Spatiotemporale subcellulaire manipulatie van het microtubulecytoskelet in het levende pre-implantatiemuismyo met behulp van photostatinen
30 november 2021
Typische microtubuleremmers, die veel worden gebruikt in fundamenteel en toegepast onderzoek, hebben verstrekkende effecten op cellen. Onlangs ontstonden fototatinen als een klasse van fotoschakelbare microtubuleremmers, in staat tot onmiddellijke, omkeerbare, spatiotemporaal nauwkeurige manipulatie van microtubuli. Dit stapsgewijze protocol beschrijft de toepassing van fototatinen in een 3D live pre-implantatiemuismyo.
Dit protocol is het eerste in zijn soort dat fototatinen toepast op het levende pre-implantatiemuismyo en beschouwt het gebruik van lichtschakelbare geneesmiddelen op andere 3D-fysiologische systemen. Lichtschakelbare fototatinen maken de manipulatie van microtubuligroei mogelijk, in ruimte en tijd, en worden teruggezet naar een uit-toestand. Onbedoeld blootstellen van fototatines aan blauw licht, voorafgaand aan het experiment, kan ze voortijdig activeren.
Daarom raden we aan om te allen tijde in volledige duisternis of roodlichtomstandigheden te werken bij het voorbereiden van uw monsters. In strikte donkere omstandigheden, met alleen rood licht voor verlichting, begin met het maken van voorraad en intermediaire werkoplossing van PST-1P in ultrapuur water. Zoals beschreven in het teksthandschrift.
Verdun vervolgens PST-1P in verse KSOM om de uiteindelijke concentratie van 40 M.To bereid de kamerdia voor op live beeldvorming, voeg 10 L PST-1P-behandeld kSOM toe aan het midden van een put om een hemisferische druppel te vormen. Om te voorkomen dat de druppel verdampt, dek je hem af met voldoende minerale olie. Wikkel vervolgens de bereide kweekschaal losjes in folie of plaats de kweekschaal in een niet-luchtdichte ondoorzichtige container in de incubator om ervoor te zorgen dat er geen blootstelling aan licht is.
Na het overbrengen van de embryo's in de met PST-1P behandelde KSOM-druppel, zorg ervoor dat de embryo's in het midden van de druppel worden geclusterd en op de bodem van de schaal worden neergezet. Zodra de onderdompelingsobjectieve lens is voorbereid, monteert u de kamerglaasje op de microscoop, in een omgevingskamer. Ingesteld op 37 C en 5% CO2, en in volledige duisternis, om ervoor te zorgen dat alle PST-1P's zich in de inactieve transconfiguratie bevinden en dat embryo's naar de bodem van de schaal kunnen zinken.
Gebruik een roodlichtlamp om de objectieflens in contact te brengen met het dompelmedium. Zoek vervolgens de rand van de druppel van het medium en plaats het doel er direct overheen. Met behulp van de live-scanmodus en een 561 nm-laser lokaliseer je de embryo's in de druppel.
Gebruik stagecontrollers en live-scanmodus om het begin- en eindpunt in te stellen voor het verkrijgen van een z-stack van het hele embryo. Pas de energie-instellingen van de laser aan tot een maximum van 5% op basis van uw signaal. En stel de digitale offset in op maximaal 0,900, afhankelijk van uw signaal, om het uiterlijk van de EB3-dTomato-kometen te optimaliseren.
Minimaliseer achtergrondgeluiden. Zet het gaatje op 2 m. Pixelresolutie bij 512 bij 512.
En de pixel verblijftijd op 3,15 s. En stel de zoom in op 2x. Verkrijg een z-stack van het hele embryo met intervallen van 1 m sectie om de gebieden van microtubulegroei in het hele organisme te beoordelen.
Voor EB3-dTomato komeetvolgexperimenten opent u het 3D z-stack-beeld en verhoogt u de zoom tot drie keer. En teken een rechthoekige ROI rond het specifieke subcellulaire interessegebied. Verkrijg vervolgens de timelapse-film van een enkel z-vlak, met behulp van de ingestelde parameters, met het tijdsinterval van 500 ms.
Om PST-1P te activeren, schakelt u over naar een laser van 405 nm en krijgt u nog een time-lapse, waarbij de laser is ingesteld op 10% vermogen, pinhole maximaal geopend, pixelresolutie van 512 bij 512, de pixelverblijftijd van 3,15 s, zoom van drie keer, met een tijdsinterval van 500 ms, en stel 20 frames in die moeten worden verkregen. Schakel onmiddellijk na activering terug naar 561 nm-laser en herhaal acquisitie, zoals eerder aangetoond, om het verlies van EB3-dTomato-kometen na activering van PST-1P te bevestigen. Om PST-1P nu terug te keren naar zijn inactieve transstatus, schakelt u een 514 nm-laser in en krijgt u nog een time-lapse met ingestelde parameters.
Om het herstel van EB3-dTomato-kometen te visualiseren, schakelt u terug naar 561 nm laser en herhaalt u acquisitie. In onbehandelde controle-embryo's, vóór verlichting met een 405 nm-laser, was het EB3-dTomato-signaal hoog in het gehele cytoplasma van de cel, behalve het nucleaire gebied. Na de verlichting werden geen veranderingen in het signaal gedetecteerd.
Wat aangeeft dat de 405 nm-laser geen fotoschade aan het embryo of de microtubuliynamiek heeft veroorzaakt. Tijdens PST-1P-behandeling van embryo's in het 16-celstadium, onder strikte donkere omstandigheden, werd sterke EB3-dTomato-expressie gedetecteerd in het 3D-beeld, wat aantoont dat inactieve PST-1P geen remming van microtubulepolymerisatie onder donkere omstandigheden opwekte. Vóór activering van PST-1P bevestigde de time-lapse-beeldvorming van een enkel z-vlak een sterke EB3-dTomato-expressie en microtubulepolymerisatie in een subcellulair gebied.
Na 405 nm lichtactivering werd binnen enkele seconden een vermindering van het EB3-dTomato komeetsignaal gedetecteerd. En herstel van het signaal werd bereikt bij deactivering van PST-1P, met behulp van een 514 nm laser. De embryo's micro geïnjecteerd met EB3-dTomato, en geïncubeerd met PST-1P, vertoonden een normaal embryonaal potentieel en ontwikkelden zich tot het blastocyststadium.
En normale microtubule dynamiek tijdens mitose. Indicatie van niet-toxiciteit van een actieve PST-1P voor het embryo. In de verworven time-lapse-films verscheen EB3-dTomato-etikettering als komeetachtige structuren en maakte het mogelijk om groeiende microtubule-filamenten te volgen.
In PST-1P behandelde embryo's, gehouden in donkere omstandigheden, kwamen individuele EB3-dTomato-kometen voort uit de interfasebrug, die fungeert als een niet-centrosomaal microtubuli organiserend centrum in het vroege muizenembryo. Een t-stack toont EB3-dTomato-kometen in het gebied van de interfasebrug. Na activering van PST-1P werden EB3-dTomato-kometen gereduceerd aan de basis van de interfasebrug en in de t-stack.
Vergeet niet dat wit licht PST-1P voortijdig kan activeren. Gebruik dus alleen rode lichtbronnen voor zichtbaarheid. Groen lampje deactiveert ook PST-1P, dus vermijd het gebruik van groene fluorescerende labelmarkeringen.
Deze techniek is gebruikt in drosophila, amoeben, muizen en meerdere in vitro systemen, om microtubuligroei te richten om celmigratie en weefselvorming te bestuderen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol introduceert het gebruik van fotostatines voor het manipuleren van microtubuli in levende preimplantatie-muisembryo's. Er wordt nadruk gelegd op het belang van de lichtomstandigheden tijdens de monsterbereiding om voortijdige activering van de fotostatines te voorkomen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- Microtubuli-remmers worden op grote schaal gebruikt in onderzoek.
- Fotostatines zijn een nieuwe klasse fotoschakelbare microtubuli-remmers.
- Ze maken een precieze ruimtelijke en temporele controle van de microtubuli-dynamiek mogelijk.
- Toepassing in 3D fysiologische systemen is een innovatieve benadering.
Doel van de studie
- Om fotostatines toe te passen in levende pre-implantatie muisembryo's.
- Om de manipulatie van microtubuli-groei met behulp van lichtschakelbare geneesmiddelen te onderzoeken.
- Om protocollen op te stellen voor het gebruik van fotostatines onder donkere omstandigheden.
Gebruikte methoden
- Bereiding van stock- en werkoplossingen van PST-1P in ultrapuur water.
- Uitvoeren van experimenten in volledige duisternis of onder rood licht.
- Toepassing van lichtschakelbare fotostatines om microtubuli te manipuleren.
- Monitoren van de effecten van lichtblootstelling op de activatie van fotostatine.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle manipulatie van microtubuli-dynamiek in levende embryo's.
- Aangetoond belang van lichtomstandigheden in experimenten.
- Nieuw protocol vastgesteld voor het gebruik van fotostatines in 3D-systemen.
- Inzichten verschaft in de reversibele controle van microtubuli-groei.
Conclusies
- Fotostatines zijn effectief voor de precieze manipulatie van microtubuli.
- Werken in het donker is cruciaal voor het succes van het experiment.
- Deze methode opent nieuwe wegen voor het bestuderen van de dynamiek van microtubuli in diverse biologische contexten.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Precieze spatiotemporele controle van microtubulidynamiek maakt mechanische risicoanalyse mogelijk bij vroege targetvalidatie door de bijdragen van het cytoskelet aan cellulaire fenotypen te isoleren. Deze benadering verhoogt het voorspellend vertrouwen bij fenotypische screening door reversibele, subcellulaire perturbatie mogelijk te maken zonder globale cytotoxiciteit. Toepassing in 3D fysiologische systemen, zoals embryo's, vergroot de translationele relevantie voor het verminderen van risico's bij lead-moleculen die zich richten op cytoskeletale pathways.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar microtubuli-afhankelijke mechanismen in fenotypische assays mogelijk via lichtgestuurde, reversibele inhibitie.
- Operationele waarde: Biedt een niet-toxisch, fotoschakelbaar instrument voor subcellulaire targetvalidatie in levende 3D-modellen.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt hypothesetoetsing door cytoskeletvariabelen te isoleren in complexe biologische contexten.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Vergemakkelijkt de preparatie van gestandaardiseerde, lichtgestuurde systemen voor microtubuli-perturbatie voor reproduceerbare screening van verbindingen.
- Operationele waarde: Maakt assay-gereedheid mogelijk door handling onder donkere omstandigheden en nauwkeurige parameters voor lichtactivatie.
- Schaalbaarheid: Ondersteunt hergebruik van het platform in 3D-modellen, zoals organoïden en blastoïden, voor studies naar target-engagement van het cytoskelet.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Demonstreert ziekterelatede manipulatie van het cytoskelet in zoogdierembryo's, wat de validiteit van preklinische modellen ondersteunt.
- Operationele waarde: Vestigt continuïteit van ontdekking naar preklinisch onderzoek via reversibele, niet-disruptieve modulatie van microtubuli.
- Risicobeperking: Bevestigt de niet-toxiciteit van actieve fotostatines in ontwikkelende embryo's, waardoor mechanistische ambiguïteit in veiligheidsprofielen wordt verminderd.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode kan worden geïntegreerd in discovery biology voor het testen van hypothesen over targets, maakt assayontwikkeling voor cytoskelettargets mogelijk en ondersteunt translationeel onderzoek via reversibele microtubuli-manipulatie in 3D-systemen.
- Discovery Biology: Ondersteunt mechanistische risicoreductie door nauwkeurige, reversibele analyse van microtubuli-dynamiek in levende embryo's mogelijk te maken.
- Screening: Maakt assay-standaardisatie mogelijk via gedefinieerde lichtactivatie-/deactivatieprotocollen en targeting van subcellulaire ROI's.
- Analytics: Biedt kwantitatieve read-outs via EB3-dTomato comet tracking om de polymerisatiedynamiek van microtubuli te meten.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan bij preklinische continuïteit door aangetoonde blastocystvorming en normale mitose na behandeling.
- Enterprise Reuse: Positioneert fotostatines als een herbruikbaar fotowisselbaar platform voor validatie van cytoskelet-targets in 3D fysiologische systemen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen in targetvalidatie door middel van reversibele, spatiotemporele verstoring van microtubuli.
- Operationele waarde: Standaardisatie en reproduceerbaarheid via strikte handling van lichtomstandigheden en gedefinieerde laserparameters.
- Strategische waarde: Verbeterde go/no-go beslissingen door het verminderen van off-target effecten op het cytoskelet bij fenotypische screening.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering van cytoskelet-targets met behulp van niet-toxische, reversibele modulatie in embryo-gebaseerde modellen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in confocale microscopie van levende cellen en het hanteren van photoswitchbare verbindingen.
- Vereist lasersystemen die golflengten van 405 nm (activatie), 514 nm (deactivatie) en 561 nm (imaging) ondersteunen.
- Vereist standaardisatie van lichtexpositieprotocollen tussen teams om vroegtijdige activatie van PST-1P te voorkomen.
- Omvat overwegingen voor aanpassing van EB3-dTomato-labeling of gelijkwaardige reporters voor het plus-uiteinde van microtubuli.
- Omvat praktische beperkingen, zoals het vermijden van groen licht en fluorescente labels die photostatines kunnen deactiveren.
