Visualisatie van cytoskeletafhankelijke handel in lipidenbevattende organellen in drosophila-embryo's

In het vroege Drosophila-embryo ondergaan veel organellen grootschalige beweging. Ons protocol beschrijft hoe deze beweging te monitoren met behulp van fluorescerende kleurstoffen die zijn ontwikkeld voor celkweek. In vergelijking met fluorescerende eiwitten zijn in de handel verkrijgbare fluorescerende sondes helderder en bestrijken ze een breder bereik van het spectrum.

Ze maken multiplex colabeling mogelijk en kunnen in elke genetische achtergrond worden gebruikt. Het vergt oefening en vallen en opstaan om te weten hoe lang embryo's moeten worden uitgedroogd, zodat ze tijdens de injectie barsten of opdrogen en stoppen met ontwikkelen. Begin om te beginnen met het voorbereiden van de injectienaalden door het capillair in een capillaire houder op de naaldentrekker te plaatsen en vast te zetten met vleugelmoeren.

Lijn het midden van het capillair uit met het verwarmingselement. Kies volgens de instructies van de fabrikant de juiste instellingen op de naaldtrekker. Voer met behulp van een ontleedmicroscoop de kwaliteitscontroletest uit.

Druk de naalden horizontaal in de stopverf met de naaldpunten in de lucht. Dek de naalden af met het deksel en bewaar tot gebruik. Trek met behulp van naaldlaadpunten die aan een micropipette zijn bevestigd één microliter van de injectieoplossing in de punt zonder luchtbellen op te vangen.

Houd met handschoenen de naald in één hand met de punt weg en steek de laadpunt erin. Doseer de vloeistof in de buurt van de naaldpunt, verwijder de pipet en houd de naald verticaal totdat de vloeistof naar de punt stroomt. Bedek de container met aluminiumfolie zonder de naaldpunten te beschadigen om het bleken van de kleurstoffen te voorkomen.

Plaats met behulp van een transferpipetet of een micropipetter een kleine druppel heptaanlijm in het midden van een rechthoekige afdekplaat en laat deze verdampen. Om het chorion mechanisch te verwijderen, bedekt u de juiste verouderde embryoplaat met een dunne laag halocarbonolie 27 om de eierschaal transparant te maken. Bekijk de plaat onder een dissectiemicroscoop met transverlichting om het embryostadium te bevestigen en selecteer de embryo's in splitsingsfasen.

Pak met een fijn pincet een embryo van het gewenste stadium op door de dorsale aanhangsels te grijpen en breng het over naar de voorbereide glasplaat bedekt met dubbelzijdige tape. Plaats het embryo op de tape en minimaliseer de overdracht van olie. Rol het embryo zachtjes over het oppervlak van de tape door met de zijkant van de punt van het pincet te duwen zonder het direct te porren.

Blijf het embryo rollen totdat het chorion zich aan de tape hecht en barst. Nadat het chorion barst, blijf het embryo rollen om het te scheiden van het chorion, dat aan de tape blijft kleven. Rol het embryo terug op het chorion, dat minder kleefbaar is dan de tape.

Wrijf het embryo voorzichtig in met het pincet totdat het zich aan het pincet hecht voor overdracht. Breng vervolgens het embryo terug naar de dekslip en breng het in contact met de lijm om het embryo op zijn plaats te houden en het van het pincet te scheiden. Pas de oriëntatie van het embryo op de dekenslip aan.

Laat de embryo's vijf tot 12 minuten uitdrogen door de afdekplaat met embryo's in de uitdrogingskamer te plaatsen en af te sluiten. Haal de afdekslip uit de kamer en plaats een druppel halocarbon olie 700, die de embryo's bedekt om verdere uitdroging te voorkomen. Onderzoek ze onder de ontleedbare scope en ga over tot micro-injectie als de embryo's op de juiste manier zijn uitgedroogd.

Plaats het 4X-objectief in het lichtpad en pas met behulp van de focusknop op de microscoop de embryo's scherp. Verplaats de embryo's horizontaal naar het midden van het gezichtsveld met behulp van de podiumbedieningen. Houd de embryo's aan de rand van het gezichtsveld en pan weg ter voorbereiding op het laten zakken van de naald.

Blijf bij hetzelfde brandpuntsvlak, laat de naaldpunt zakken en zorg ervoor dat deze samen met de embryo's zichtbaar is in het gezichtsveld. Controleer of de naald functioneert door een deel van de injectieoplossing in halocarbon olie 700 te doseren. Indien succesvol, zal er een bel van oplossing verschijnen in de olie in de buurt van de naaldpunt.

Gebruik de fasecontroles om het embryo naar de naaldpunt te bewegen totdat de punt het embryo voorzichtig doorboort en erin komt. Begin tegelijkertijd met de stroom van de injectieoplossing totdat er een voorbijgaande heldere plek verschijnt op de plaats van de naaldpunt, wat wijst op een succesvolle overdracht van de oplossing in het embryo. Bevestig de afdekslip op de confocale microscoop met behulp van de diahouder.

Wees voorzichtig, want de afdekzeilslip is kwetsbaar. Inspecteer de embryo's met behulp van de epifluorescentiefunctie op de confocale microscoop met een 40X-objectief en zorg ervoor dat de fluor 4 in het embryo zichtbaar is voordat u verder gaat. Voor live imaging stelt u tijdens de syncytiele fasen de afbeeldingsgrootte in van 512 bij 512 pixels, lijngemiddelde van drie en een framesnelheid van 0,1 frames per seconde.

Nadat de BODIPY 493 503-kleurstof was geïnjecteerd, werd deze gelokaliseerd op de plaats waar de naaldpunt werd ingebracht en vervolgens naast de injectieplaats verspreid. Na 24 minuten is de kleurstof voorbij het middelpunt van het embryo gediffeerd. De beweeglijkheid van het organel werd gecontroleerd door het embryo te injecteren met BODIPY 493 503 en LysoTracker Red.

De velocimetrie-analyse van het deeltjesbeeld onthulde dat de embryonale inhoud convergeerde naar het centrale gebied van het embryo, waar het cytoplasma in het binnenste van het embryo stroomt. Etikettering van de ER, met behulp van ER-Tracker Green, biedt een levendige resolutie van de nucleaire envelop, waardoor visualisatie van belangrijke celcyclusfasen mogelijk is. Het embryo werd geïnjecteerd met MitoView 633 in het blastodermstadium en vier uur later in beeld gebracht.

De afbeelding toont een neuro-ectodermale cel van een embryo in kiembandverlenging. Een cellulair opererend embryo werd geïnjecteerd met een mengsel van BODIPY 493 503 en SiR Tubulin, waaruit blijkt dat de lipidedruppeltjes bidirectioneel langs microtubuli bewegen. Het embryo moet gedeeltelijk worden uitgedroogd, zodat vloeistof kan worden geïnjecteerd.

Te weinig uitdroging zal ervoor zorgen dat het embryo lekt wanneer het wordt geïnjecteerd, te veel uitdroging zal het embryo doden. Video's van bewegende organellen kunnen worden gekarakteriseerd via diverse beeldanalysetechnieken. Deeltjestracking onthult het gedrag van individuele organellen, deeltjesbeeldvormings velocimetrie onthult de bulkstroom.