbel et al.13,14,15 vond dat BOECs of ECFC's de echte endotheelcellen zijn omdat ze microvasculaire en grote vatvorming bevorderen. BOEC's kunnen dus worden gebruikt als een hulpmiddel om pathofysiologische processen en genetische variatie te evalueren16. Ze worden ook beschouwd als een uitstekende celbron voor celtherapie voor vasculaire regeneratie17. Daarom is een gestandaardiseerd protocol om deze zeer proliferatieve cellen consequent af te leiden essentieel.
Hoewel BOEC's een krachtig instrument bieden voor het bestuderen van pathofysiologische en genetische variatie bij de mens, kan een meer homogene bron van BOEC's robuustere en betrouwbaardere experimentele en therapeutische resultaten opleveren. Superieure homogeniteit kan worden bereikt door gebruik te maken van xenogene celbronnen die zijn afgeleid van genetisch vergelijkbare dieren die in vergelijkbare omstandigheden zijn grootgebracht18. Terwijl xenogene celbronnen gevoelig zijn voor het opwekken van een immuunrespons van de gastheer, worden immunomodulatiestrategieën ontwikkeld met als doel immunocompatibele dieren en dierlijke producten, waaronder cellen, te genereren. Varkens, in het bijzonder, zijn een overvloedige bron van perifeer bloed en worden vaak gebruikt om medische hulpmiddelen en andere therapieën te bestuderen vanwege anatomische en fysiologische overeenkomsten met mensen. Daarom verfijnt deze studie het protocol voor de isolatie en uitbreiding van zeer proliferatieve BOEC's uit perifeer bloed van varkens. Het hieronder beschreven protocol is een eenvoudige en betrouwbare methode om een groot aantal BOEC's te verkrijgen uit een relatief klein volume bloed. De culturen kunnen via verschillende passages worden uitgebreid om miljoenen cellen uit één bloedmonster te genereren.

<table><tbody><tr><td>19 G naald</td><td>Covidien</td><td>1188818112</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conische buizen</td><td>Corning</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>6 wel plate</td><td>BD Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>60 mL spuiten</td><td>Covidien</td><td>8881560125</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumchloride oplossing (0,8%)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>07850</td><td></td></tr><tr><td>Antibioticum/antimycotisch oplossing (100x)</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>75-253-839</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 kweekmedium</td><td>Lonza Walkersville</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>Extensiebuis</td><td>Hanna Pharmaceutical Supply Co.</td><td>03382C6227</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum (FBS)</td><td>Atlas Biologicals</td><td>F-0500-A</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque 1077</td><td>Cytiva</td><td>17144003</td><td>Dichtheidsgradiëntoplossing</td></tr><tr><td>Heparine natrium injectie (1.000 eenheden/mL)</td><td>Pfizer</td><td>00069-0058-01</td><td></td></tr><tr><td>Humane plasma fibronectine</td><td>Gibco</td><td>33016-015</td><td></td></tr><tr><td>IJs</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Pipetset</td><td>Eppendorf</td><td>2231300004</td><td></td></tr><tr><td>Steriele water</td><td>Gibco</td><td>15230-162</td><td></td></tr><tr><td>Dunne pipet</td><td>Celltreat Scientific</td><td>229280</td><td></td></tr></tbody></table>

karakterisering van bloeduitgroei endotheelcellen (boec) uit perifeer bloed van varkens

Characterization of Blood Outgrowth Endothelial Cells (BOEC) from Porcine Peripheral Blood

Het endotheel is een dynamische geïntegreerde structuur die een belangrijke rol speelt in veel fysiologische functies zoals angiogenese, hemostase, ontsteking en homeostase. Het endotheel speelt ook een belangrijke rol in pathofysiologieën zoals atherosclerose, hypertensie en diabetes. Endotheelcellen vormen de binnenbekleding van bloed- en lymfevaten en vertonen heterogeniteit in structuur en functie. Verschillende groepen hebben de functionaliteit van endotheelcellen afgeleid van menselijk perifeer bloed geëvalueerd met een focus op endotheelvoorlopercellen afgeleid van hematopoëtische stamcellen of volwassen bloeduitgroei endotheelcellen (of endotheelkolonievormende cellen). Deze cellen bieden een autologe bron voor therapieën en ziektemodellering. Xenogene cellen kunnen een alternatieve bron van therapieën bieden vanwege hun beschikbaarheid en homogeniteit die wordt bereikt door genetisch vergelijkbare dieren te gebruiken die in vergelijkbare omstandigheden zijn grootgebracht. Daarom is een robuust protocol gepresenteerd voor de isolatie en uitbreiding van zeer proliferatieve bloeduitgroei endotheelcellen uit perifeer bloed van varkens. Deze cellen kunnen worden gebruikt voor tal van toepassingen, zoals cardiovasculaire weefselmanipulatie, celtherapie, ziektemodellering, geneesmiddelenscreening, het bestuderen van endotheelcelbiologie en in vitro coculturen om ontstekings- en stollingsreacties bij xenotransplantatie te onderzoeken.

De morfologie van de gekweekte cellen werd waargenomen vanaf het begin van de kweek totdat BOEC-kolonies werden waargenomen (figuur 1). Een kleinere populatie van aanhangende cellen begon zich aan de kweekschalen te hechten en te groeien, terwijl niet-hechtende cellen werden verwijderd met veranderingen in het kweekmedium (figuur 1B). Kolonies verschenen voor het eerst op dag 6 als een verzameling endotheelachtige cellen die zich radiaal naar buiten prolifereerd...

Karakterisering van bloeduitgroei endotheelcellen (BOEC) uit perifeer bloed van varkens

The endothelium is a dynamic integrated structure that plays an important role in many physiological functions such as angiogenesis, hemostasis, ...

Het protocol biedt zeer proliferatieve bloeduitgroei endotheelcellen die kunnen worden gebruikt voor verschillende weefselmanipulatie, celtherapie en ziektemodelleringsonderzoeken. Deze techniek levert consequent veel cellen op uit een enkele bloedafname. Om deze techniek succesvol te laten zijn, is het cruciaal om de cellen zo snel mogelijk in het kweekmedium en de incubatoromgeving te krijgen.Verdun eerst de heparineoplossing tot 100 eenheden per milliliter in steriele zoutoplossing. Voeg drie tot vier milliliter heparine-oplossing toe aan elk van de twee conische buizen van 50 milliliter en twee spuiten van 60 milliliter. Trek vervolgens onverdund 1.000 eenheden per milliliter heparine-oplossing in een verlengbuis.Sluit een naald van 19 gauge aan op het ene uiteinde van de met heparine gevulde verlengbuis en een heparine-bevattende spuit van 60 milliliter op het andere uiteinde van de verlengbuis. Reinig vervolgens het femorale liesgebied van een verdoofd varken met een Betadine-scruboplossing. Prik de femorale ader of slagader door met een naald van 19 gauge en trek met één tot twee milliliter per seconde langzaam 50 milliliter bloed in de spuit.Laat de naald op zijn plaats, kn

characterization-blood-outgrowth-endothelial-cells-boec-from-porcine

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Endotheliale kolonievormende progenitor cellen (ECFCs) zijn een veelbelovend instrument om vasculaire homeostase en reparatie te bestuderen.

Isolatie en grootschalige expansie van volwassen humane endotheelcellen kolonievormende Progenitor Cellen

Wij bieden een methode voor het isoleren en kweken van zuivere populaties van hartklep endotheelcellen (VEC). VEC kan worden geïsoleerd uit beide zijden van de cusp of bijsluiter en onmiddellijk na de onderliggende interstitiële cel (VIC) isolatie is eenvoudig.

Isolatie van Valvulaire endotheelcellen

Een methode voor het zaaien titanium bloed-contact biomaterialen met autologe cellen en het testen van biocompatibiliteit wordt beschreven. Deze methode maakt gebruik van endotheliale progenitor cellen en titanium buizen, zonder zaadjes binnen enkele minuten van de chirurgische implantatie in varkens venae cavae. Deze techniek is aan te passen aan vele andere implanteerbare biomedische apparaten.

Autologe endotheliale voorlopercellen-zaaien Technologie en biocompatibiliteitstests voor cardiovasculaire apparaten in grote Animal Model

We beschrijven een methode om onder hechtende cellen aan laminaire stroming shear stress in een steriele continue stroom circuit. De cellen 'hechting, kan morfologie worden bestudeerd door de transparante kamer, monsters verkregen van het circuit voor de metaboliet-analyse en-cellen geoogst na afschuiving blootstelling voor toekomstige experimenten of cultuur.

Parallelle plaat flow kamer en Continuous Flow Circuit te endotheliale progenitorcellen Evalueer onder laminaire stroom Afschuifspanning

Endotheliale kolonievormende cellen (ECFCs) in omloop zijn endotheelcellen met robuuste klonale proliferatie potentieel dat intrinsieke weer te...

Fenotypische en functionele karakterisering van endotheliale Colony Forming Cellen uit menselijk navelstrengbloed

In this video, we demonstrate the isolation of endothelial cells from the abdominal aorta of a pig model using one-step collagenase digestion. The endothelial cells can be cultured for further downstream applications.

Porcine Aortic Endothelial Cell (pAEC) Isolation: An Enzyme-based Method to Isolate Endothelial Cells from Harvested Porcine Abdominal Aorta

Deze video toont een eenvoudige en betrouwbare strategie voor de bereiding van zuivere kweken van endotheelcellen van embryonale voorhersenen binnen 10-12 dagen en zal nuttig zijn voor onderzoek zich op vele aspecten van cerebrale angiogenese.

Isolatie en Cultuur van de endotheelcellen van de embryonale voorhersenen

Dit protocol maakt de betrouwbare generatie en karakterisering van endotheliale cellen uit bloeduitgroei (BOEC's) mogelijk vanuit een klein volume volwassen perifeer bloed. BOEC's kunnen worden gebruikt als een surrogaat voor endotheelcellen van patiënten met vasculaire aandoeningen en als een substraat voor de generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen.

Generatie en cultuur van Blood uitgroei endotheelcellen van de humane perifere bloed

Hematopoietische stamcellen en progenitorcellen (HSPC) afgeleid van gespecialiseerde (hemogenic) endotheelcellen tijdens de ontwikkeling, maar weinig bekend over het proces waarbij sommige endotheelcellen specificeren bloedvormende worden. We tonen een stroom-cytometrie-gebaseerde methode waarmee gelijktijdige isolatie van hemogenic endotheelcellen en HSPC van muizen embryonale weefsels.

Isolatie van muizen embryonale Hemogenic endotheelcellen

Het doel van dit protocol is te isoleren van endotheliale voorlopercellen van bloed van de navelstreng. Enkele van de toepassingen zijn het gebruik van deze cellen als een biomarker voor het identificeren van patiënten met cardiovasculaire risico, behandeling van ischemische ziekten, en creëren weefsel-engineered vasculaire en hart ventiel construeert.

Isolatie van endotheliale voorlopercellen van menselijke navelstrengbloed

We presenteren een in vitro model waarmee de studie en analyse van coagulatie in hele, niet-vertonen bloed. Antistolling in het systeem is afhankelijk van de natuurlijke anticoagulation effect van gezonde endotheliale cellen en endothelial cel activatie zal resulteren in de bloedstolling.

Beoordeling van de anticoagulatie en anti-inflammatoire eigenschappen van endotheliale cellen met behulp van 3D-celkweek en niet-vertonen volbloed

Leer hoe je bloeduitgroei endotheelcellen (BOEC) genereert uit perifeer varkensbloed voor weefselengineering en celtherapie. Dit protocol optimaliseert celviabiliteit en proliferatie.

Karakterisering van bloeduitgroei endotheelcellen (BOEC) uit perifeer bloed van varkens

Meer video's verkennen