Visualisatie van cytoskeletafhankelijke handel in lipidenbevattende organellen in drosophila-embryo's
December 13th, 2021
In het vroege Drosophila-embryo zijn veel organellen beweeglijk. In principe kunnen ze live worden afgebeeld via specifieke fluorescerende sondes, maar de eierschaal voorkomt directe toepassing op het embryo. Dit protocol beschrijft hoe dergelijke sondes via micro-injectie kunnen worden geïntroduceerd en vervolgens bulk organelbeweging kan worden geanalyseerd via deeltjesbeeld velocimetrie.
In het vroege Drosophila-embryo ondergaan veel organellen grootschalige beweging. Ons protocol beschrijft hoe deze beweging te monitoren met behulp van fluorescerende kleurstoffen die zijn ontwikkeld voor celkweek. In vergelijking met fluorescerende eiwitten zijn in de handel verkrijgbare fluorescerende sondes helderder en bestrijken ze een breder bereik van het spectrum.
Ze maken multiplex colabeling mogelijk en kunnen in elke genetische achtergrond worden gebruikt. Het vergt oefening en vallen en opstaan om te weten hoe lang embryo's moeten worden uitgedroogd, zodat ze tijdens de injectie barsten of opdrogen en stoppen met ontwikkelen. Begin om te beginnen met het voorbereiden van de injectienaalden door het capillair in een capillaire houder op de naaldentrekker te plaatsen en vast te zetten met vleugelmoeren.
Lijn het midden van het capillair uit met het verwarmingselement. Kies volgens de instructies van de fabrikant de juiste instellingen op de naaldtrekker. Voer met behulp van een ontleedmicroscoop de kwaliteitscontroletest uit.
Druk de naalden horizontaal in de stopverf met de naaldpunten in de lucht. Dek de naalden af met het deksel en bewaar tot gebruik. Trek met behulp van naaldlaadpunten die aan een micropipette zijn bevestigd één microliter van de injectieoplossing in de punt zonder luchtbellen op te vangen.
Houd met handschoenen de naald in één hand met de punt weg en steek de laadpunt erin. Doseer de vloeistof in de buurt van de naaldpunt, verwijder de pipet en houd de naald verticaal totdat de vloeistof naar de punt stroomt. Bedek de container met aluminiumfolie zonder de naaldpunten te beschadigen om het bleken van de kleurstoffen te voorkomen.
Plaats met behulp van een transferpipetet of een micropipetter een kleine druppel heptaanlijm in het midden van een rechthoekige afdekplaat en laat deze verdampen. Om het chorion mechanisch te verwijderen, bedekt u de juiste verouderde embryoplaat met een dunne laag halocarbonolie 27 om de eierschaal transparant te maken. Bekijk de plaat onder een dissectiemicroscoop met transverlichting om het embryostadium te bevestigen en selecteer de embryo's in splitsingsfasen.
Pak met een fijn pincet een embryo van het gewenste stadium op door de dorsale aanhangsels te grijpen en breng het over naar de voorbereide glasplaat bedekt met dubbelzijdige tape. Plaats het embryo op de tape en minimaliseer de overdracht van olie. Rol het embryo zachtjes over het oppervlak van de tape door met de zijkant van de punt van het pincet te duwen zonder het direct te porren.
Blijf het embryo rollen totdat het chorion zich aan de tape hecht en barst. Nadat het chorion barst, blijf het embryo rollen om het te scheiden van het chorion, dat aan de tape blijft kleven. Rol het embryo terug op het chorion, dat minder kleefbaar is dan de tape.
Wrijf het embryo voorzichtig in met het pincet totdat het zich aan het pincet hecht voor overdracht. Breng vervolgens het embryo terug naar de dekslip en breng het in contact met de lijm om het embryo op zijn plaats te houden en het van het pincet te scheiden. Pas de oriëntatie van het embryo op de dekenslip aan.
Laat de embryo's vijf tot 12 minuten uitdrogen door de afdekplaat met embryo's in de uitdrogingskamer te plaatsen en af te sluiten. Haal de afdekslip uit de kamer en plaats een druppel halocarbon olie 700, die de embryo's bedekt om verdere uitdroging te voorkomen. Onderzoek ze onder de ontleedbare scope en ga over tot micro-injectie als de embryo's op de juiste manier zijn uitgedroogd.
Plaats het 4X-objectief in het lichtpad en pas met behulp van de focusknop op de microscoop de embryo's scherp. Verplaats de embryo's horizontaal naar het midden van het gezichtsveld met behulp van de podiumbedieningen. Houd de embryo's aan de rand van het gezichtsveld en pan weg ter voorbereiding op het laten zakken van de naald.
Blijf bij hetzelfde brandpuntsvlak, laat de naaldpunt zakken en zorg ervoor dat deze samen met de embryo's zichtbaar is in het gezichtsveld. Controleer of de naald functioneert door een deel van de injectieoplossing in halocarbon olie 700 te doseren. Indien succesvol, zal er een bel van oplossing verschijnen in de olie in de buurt van de naaldpunt.
Gebruik de fasecontroles om het embryo naar de naaldpunt te bewegen totdat de punt het embryo voorzichtig doorboort en erin komt. Begin tegelijkertijd met de stroom van de injectieoplossing totdat er een voorbijgaande heldere plek verschijnt op de plaats van de naaldpunt, wat wijst op een succesvolle overdracht van de oplossing in het embryo. Bevestig de afdekslip op de confocale microscoop met behulp van de diahouder.
Wees voorzichtig, want de afdekzeilslip is kwetsbaar. Inspecteer de embryo's met behulp van de epifluorescentiefunctie op de confocale microscoop met een 40X-objectief en zorg ervoor dat de fluor 4 in het embryo zichtbaar is voordat u verder gaat. Voor live imaging stelt u tijdens de syncytiele fasen de afbeeldingsgrootte in van 512 bij 512 pixels, lijngemiddelde van drie en een framesnelheid van 0,1 frames per seconde.
Nadat de BODIPY 493 503-kleurstof was geïnjecteerd, werd deze gelokaliseerd op de plaats waar de naaldpunt werd ingebracht en vervolgens naast de injectieplaats verspreid. Na 24 minuten is de kleurstof voorbij het middelpunt van het embryo gediffeerd. De beweeglijkheid van het organel werd gecontroleerd door het embryo te injecteren met BODIPY 493 503 en LysoTracker Red.
De velocimetrie-analyse van het deeltjesbeeld onthulde dat de embryonale inhoud convergeerde naar het centrale gebied van het embryo, waar het cytoplasma in het binnenste van het embryo stroomt. Etikettering van de ER, met behulp van ER-Tracker Green, biedt een levendige resolutie van de nucleaire envelop, waardoor visualisatie van belangrijke celcyclusfasen mogelijk is. Het embryo werd geïnjecteerd met MitoView 633 in het blastodermstadium en vier uur later in beeld gebracht.
De afbeelding toont een neuro-ectodermale cel van een embryo in kiembandverlenging. Een cellulair opererend embryo werd geïnjecteerd met een mengsel van BODIPY 493 503 en SiR Tubulin, waaruit blijkt dat de lipidedruppeltjes bidirectioneel langs microtubuli bewegen. Het embryo moet gedeeltelijk worden uitgedroogd, zodat vloeistof kan worden geïnjecteerd.
Te weinig uitdroging zal ervoor zorgen dat het embryo lekt wanneer het wordt geïnjecteerd, te veel uitdroging zal het embryo doden. Video's van bewegende organellen kunnen worden gekarakteriseerd via diverse beeldanalysetechnieken. Deeltjestracking onthult het gedrag van individuele organellen, deeltjesbeeldvormings velocimetrie onthult de bulkstroom.
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het monitoren van orgaanbeweging in vroege Drosophila-embryo's met behulp van fluorescente sondes. Door deze sondes via micro-injectie te introduceren, kunnen onderzoekers de dynamica van orgaantjes in levende embryo's analyseren.
Belangrijke Studie Componenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Celbiologie
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- Veel orgaantjes in vroege Drosophila-embryo's vertonen significante beweeglijkheid.
- Fluorescente sondes bieden een helderder alternatief voor fluorescente eiwitten voor beeldvorming.
- Micro-injectietechnieken zijn noodzakelijk vanwege de beschermende eischaal van het embryo.
- Juiste uitdroging van embryo's is cruciaal voor een succesvolle micro-injectie.
Doel van de Studie
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor het introduceren van fluorescente sondes in Drosophila-embryo's.
- Om de beweging van orgaantjes te analyseren met behulp van deeltjesbeeldveldmeting.
- Om de kennis van orgaantjedynamica tijdens vroege ontwikkeling te verbeteren.
Gebruikte Methoden
- Voorbereiding van injectienaalden en kwaliteitscontroletests.
- Mechanische verwijdering van het chorion van embryo's.
- Micro-injectie van fluorescente kleurstoffen in embryo's.
- Levende beeldvorming en analyse van orgaantjebeweging met behulp van confocale microscopie.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle injectie van fluorescente sondes maakte visualisatie van orgaantjebeweging mogelijk.
- Deeltjesbeeldveldmeting onthulde convergerende cytoplasmatische stromingen binnen het embryo.
- Fluorescente markering gaf inzicht in de dynamica van orgaantjes zoals lipidedruppeltjes en het endoplasmatisch reticulum.
- De uitdrogingstijd was cruciaal voor het behoud van embryoviabiliteit tijdens injectie.
Conclusies
- Het protocol maakt een gedetailleerd onderzoek van orgaantjedynamica in levende Drosophila-embryo's mogelijk.
- Fluorescente sondes verbeteren de visualisatie van cellulaire processen.
- Kennis van orgaantjebeweging draagt bij aan bredere inzichten in ontwikkelingsbiologie.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Visualizing lipid-containing organelle trafficking in early Drosophila embryos provides a genetically unconstrained system for studying intracellular transport mechanisms relevant to neurodegenerative and metabolic disease models. The use of commercially available fluorescent dyes enables multiplexed, high-signal imaging without reliance on transgenic expression, supporting scalable assay development in discovery biology. This approach facilitates mechanistic de-risking of targets involved in lipid metabolism, organelle positioning, and cytoskeletal regulation by providing quantitative readouts of motility and subcellular localization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of lipid droplet and organelle dynamics to validate targets in lipid storage and trafficking pathways.
- Operational Value: Supports phenotypic screening in any genetic background using vital dyes, bypassing need for transgenic lines.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Multiplex co-labeling of organelles and cytoskeletal elements allows simultaneous readouts of trafficking and structural integrity.
- Operational Value: Commercially available dyes span violet/blue to far-red spectrum, enabling high-throughput imaging with minimal bleed-through.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant system to study organelle motility defects linked to neurodegeneration and metabolic disorders.
- Operational Value: Live imaging with particle image velocimetry and tracking yields quantitative, reproducible motility parameters for lead optimization.
Pipeline & Workflow Integration
The method supports discovery biology through direct visualization of organelle dynamics, informing target validation and pathway analysis prior to lead identification.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of cytoskeletal regulators and motor proteins via direct observation of lipid droplet and ER trafficking.
- Screening: Facilitates assay readiness through standardized dye injection and live imaging protocols applicable across genotypes.
- Analytics: Particle image velocimetry and tracking deliver quantitative flux and velocity metrics to compare experimental conditions.
- Translational Research: Links organelle motility phenotypes to developmental continuity, supporting biomarker alignment in disease models.
- Enterprise Reuse: Protocol is adaptable to lysosomes, mitochondria, and yolk vesicles, enabling platform reuse across multiple target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by reducing ambiguity in organelle behavior and cytoskeletal dependence.
- Operational Value: Standardized microinjection and imaging workflow ensures reproducibility across labs and genetic backgrounds.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by revealing mechanistic links between targets and subcellular logistics.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds affecting lipid trafficking or organelle positioning.
Implementation Considerations
- Expertise in Drosophila embryo handling and microinjection technique.
- Confocal microscopy with spectral separation for multiplex dye detection.
- Standardized desiccation protocol to balance embryo permeability and viability.
- Access to vital dyes such as BODIPY, LysoTracker, ER-Tracker, and MitoView.
- Optimization of injection volume and timing to avoid leakage or toxicity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:40
Injection Needle Preparation
1:26
Injection Solution Preparation and Needle Loading
2:08
Embryo Preparation for Microinjection
4:34
Microinjecting Embryos
5:51
Imaging Embryos
6:38
Results: Representative Results for Organelle Dependent Trafficking in Drosophila Embryos
8:14
Conclusion
